陳竹 王維斯 韋一鳴 王雪巖 任坤雨 胡琪 余才濤 李順 呂樵嵐 陳勇

結(jié)核病(Tuberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)感染引起的一種世界性傳染病?？ń槊?BCG)接種仍是預(yù)防TB 的主要手段，但卡介苗對(duì)成人免疫保護(hù)效率具有一定的不確定性。近年來(lái)隨著M.tb耐藥株流行，以及HIV合并感染者增多等原因，使得全球抗癆形勢(shì)日益嚴(yán)峻[1]。研究M.tb蛋白抗原的免疫學(xué)特性對(duì)于闡明結(jié)核病的致病機(jī)制，以及開(kāi)發(fā)有效的新型疫苗和免疫學(xué)診斷試劑具有極其重要的意義。M.tb可大量合成表達(dá)多種熱休克蛋白，已有研究表明，某些M.tb熱休克蛋白(如HSP65、HSP70)本身既可發(fā)揮增強(qiáng)免疫應(yīng)答的作用，又可保持分枝桿菌的特異性抗原特性[2,3]。M.tbRv2299c分子又稱為HtpG，屬于熱休克蛋白HSP90家族的成員。最近Han-Gyu Choi等[4]發(fā)現(xiàn)M.tbHtpG蛋白可顯著誘導(dǎo)人樹(shù)突狀細(xì)胞(DC細(xì)胞)活化。本研究對(duì)M.tbHtpG基因進(jìn)行克隆，并在大腸埃希菌中進(jìn)行表達(dá)，為進(jìn)一步深入研究其免疫學(xué)特性，以及將其應(yīng)用于結(jié)核病免疫診斷試劑的研制奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

1.菌種、試劑和設(shè)備：M.tbH37Ra株購(gòu)于中國(guó)生物制品檢定所。pET22b質(zhì)粒購(gòu)于美國(guó)Novagen公司，大腸埃希菌DH5a和BL21(DE3)為本室保存。EcoR I和Hind III購(gòu)于日本Takara公司，pfu DNA聚合酶購(gòu)于上海生工公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)于美國(guó)Axygen公司。Ni-NTA親和層析柱購(gòu)于美國(guó)GE公司。HRP-羊抗人IgG購(gòu)于武漢博士德公司。DAB底物試劑盒購(gòu)于北京天根公司。25例肺結(jié)核患者血清，其中男18例，女7例，年齡16～65歲，平均(40.5±20.3)歲，所有患者均符合《肺結(jié)核診斷和治療指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，均具有細(xì)菌學(xué)或病理學(xué)診斷陽(yáng)性證據(jù)[5]。25例正常健康者血清，其中男16例，女9例，年齡18～50歲，平均(35.2±10.5)歲,為影像學(xué)正常及近期無(wú)接觸結(jié)核病史的正常體檢者。

2.引物設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)GeneBank網(wǎng)站公布的M.tb基因HtpG(Gene ID：887501)上下游序列而設(shè)計(jì)PCR引物。上游引物P1：5′-CCGGAATTCATGAACGCCCATGTCGAGCA-3′，內(nèi)含EcoR I酶切位點(diǎn)(下劃?rùn)M線)；下游引物P2：5′-CCCAAGCTTCAAGGTACGCGCGAGACG-3′，內(nèi)含Hind III酶切位點(diǎn)(下劃?rùn)M線)。上述引物均由上海生工生物工程公司合成。

二、方法

1.M.tbH37Ra基因組DNA的提取：將M.tbH37Ra菌株接種于蘇通培養(yǎng)基中，于37℃靜置培養(yǎng)3～4周，經(jīng)4 000 r/min離心10 min收獲菌體，參照文獻(xiàn)[6]的方法提取M.tb基因組DNA。

2.HtpG基因的擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增體系為 pfu DNA聚合酶 1μL，dNTPs 4 μL(2.5 mmol/L)，10×buffer 5μL，上、下游引物各1μL，模板DNA 1μL，加水至50μL。PCR擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，63.9℃復(fù)性1 min，72℃延伸1.5 min，循環(huán)30次，72℃延伸10 min。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒提取目的片段。

3.重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定：將回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pET22b質(zhì)粒分別采用EcoR I、Hind III雙酶切消化，使用膠回收試劑盒回收相應(yīng)的DNA片段，將回收的HtpG與pET22b在T4 DNA連接酶的作用下，16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a。挑取單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，通過(guò)小量提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定。同時(shí)對(duì)篩選到的陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序由南京金斯瑞生物工程公司完成。

4.HtpG重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：將陽(yáng)性克隆子轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)，挑取構(gòu)建好的工程菌單菌落接種于含100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日按1∶100比例擴(kuò)種，37℃搖床培養(yǎng)至A600nm值為0.6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)誘導(dǎo)6 h。SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)結(jié)果，考馬斯亮藍(lán)R-250染色。另外，調(diào)整工程菌的誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度，以確定最佳的誘導(dǎo)條件。

5.HtpG重組蛋白的純化：經(jīng)4 000 r/min離心10 min，收集誘導(dǎo)后的菌體，菌體沉淀重懸于常規(guī)細(xì)菌裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，0.15 mmol/L NaCl，pH 8.0，臨用前加入1 mmol/L PMSF)中，冰浴超聲破碎，離心后分別收集上清和沉淀以備SDS-PAGE電泳分析。另外，將上清液上樣鎳親和層析柱。上樣后使用結(jié)合緩沖液洗滌，再依次使用洗脫緩沖液(分別含有80、100、250和500 mmol/L咪唑的結(jié)合緩沖液)梯度洗脫，收集各洗脫液樣品，SDS-PAGE電泳鑒定。

6.純化HtpG重組蛋白的Western blot分析：將純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，封閉，依次加入肺結(jié)核患者血清及HRP-羊抗人IgG，DAB顯色，觀察結(jié)果。正常者血清為陰性對(duì)照。

7.ELISA檢測(cè)肺結(jié)核患者血清抗HtpG特異性IgG抗體：取HtpG重組蛋白(20 mg/L)包被96孔酶標(biāo)板，分別取25份肺結(jié)核患者血清和25份正常健康者血清按1∶50稀釋，均做復(fù)孔，每孔100 μL，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照孔。室溫孵育1 h，洗滌5次，加入經(jīng)1∶2 000稀釋的HRP-羊抗人IgG 100 μL/孔，室溫孵育1 h，洗滌5次，加入TMB底物顯色10 min，加入終止液，酶標(biāo)儀測(cè)定A450值。

結(jié) 果

一、HtpG基因的克隆與重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，約在1 944 bp處出現(xiàn)一條與HtpG基因預(yù)期大小相近的DNA條帶(圖1)。構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b-HtpG經(jīng)PCR擴(kuò)增及EcoR I、Hind III的酶切消化，也均可檢測(cè)到大小約為1 944 bp的DNA條帶(圖2)。另外，Blast同源性比對(duì)結(jié)果顯示目的基因的測(cè)序結(jié)果與Genebank公布的M.tbHtpG基因序列完全一致。

M：DNA標(biāo)志物；1：HtpG基因PCR產(chǎn)物

M：DNA標(biāo)志物；1,2：重組質(zhì)粒pET22b-HtpG pCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3：pET22b-HtpG經(jīng)EcoRI單酶切；4：pET22b-HtpG經(jīng) EcoRI和Hind III雙酶切

二、HtpG重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在分子質(zhì)量約73 kDa處出現(xiàn)明顯的目的蛋白條帶，同HtpG蛋白預(yù)期大小相符，未誘導(dǎo)的菌體則沒(méi)有明顯的表達(dá)條帶。由于蛋白的表達(dá)水平跟誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)劑IPTG的濃度有關(guān)，本文分別對(duì)這兩個(gè)影響蛋白表達(dá)的因素進(jìn)行摸索，結(jié)果顯示最佳誘導(dǎo)的條件為：6 h、0.1 mmol/L(圖3)。

對(duì)HtpG重組蛋白的可溶性進(jìn)行分析，表明其主要以可溶性形式存在于菌體裂解上清液中。裂解上清液經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化，可見(jiàn)含有80、100、250 或500 mmol/L 咪唑的緩沖液均可洗脫HtpG重組蛋白，但以含有100 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫純化的HtpG重組蛋白純度最高，經(jīng)蛋白凝膠成像儀軟件分析，該純化HtpG重組蛋白的純度達(dá)到91.6%(圖4)。

M：蛋白標(biāo)志物；1：誘導(dǎo)0h；2：誘導(dǎo)3 h；3：誘導(dǎo)4 h；4：誘導(dǎo)5h；5：誘導(dǎo)6 h；6：1.0 mM IPTG誘導(dǎo)；7：0.5 mM IPTG誘導(dǎo)；8：0.25mM IPTG誘導(dǎo)；9：0.1mM IPTG誘導(dǎo)

M：蛋白標(biāo)志物；1：誘導(dǎo)0h；2：誘導(dǎo)6 h；3：菌體裂解上清液；4：菌體裂解沉淀；5：80 mM咪唑洗脫蛋白；6：100 mM咪唑洗脫蛋白；7：250 mM咪唑洗脫蛋白；8：500 mM咪唑洗脫蛋白

三、HtpG重組蛋白的Western blot分析

結(jié)果可見(jiàn)肺結(jié)核患者血清可以和HtpG重組蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，在分子質(zhì)量約73 kDa處形成一條特異性棕色條帶，健康者血清則無(wú)此反應(yīng)，表明HtpG重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性，但由于HtpG重組蛋白在提取過(guò)程中發(fā)生輕微降解，導(dǎo)致出現(xiàn)兩條相近的條帶(圖5)。

M：蛋白標(biāo)志物；1：肺結(jié)核患者血清；2：健康者血清

四、肺結(jié)核患者血清抗HtpG特異性IgG抗體的ELISA檢測(cè)

結(jié)果可見(jiàn)肺結(jié)核患者血清中抗HtpG特異性IgG抗體的A450值為0.684±0.172，而正常健康血清中抗HtpG特異性IgG抗體的A450值為0.162±0.058，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

討 論

大量研究表明，機(jī)體抵抗M.tb感染主要通過(guò)細(xì)胞免疫應(yīng)答所介導(dǎo)，近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)M.tb的某些熱休克蛋白對(duì)機(jī)體發(fā)揮抗TB保護(hù)性免疫至關(guān)重要。熱休克蛋白是一類進(jìn)化高度保守的蛋白，在正常生理?xiàng)l件下其表達(dá)水平較低，但當(dāng)生物細(xì)胞受到某些理化或生物因素刺激時(shí)，可誘導(dǎo)其表達(dá)量顯著升高，故又稱為應(yīng)激蛋白[7]。Retzlaff等[8]報(bào)道M.tbHSP70蛋白可顯著誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞分泌IL-1、TNF-γ等細(xì)胞因子。Georgieva等[9]報(bào)道M.tbHsp65蛋白可刺激人DC細(xì)胞成熟和增強(qiáng)人DC細(xì)胞遞呈抗原以激活T細(xì)胞，同時(shí)還可誘導(dǎo)人DC細(xì)胞分泌大量IFN- γ而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。Bulut等[10]報(bào)道M.tbHSP65蛋白能結(jié)合并激活內(nèi)皮細(xì)胞表面的TLR4分子，M.tbHSP70蛋白能結(jié)合并激活內(nèi)皮細(xì)胞表面的TLR2分子，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活化及分泌IL-6、IL-8等炎癥細(xì)胞因子。Floto等[11]發(fā)現(xiàn)M.tbHSP70可直接結(jié)合DC細(xì)胞表面的CCR5分子，從而誘導(dǎo)DC細(xì)胞活化。M.tb熱休克蛋白HtpG的基因全長(zhǎng)1 944 bp，編碼蛋白含有647個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量約為72.96 kDa[12～14]。HtpG蛋白在M.tb胞漿內(nèi)主要發(fā)揮分子伴侶作用[15]，這與定位M.tb胞漿的HSP70、HSP65等熱休克蛋白的生理作用相似，但HtpG蛋白是否對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)具有免疫激活作用則尚不清楚。近期有學(xué)者報(bào)道M.tbHtpG蛋白可結(jié)合人DC細(xì)胞表面的TLR4分子而刺激人DC細(xì)胞成熟，并可明顯促進(jìn)人DC細(xì)胞上調(diào)表達(dá)MHC分子以及CD80、CD86等協(xié)同刺激分子，這表明HtpG蛋白雖然與M.tbHSP65蛋白的氨基酸序列不同，但兩者均可通過(guò)共同的TLR4受體分子而介導(dǎo)其下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。另外，HtpG蛋白還可顯著促進(jìn)人DC細(xì)胞分泌TNF-γ、IL - 6、IL-1和IL-12等調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化的細(xì)胞因子[4]。本文也表明HtpG蛋白可顯著刺激機(jī)體發(fā)生體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生特異性的抗HtpG抗體。大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)具有相對(duì)簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，易于高水平表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。據(jù)此，本文根據(jù)Genbank中M.tbHtpG的基因序列，采用PCR技術(shù)從M.tb克隆HtpG基因，成功構(gòu)建PET22b-HtpG重組質(zhì)粒，并在大腸埃希菌中有效表達(dá)。Western blot和ELISA鑒定均表明 HtpG重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性，從而為將其應(yīng)用于結(jié)核免疫診斷試劑的研制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。