張曉東，李雅舒，陳 金，莫 莉，包玉英

(1.內蒙古大學 生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010071; 2.內蒙古大學 省部共建草原家畜生殖調控與繁殖國家重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010071; 3.內蒙古大學 牧草與特色作物生物技術教育部重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010071; 4.內蒙古大學生態(tài)與環(huán)境學院，內蒙古 呼和浩特 010021)

近幾十年以來，我國露天煤礦發(fā)展迅速，占全國煤炭產(chǎn)量的比重逐漸增加，主要分布在山西以及內蒙古草原地區(qū)，露天煤礦正在向高度集中化、集約化方向發(fā)展[1]。由于煤炭露天開采導致地表剝離嚴重、地下水位下降[2]、產(chǎn)生大量粉塵及有害氣體[3]，嚴重影響地下水、大氣、動植物的多樣性及穩(wěn)定性，加速草原地區(qū)的鹽堿化和沙漠化，進而影響居民健康生活和正?；顒印?/p>

重金屬通常情況下主要以穩(wěn)定的狀態(tài)存在于生態(tài)環(huán)境中，但是由于礦山開采，金屬冶煉，存在于土壤中的重金屬被剝離到地表，隨著大氣、水流進入到土壤及水環(huán)境中[4-6]，礦區(qū)附近的重金屬污染非常嚴重，已經(jīng)嚴重危害到附近居民飲食和生活健康，是我國面臨重金屬污染治理的巨大挑戰(zhàn)和難題。

目前對露天煤礦環(huán)境治理及生態(tài)修復的研究多集中于不同復墾模式的修復效應[7]和排土場綠化[8]，對微生物修復少有報道。趙旭鵬等[9]對礦區(qū)土壤微生物多樣性的研究顯示，開采早期區(qū)域的生物多樣性較開采晚期區(qū)域的低，可見露天開采影響土壤微生物的多樣性。在重金屬的脅迫下[10-14]，耐受力弱的微生物會迅速減少或滅亡。耐受力強的微生物可以正常存活，微生物不會降解重金屬，但是可以富集[15-18]或轉移重金屬，達到改良土壤的目的。CHON等[19]研究發(fā)現(xiàn)微生物在自然條件下，通過提供適當?shù)奶荚?，在土壤水或地下水運輸?shù)倪^程中，會在固體表面形成生物膜可以有效地吸附重金屬，特別是帶正電荷的重金屬;對于砷等氧化還原敏感的元素，微生物還原三價鐵或硫酸鹽以及硫化物形成的沉淀可大大降低有毒元素的遷移率。研究表明，植物和微生物均對重金屬具有富集或遷移作用。

耐重金屬細菌由于對重金屬具有交叉抗性[20]，以及對重金屬有不同的耐受程度，需要對細菌進行整體的篩選以及嘗試不同重金屬濃度梯度的檢測，以確保數(shù)據(jù)的真實性和準確性。

本研究以寶日希勒露天煤礦區(qū)土壤為研究對象，采用高溫高壓滅菌法和過膜除菌方法相結合的方法，確保重金屬溶液結構不被破壞的前提下，在前人研究[21-24]的基礎上利用二價鐵、二價錳、二價銅、六價鉻對細菌進行分離，最終篩選出優(yōu)良耐重金屬細菌，并對細菌進行耐受力檢測以及鑒定，對優(yōu)良菌株進行保藏，為礦區(qū)未來的土地復墾和生態(tài)修復提供重要的理論依據(jù)和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

寶日希勒露天礦地處呼倫貝爾草原中部，距離呼倫貝爾市中心海拉爾區(qū)15 km。礦區(qū)坐標為東經(jīng)119.399°～119.606°，北緯49.323°～49.425°。該地區(qū)屬于亞寒帶大陸性半干旱氣候區(qū)，年平均氣溫在-2.6 ℃，年最低溫度-48 ℃，年最高溫度37.7 ℃，冬季寒冷漫長，夏季涼爽干旱[25]。

1.2 樣地選擇及樣品采集

選取寶日希勒露天礦外草原區(qū)為樣區(qū)，設置采樣點。寶日希勒露天礦的開采推進方向為由西向東，隨著采挖擴大和推進，礦坑和排土場面積逐漸擴大。礦坑南面受其他因素(道路交通等)干擾嚴重，而礦坑北面為自然放牧地，受其他因素的擾動較少。因此，本研究選擇礦坑北面作為研究區(qū)，距離礦坑外圍300 m的位置取1條線，從西向東分別設置3個采樣點:A(礦坑最西側，最先開采)，B，C(目前正在開采)。同時取2處參照區(qū)，1處為距離露天礦20 km的陳巴爾虎旗檢測場(國家級草原固定檢測點)，此處是天然草原群落，不受人為和生產(chǎn)活動的干擾，記為W。另1處采樣點位于礦區(qū)內尚未復墾的排土場，記為K。

在A，B，C，W，K五個樣地，每個樣地分別取3個1 m×1 m的樣方，取0～10 cm土壤各2 kg置于無菌塑封袋中，將每個樣地的3份土壤進行混勻，土樣在實驗室條件下過篩(2 mm)處理，放于4 ℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 篩選方法

將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進行滅菌，冷卻至60 ℃，加入過膜除菌后的重金屬溶液，倒入平板凝固，制成200 mg/L的Cu2+,Fe2+,Mn2+,Cr6+離子質量濃度為200 mg/L的重金屬培養(yǎng)基，將懸菌液進行涂板，24 h后觀察。

挑取重金屬培養(yǎng)基上的單菌落，置于重金屬質量濃度為400 mg/L的培養(yǎng)基中，24 h后觀察，以此類推，直到每種重金屬培養(yǎng)基只長出1種菌落為止，即為最高耐受菌株。

1.4 菌株生理生化能力檢測

將篩選出的菌株進行碳源利用實驗、氮源利用試驗、淀粉水解試驗、酪氨酸水解試驗、酪蛋白水解試驗、V-P試驗和糖發(fā)酵試驗。

將篩選出對4種重金屬耐受力最強的細菌進行生長曲線的測定，配置質量濃度為0，100，200，300 mg/L的重金屬液體培養(yǎng)基，每個濃度設置12個重復，將提前搖好的細菌懸濁液取100 μL進行接種，分別在0，2,4，6，8，10，12，14，16，18，20 h取樣測OD值(600 nm波長)，繪制細菌的生長曲線。

1.5 菌株的鑒定

菌株采用16s rDNA分子生物學鑒定:挑取單菌落于1.5 mL離心管中，加入細菌通用引物27F(5′—AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG—3′)1 μL，1492R(5′—TACGG CTACC TTACG ACTT—3′)1 μL，加入25 μL 2xTaq PCR Master Mix，23 μL DDH2O，構建50 μL的PCR反應體系，反映條件為高溫預變性94 ℃，10 min，變性94 ℃、30 s，退火55 ℃、40 s，延伸72 ℃、1 min，35次循環(huán)，后延伸72 ℃、3 min，最后4 ℃永久恒溫。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，20 min后進行凝膠成像分析，觀察到條帶后將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司進行測序。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和初步分析;采用IBM SPSS Statistics 20軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，再采用字母標記法，根據(jù) Duncan 多重比較法進行實驗數(shù)據(jù)差異度標記;采用graphpad prism8軟件進行圖形的制作與處理(所有圖片中的誤差線均為重復之間的最高值和最低值);采用MEGA7進行進化樹的構建。

2 結果與分析

2.1 篩選結果

土壤耐重金屬銅、鐵、錳、鉻的細菌共篩到16株(表1)，其中耐重金屬銅共篩到3株，耐重金屬鐵共篩到3株，耐重金屬錳共篩到9株，耐重金屬鉻共篩到1株。其中3株耐重金屬銅的細菌中，有1株的最高耐重金屬的質量濃度達到500 mg/L;在3株耐重金屬鐵的細菌中，有1株的最高耐重金屬質量濃度達到500 mg/L;在1株耐重金屬鉻的細菌的最高耐重金屬質量濃度達到200 mg/L。在9株耐重金屬錳的細菌中，其中1株的耐重金屬質量濃度達到50 g/L，由于重金屬質量濃度已到達過膜除菌方法的最大溶解度，這株菌在更高濃度中可能會生長，可能為1種新型的耐重金屬錳的菌株。

表1 細菌生理生化反應
Table 1 Physiological and biochemical reactions of bacteria

生理生化反應XCu-1XFe-1XMn-1XCr-1蔗糖碳源+---淀粉碳源++++甘油碳源+---葡萄糖碳源++++(NH4)2SO4氮源+-++KNO3氮源+---淀粉水解試驗++++酪蛋白水解試驗++++酪氨酸水解試驗----V-P試驗++++D-葡萄糖產(chǎn)酸試驗++++D-葡萄糖產(chǎn)氣試驗----D-木糖產(chǎn)酸試驗----D-甘露糖產(chǎn)酸試驗++++L-阿拉伯糖產(chǎn)酸試驗----

注:“+”表示陽性，“-”表示陰性。

2.2 菌株生理生化能力檢測

4種耐受菌株對不同碳源利用、不同氮源利用、淀粉水解、酪氨酸水解、酪蛋白水解、V-P試驗、糖發(fā)酵特性試驗結果見表1。

耐重金屬鐵菌株XFe-1生長曲線如圖1所示。在前10 h的培養(yǎng)中細菌處于延緩期，10～16 h處于對數(shù)期，16 h后到達穩(wěn)定期。0 mg/L的細菌生長曲線的斜率大于100，200，300 mg/L的細菌生長曲線，說明重金屬Fe2+的加入會抑制細菌的生長，隨著Fe2+質量濃度的增大，細菌的受抑制會更明顯。并且重金屬Fe2+增加到200 mg/L以上時，細菌的受抑制作用相當明顯，當質量濃度達到300 mg/L時，可以看到細菌的質量濃度達不到未污染培養(yǎng)基的一半，可見重金屬Fe2+質量濃度對細菌的毒性呈對數(shù)增長。

圖1 耐重金屬鐵質量濃度梯度細菌生長曲線Fig.1 Fe2+concentration gradient growth curves

耐重金屬銅菌株XCu-1生長曲線如圖2所示。在重金屬Cu2+的脅迫作用下，0～4 h細菌處于延緩期，細菌狀態(tài)比較穩(wěn)定，在4～16 h，細菌的數(shù)量成倍的增加，細菌處于對數(shù)期，在16 h之后，細菌的數(shù)量達到峰值，并且會逐漸減少。由圖2可見，當重金屬Cu2+的質量濃度為100 mg/L時，細菌的質量濃度比0 mg/L的細菌質量濃度高，并且當Cu2+質量濃度達到200 mg/L的時候，細菌的質量濃度甚至比100 mg/L的質量濃度還要高，但是當Cu2+質量濃度達到300 mg/L時細菌的質量濃度會比之前3個污染梯度低，因此可以斷定，重金屬Cu2+質量濃度在200 mg/L以內時，重金屬Cu2+對細菌的生長起促進作用，細菌質量濃度與重金屬Cu2+質量濃度呈正相關，這可能是由于低質量濃度銅下，細菌可以吸附銅離子作為自身的生長因子，但是當重金屬Cu2+質量濃度高于200 mg/L時，重金屬的毒性超出了細菌耐受的毒性，因此細菌的質量濃度會逐漸降低，細菌質量濃度與重金屬Cu2+質量濃度成反比。

圖2 耐重金屬銅質量濃度梯度細菌生長曲線Fig.2 Cu2+ concentration gradient growth curves

耐重金屬鉻細菌XCr-1生長曲線如圖3所示。在前8 h內，細菌處于延緩期，在8～16 h內細菌迅速增長，處于對數(shù)期，在20 h后細菌數(shù)量基本處于平穩(wěn)狀態(tài)，細菌進入穩(wěn)定期，隨著重金屬Cr6+質量濃度的升高細菌的生長受到抑制，細菌可能受重金屬毒性的影響，Cr6+質量濃度越大，細菌的數(shù)量越少，且增長緩慢。

圖3 耐重金屬鉻質量濃度梯度細菌生長曲線Fig.3 Cr6+ concentration gradient growth curves

耐重金屬錳菌株XMn-1的生長曲線如圖4所示。在0～4 h內，細菌的質量濃度緩慢升高，細菌處于延緩期，細菌在4～16 h細菌的數(shù)量迅速增多，細菌處于對數(shù)期，在20 h之后細菌的數(shù)量會有所下降，細菌處于衰亡期。在重金屬錳離子的脅迫下，并不是錳離子質量濃度越高細菌生長受到抑制，在100 mg/L的錳離子培養(yǎng)液中，細菌的生長反而比0 mg/L的細菌生長狀態(tài)要好，因此可以斷定，當Mn2+質量濃度為0～100 mg/L時，細菌的質量濃度會隨著錳離子質量濃度的增大而增大，錳離子對細菌的增殖起到了促進作用。當Mn2+質量濃度達到200 mg/L時，細菌的生長曲線斜率小于0 mg/L的培養(yǎng)液的細菌，可見重金屬錳離子的質量濃度達到200 mg/L時，細菌的生長就會受到抑制，且Mn2+質量濃度越大抑制作用越明顯。綜上，該菌株在Mn2+質量濃度為100 mg/L時，會促進細菌的增殖，當Mn2+質量濃度高于200 mg/L時，會抑制細菌的增殖。

圖4 耐重金屬錳質量濃度梯度細菌生長曲線Fig.4 Mn2+ concentration gradient growth curves

2.3 菌株的鑒定

將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，20 min后進行凝膠成像分析(圖5)，擴增片段大小約在1 500 bp，條帶清晰。

圖5 細菌DNA電泳Fig.5 Bacterial DNA electrophoresis

耐重金屬細菌16s rDNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的對比序列相似度均在99%以上(除XMn-1菌株以外，相似度僅為85.37%)，序列的分析結果見表2。4種細菌分別為蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillustoyonensis)，XMn-1與巨大芽孢桿菌基因序列相似度為85.37%，屬芽孢桿菌屬，可能為新種。

表2 耐重金屬細菌16s rDNA基因序列分析結果
Table 2 Sequence analysis of heavy metal resistantbacteria 16s rDNA

菌株編號拉丁名中文名GenBank登錄號相似度/%XCu-1Bacillus cereus蠟樣芽胞桿菌EU857430.198.29XFe-1Bacillus toyonensis蠟狀芽孢桿菌KY393017.198.00XCr-1Brevibacterium sp.短桿菌屬MG309358.198.95XMn-1Bacillus 芽孢桿菌屬 GU188935.185.37

利用MEGA 7軟件，將4株耐重金屬菌株的16s rDNA基因序列采用Neighbor-Joining構建系統(tǒng)進化樹，。選取GenBank對比序列相似度高于98%的兩個菌株序列，根據(jù)分子生物學原理，序列相似度高于96%就可以認為是同一個種(圖6)。

圖6 耐重金屬細菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic trees of bacteria resistant to heavy metals

耐重金屬細菌分子鑒定結果顯示，耐重金屬細菌XCu-1為蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)，劉海燕[26]研究發(fā)現(xiàn)從廢棄重金屬水中分離出的耐重金屬銅細菌也包括芽孢桿菌，與本研究結果基本一致，芽孢桿菌具有耐銅特性。董新姣[27]從電鍍廠廢水污泥中分離到一株高耐銅的菌株，它能耐受Cu2+的最高質量濃度為560 mg/L,通過形態(tài)學觀察及生理生化特性測定，初步鑒定為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，由此可知，除芽孢桿菌外，假單胞菌也具有耐銅特性。XCr-1屬于短桿菌屬(Brevibacterium)，此前舒彩云[28]、石青[29]研究發(fā)現(xiàn)短桿菌具有耐鹽、耐寒等特性，關于耐重金屬性還未有報道，可見短桿菌屬是一種具有多種抗逆性菌株。XFe-1為蠟狀芽孢桿菌(Bacillustoyonensis)，周明[30]研究發(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌為一種石油降解菌，可以有效的降解石油原油。石油中含有大量重金屬，微生物石油污染修復具有高效、無二次污染和經(jīng)濟的特點，受到研究者的高度重視[31]，因此菌株也可用降解石油中的重金屬，石油中含有大量重金屬鐵，蠟狀芽孢桿菌對石油中的重金屬鐵可能具有降解作用，這與本文的研究結果相似。

XMn-1菌株經(jīng)過NCBI基因序列比對，與最高相似度的巨大芽孢桿菌僅為85.37%，為未知種。

本研究篩選出的細菌為耐受性細菌，但是否對重金屬具有富集作用或者遷移作用還未曾考證，有待進一步設計實驗。

本研究篩選出4株耐受重金屬鐵、錳、銅、鉻細菌，對這些來源于礦區(qū)土壤的能在一定的重金屬污染環(huán)境下生存的細菌菌株，進一步擴大培養(yǎng)并開展應用研究，可為改善礦區(qū)土壤重金屬污染提供菌種資源和理論依據(jù)。

3 結 語

從寶日希勒礦區(qū)土壤中獲得了4株耐4種重金屬細菌菌株;其中3株為芽孢桿菌屬，分別為蠟樣芽胞桿菌，蠟狀芽孢桿菌，和1株與巨大芽孢桿菌最高相似度僅為85.37%的極耐錳菌株，該菌株為未知種，另外1株為短桿菌屬細菌。篩選到的菌株對重金屬具有一定的耐受力，為未來礦區(qū)土地復墾和微生物生態(tài)修復提供理論依據(jù)和菌種資源。