周建明，曹志林

(四川省樂山市人民醫(yī)院輸血科，四川 樂山 614000)

直接抗人球蛋白試驗(DAT)主要對人體紅細胞表面中IgG、補體C3等不完全抗體檢測，抗人球蛋白與不完全抗體結(jié)合時，造成紅細胞聚集，此時判斷為DAT陽性[1]。DAT陽性患者血清中能檢測到自身抗體，輸血時若自身紅細胞被吸附，或存在致敏特性，則會造成血型鑒定異常，正反定型不符，促使交叉配血凝聚[2，3]，是導(dǎo)致交叉配血不合的重要因素。臨床上RhD血型鑒定、交叉配血試驗等被認為是保證輸血安全的重要前提[4，5]。由于DAT檢測溶血性疾病患者自身抗體在基層醫(yī)院中比較少見，易造成新生兒溶血癥漏診，耽誤治療時機。為此構(gòu)建并推廣DAT檢測及血清學(xué)特性檢測方法至關(guān)重要。本研究探討DAT陽性患者血型鑒定、交叉配血試驗結(jié)果，為臨床患者安全輸血提供解決思路。

1 對象與方法

1.1研究對象2017年6月至2018年6月我院確診的DAT陽性患者54例，經(jīng)血常規(guī)等相關(guān)檢查診斷為自身免疫性溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia，AIHA)，相關(guān)資料完整。男20例，女34例；年齡14～78歲[(47.69±7.54)歲]；其中原發(fā)性AIHA 23例，繼發(fā)性AIHA 31例(惡性腫瘤11例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡9例，慢性淋巴細胞白血病6例，淋巴瘤5例)。

1.2方法

1.2.1DAT 新鮮血液標(biāo)本經(jīng)壓積配置為1%紅細胞，備用。解開抗人球蛋白反應(yīng)卡，取備用紅細胞懸液50 μl注到反應(yīng)卡微柱管中，配套離心機上離心10 min，結(jié)果觀察。紅細胞滯留于凝膠上端或中上部時判斷為DAT陽性，且根據(jù)紅細胞滯留部位、凝膠背景情況進一步分為4+、3+、2+、1+、W+共5個等級；若紅細胞徹底沉到凝膠介質(zhì)底部時判斷為ADT陰性。

1.2.2交叉配血試驗 凝聚胺交叉配血，試劑選用合肥天一生物技術(shù)研究所的產(chǎn)品，操作如下：先離心血液標(biāo)本，將生理鹽水與紅細胞混合配制成1 ml紅細胞懸液(3%～5%)，共2份；準(zhǔn)備好2支有標(biāo)記(主側(cè)、次側(cè))的試管，將受血者2滴血清(漿)、供血者1滴3%～5%紅細胞懸液加入主側(cè)試管；受血者1滴3%～5%紅細胞懸液、供血者2滴血清(漿)加入次側(cè)試管；于試管中加入0.65 ml低離子介質(zhì)溶液，混合均勻后靜置1 min；隨后加入2滴凝聚胺溶液，混合均勻后靜置15 s，離心，速率為每分鐘3400 rpm，共10 s；舍棄上清液，保持管底留有0.1 ml左右液體，輕搖試管，觀察紅細胞有無凝塊，若沒有則需重新操作，直到凝集現(xiàn)象出現(xiàn)停止；然后將2滴重懸液加入管中，輕輕搖動試管混合并同時觀察結(jié)果，若凝集現(xiàn)象于1 min內(nèi)散開，提示該凝集現(xiàn)象是由凝聚胺引起的非特異性凝集，配血結(jié)果相合；若1 min內(nèi)不散開，則為紅細胞抗原抗體結(jié)合的特異性反應(yīng)，配血結(jié)果不相合。另外，對疑難交叉配血行冷抗體吸收試驗、乙醚放散試驗或自身抗體吸收試驗等，以指導(dǎo)交叉配血。

2 結(jié)果

2.1DAT陽性凝集情況54例AIHA患者DAT均陽性，W+(弱凝集)17例(31.48%)，1+16例(29.53%)，2+ 20例(37.04%)，3+ 1例(1.85%)。

2.2血型鑒定54例DAT陽性患者中發(fā)生ABO血型正反定型不符43例(79.63%)，觀察到患者自身紅細胞、血清凝集33例(61.11%)，提示患者紅細胞內(nèi)有自身抗體，需深入分析。先冷抗體吸收試驗，再開展乙醚放散試驗，最終確定血型：A Rh陽性13例(30.23%，13/43)，B Rh陽性12例(27.91%，12/43)，O Rh陽性9例(20.93%，9/43)，AB Rh陽性9例(20.93%，9/43)。

2.3交叉配血檢測結(jié)果54例DAT陽性患者中顯示配血不合44例(81.48%)，其中主、次側(cè)均顯示陽性反應(yīng)22例(50.00%，22/44)，主側(cè)陽性反應(yīng)、次側(cè)陰性反應(yīng)14例(31.82%，14/44)，主側(cè)陰性反應(yīng)、次側(cè)陽性反應(yīng)8例(18.18%，8/44)。因冷抗體因素造成配血不合17例(38.64%，17/44)，因冷凝集素效價1∶256以上造成配血不合8例(18.18%，8/44)，因冷凝集素效價1∶128造成配血不合19例(43.18%，19/44)。

2.4交叉配血不合處理結(jié)果對44例交叉配血不合患者行冷抗體吸收試驗、乙醚放散試驗、自身抗體吸收試驗，最終發(fā)現(xiàn)交叉配血相合36例(81.82%，36/44)，仍存在交叉配血不合8例(18.18%)。

3 討論

DAT在鑒別診斷溶血性貧血，指導(dǎo)輸血上有重要作用[6]，其中DAT主要對原發(fā)性AIHA、溶血癥等疾病診斷提供依據(jù)。DAT陽性指的是患者紅細胞表面存在不完全抗體或補體，其原因包括[7，8]：①紅細胞上的自身抗體影響；②接受輸血的對象血液內(nèi)存在同種抗體，和獻血對象紅細胞上抗原產(chǎn)生反應(yīng)；③獻血對象血漿與紅細胞制品等之間存在同種抗體，和接受輸血的對象紅細胞抗原產(chǎn)生反應(yīng)；④母親血液內(nèi)同種抗體經(jīng)由胎盤附著于胎兒紅細胞膜；⑤高球蛋白血癥等非特異性吸附蛋白于紅細胞表面包被；⑥補體將自身抗體、同種抗體等激活，促其于紅細胞表面附著。本研究以54例AIHA、DAT陽性患者為研究對象，結(jié)果顯示DAT陽性凝集強度以中弱凝集為主，W+至2+占98.15%，與相關(guān)報道結(jié)果一致[9，10]。

有研究顯示DAT陽性患者體內(nèi)有自身抗體，易造成自身紅細胞致敏，對紅細胞吸附，促使抗紅細胞抗體產(chǎn)生[11]。一旦DAT陽性患者進行輸血時，因為自身抗體對患者本身、他人紅細胞有不同程度的凝集作用，致使ABO、Rh疑難血型鑒定難度大，同時也會影響交叉配血試驗難度，特別是部分患者存在同種抗體，增加交叉配血難度。本研究54例DAT陽性患者中發(fā)生ABO血型正反定型不符43例，不符率79.63%，自身紅細胞、血清凝集率61.11%，可見患者多存在自身抗體。自身抗體有冷抗體與溫抗體之分，前者多在人體血清中分布，以IgM型常見，效價比較低。一旦感染、冷凝集綜合征等出現(xiàn)，患者血清冷抗體效價便會上升，常溫條件患者自身冷抗體也能和自身紅細胞反應(yīng)，影響血型鑒定及交叉配血。后者通常在AIHA患者中呈現(xiàn)強致敏性，影響交叉配血。本研究對43例患者先行冷抗體吸收試驗，后行磷酸氯喹放散試驗，最終對血型確定。

目前臨床用于交叉配血試驗的方法主要包括凝聚胺法、抗人球蛋白微柱凝膠法等，其中凝聚胺法在臨床(尤其是急診配血中)使用時間較長，操作簡單且檢測結(jié)果快，凝聚胺(高價陽離子多聚物)溶解后可釋放較多的正電荷，與紅細胞表面負電荷發(fā)生中和反應(yīng)，以減少紅細胞間距，進而使正常紅細胞之間發(fā)生非特異性凝集，并使IgG型抗體直接凝集紅細胞[12]。加入中和液后，僅由凝聚胺引起的非特異性聚集，會因電荷中和而分散，而由抗體介導(dǎo)的特異性凝集則不會散開[13]。若100%的紅細胞沉在微管的底部則判斷結(jié)果為陰性，提示受血者與供血者配血相合。本研究結(jié)果顯示交叉配血不合44例，不合率81.48%，其中主、次側(cè)均陽性反應(yīng)占50.00%，單純主側(cè)陽性反應(yīng)占31.82%，單純次側(cè)陽性反應(yīng)占18.18%。臨床上針對主、次側(cè)均陽性反應(yīng)，需對患者紅細胞洗滌3次，之后行冷抗體吸收試驗，對患者自身抗體解離，之后接受不規(guī)則抗體檢測與主側(cè)配血處理，同時對乙醚放散試驗后的紅細胞和獻血人員血漿行次側(cè)交叉配血；對主側(cè)陽性反應(yīng)、次側(cè)陰性反應(yīng)，提示患者血清有同種抗體，對此通過紅細胞(被乙醚放散試驗處理后)吸收患者血清自身抗體，被吸收后的血清行交叉配血試驗；針對主側(cè)陰性、次側(cè)陽性，提示患者紅細胞有自身抗體，致敏性強或被吸附，對乙醚放散試驗后的紅細胞行次側(cè)配血試驗。對冷抗體因素、冷凝集素效價異常上升患者來說，先溫鹽水洗滌紅細胞，行自身抗體吸收試驗，之后根據(jù)情況行冷抗體吸收試驗、乙醚放散試驗。經(jīng)處理后，最終顯示交叉配血相合率81.82%。凝聚胺技術(shù)在交叉配血中雖然具有快速檢出IgG抗體的能力，但近年來臨床實踐發(fā)現(xiàn)，凝聚胺試劑對效價較低的特異性Rh抗體有漏檢的情況[14]。不同交叉配血試驗方法結(jié)果不一，關(guān)于這一點有待日后通過大樣本數(shù)據(jù)進一步分析。

綜上，DAT陽性患者血型鑒定及交叉配血試驗難度大，通過冷抗體吸收試驗、乙醚放散試驗或自身抗體吸收試驗等合理應(yīng)用，有利于血型鑒定及交叉配血進行，為輸血提供準(zhǔn)確結(jié)果，保證患者輸血安全。