謝 睿，徐靖宇

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，貴州 遵義 563099)

Barrett食管(Barrett's esophagus，BE)是臨床上一種常見的食管疾病，最主要的癥狀有反酸、胃灼熱、胸骨后疼痛、吞咽困難等，其病理特點(diǎn)是食管下段復(fù)層鱗狀上皮被單層柱狀上皮替代[1]。BE作為食管腺癌最重要的癌前病變，與食管腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，多中心研究證實(shí)BE患者食管腺癌的發(fā)病危險性是正常人的30～50倍[2-3]。因此如果能及時防治BE的發(fā)生，就可能從源頭降低食管腺癌的發(fā)病率。

目前已知的Barrett食管的致病因素眾多，但大量的臨床研究證據(jù)表明酸暴露刺激引起的食管粘膜微環(huán)境改變與Barrett食管的發(fā)生最為密切。已有報道證實(shí)胃食管反流性疾病引起的胃酸刺激會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的pH降低，減少細(xì)胞程序性死亡，增加細(xì)胞的增殖，促進(jìn)食管粘膜的癌變過程。Triadafilopoulos等[4]亦發(fā)現(xiàn)在給予BE患者質(zhì)子泵抑制劑治療后，可以顯著抑制其腸化上皮的異常增殖并降低BE患者食管癌的發(fā)生率，提示酸暴露刺激在Barrett食管發(fā)生發(fā)展中的重要地位。近年來相關(guān)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)鹽酸刺激正常食管上皮細(xì)胞的過程中通常伴隨著細(xì)胞內(nèi)鈣的增高，表明細(xì)胞內(nèi)鈣的變化有可能參與上述調(diào)控過程，但具體的調(diào)控途徑尚不完全清楚[5]，已知在正常食管粘膜-BE-食管腺癌的演變過程中,尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子-2(Caudal-related homeobox transcription factor-2，CDX2)基因至關(guān)重要， CDX2作為一種腸型分化的標(biāo)志物和核心分子，在胃上皮的研究中已證實(shí)參與胃粘膜上皮腸化生過程的調(diào)控，而近年來研究發(fā)現(xiàn)CDX2亦是Barrett食管發(fā)生過程中重要的下游靶基因，CDX2能通過與眾多腸上皮特異性基因或核轉(zhuǎn)錄因子(MUC2、Villin，KLF4等)協(xié)同作用，誘導(dǎo)食管粘膜腸化生作用。因此，本研究擬從分子和功能調(diào)控兩方面闡明鈣信號通過影響腸型分化的標(biāo)志物CDX2促進(jìn)Barrett食管發(fā)生發(fā)展的重要作用，以期為以Barrett食管的防治尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 正常食管上皮細(xì)胞株HEEC購于中科院上海細(xì)胞庫，免疫組化Barrett食管標(biāo)本來源于遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科診斷為Barrett食管的食管標(biāo)本(25例)。正常食管組織標(biāo)本來源于健康自愿者于遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)鏡室內(nèi)鏡下所取食管標(biāo)本(25例)。激光共聚焦實(shí)驗(yàn)所用的Nigericin和細(xì)胞內(nèi)鈣熒光探針Frua-2AM購于EIPA(美國Sigma公司)和Intergone公司；10%胎牛血清、1640培養(yǎng)基及胰酶購于美國GIBCO公司；細(xì)胞培養(yǎng)所用二氧化碳CO2培養(yǎng)箱(型號3131)購于美國Thermo公司；激光掃描共聚焦顯微鏡均購于德國Leica公司；CDX2抗體及β-actin抗體均購于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 HEEC細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HEEC于5%的二氧化碳CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(含有100 U/L青霉素、100 μg/L鏈霉素的雙抗)，每1～2天用含0.02% EDTA和0.25%胰蛋白酶溶液消化并傳代。將傳代后的HEEC細(xì)胞均勻分配到3個培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度約為80%時分別予以pH7.4培養(yǎng)基(對照組)、pH5.5培養(yǎng)基、pH5.5培養(yǎng)基+BAPTA-AM處理24 h。

1.2.2 免疫組化檢測正常食管和Barrett食管的CDX2表達(dá) 標(biāo)本脫蠟后將脫蠟后的玻片放置于3%雙氧水中作用10 min，再放置于PBS液中洗滌10 min。將玻片置于0.01 mol/L(pH=6.0)的枸櫞酸鹽中，置于微波爐中高火加熱2×10 min，待其自然冷卻后，將玻片置于PBS中洗滌1次，5 min。,將稀釋好的一抗(1∶50)滴加在組織上并使其完全覆蓋放入濕盒中，4℃孵育過夜。去除一抗，將玻片用PBS液洗滌3×10 min，然后滴加二抗(抗一抗來源的)，使其覆蓋于組織表面，室溫放置30 min。DAB顯色，結(jié)果運(yùn)用IPP軟件統(tǒng)計陽性信號值。

1.2.3 Western-blot技術(shù)檢測HEEC細(xì)胞的CDX2表達(dá) 用蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，RCDC 法檢測蛋白濃度，經(jīng)5%的濃縮膠和10% 的分離膠SDS-PAGE 電泳，每孔上樣量為40 μg總蛋白。濃縮膠60 V 電泳1 h，分離膠100 V電泳2 h，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜120 min，5%的BCA 封閉1 h，一抗孵育4℃過夜(CDX2抗體1∶1 000，β-actin抗體1∶5 000)，二抗室溫孵育2 h，(二抗稀釋比例:山羊抗鼠1∶5 000，山羊抗兔1∶10 000) ，ECL 化學(xué)發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)顯影。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡檢測HEEC細(xì)胞內(nèi)Ca2+動態(tài)變化 預(yù)先將載玻片在酒精內(nèi)浸泡24 h，于紫外燈下照射15 min后置于24 孔板內(nèi)，將細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)后培養(yǎng)1～2d備用，成功爬片后開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時用按比例配置的PSS 液(含140 mM Na+、5 mM K+、2 mM Ca2+、149 mM Cl-、10 mM HEPES和10 mM葡萄糖，pH 7.4)漂洗3次，加入2 μL終濃度為10 μmol /L 的Frua-2AM，室溫避光孵育60 mim，孵育結(jié)束再用PSS液漂洗3 次(10 min /次) ，然后將長有HEEC細(xì)胞的蓋玻片置于倒置熒光顯微鏡臺上的標(biāo)準(zhǔn)灌注室中，調(diào)整共聚焦激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長527 nm 探測熒光發(fā)射，數(shù)據(jù)采集間隔時間為5 s，掃描時間為20 mim，動態(tài)觀察Frua-2AM 所標(biāo)Ca2+的熒光強(qiáng)度的變化來表示細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+水平的變化。

2 結(jié)果

2.1 CDX2在Barrett食管粘膜的表達(dá)水平顯著高于正常食管粘膜 CDX2在正常食管粘膜組織和BE食管粘膜組織中均有陽性表達(dá)，亞細(xì)胞定位主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，部分細(xì)胞質(zhì)中也有表達(dá)，而且在Barrett食管粘膜組織中的CDX2的表達(dá)水平顯著高于正常食管粘膜組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001,見圖1、表1)。

A：CDX2在正常食管粘膜組織中的表達(dá)；B：CDX2在人BE粘膜組織中的表達(dá)；左上、下×100，右上、下×200。圖1 免疫組化檢測人正常食管粘膜和人Barrett食管粘膜組織中CDX2的表達(dá)

表1 人正常食管粘膜組織和Barrett食管粘膜組織中CDX2的表達(dá)比較

*：本組與正常食管粘膜上皮比較，P<0.001。

2.2 酸刺激對HEEC細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的影響 通過灌流系統(tǒng)分別用不同pH值的緩沖液刺激HEEC細(xì)胞，鈣離子測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組(pH 7.4)相比，pH5.5和pH5.0的酸性緩沖液能明顯誘導(dǎo)HEEC細(xì)胞內(nèi)的鈣離子水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，而pH7.0、6.5、6.0的酸性緩沖液對HEEC細(xì)胞內(nèi)的鈣離子水平無明顯影響(P>0.05，見圖2)。另外在給予pH5.5酸性緩沖液刺激的同時加入細(xì)胞內(nèi)鈣螯合劑BAPTA-AM(10μmol/L)共同作用，可見pH5.5酸性緩沖液誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣增高明顯被抑制(P<0.001，見圖3)。提示酸刺激(pH5.0-pH5.5)可以調(diào)控食管上皮細(xì)胞的胞內(nèi)鈣水平，而細(xì)胞內(nèi)鈣螯合劑BAPTA-AM能有效抑制這種細(xì)胞內(nèi)的鈣變化。

A:鈣離子成像檢測不同pH刺激后細(xì)胞鈣離子變化曲線；B:不同pH刺激后細(xì)胞鈣離子變化統(tǒng)計圖；*：與pH 7.4對照組比較,P=0.0006<0.001，n=50。#：與pH 7.4對照組比較,P=0.0005<0.001，n=50。圖2 鈣離子成像檢測不同pH刺激對HEEC細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平變化的影響

*：本組與 pH 5.5酸性緩沖液組比較,P=0.0005<0.001，n=55。圖3 鈣離子成像檢測細(xì)胞內(nèi)鈣螯合劑BAPTA-AM對pH5.5酸性緩沖液調(diào)控HEEC細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平變化的影響

2.3 酸刺激對HEEC細(xì)胞CDX2蛋白表達(dá)的影響 與pH7.4對照組相比，給予pH5.5酸性環(huán)境孵育HEEC細(xì)胞24h后，CDX2的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.001，見圖4)，提示酸刺激可能通過調(diào)控CDX2的表達(dá)促進(jìn)BE的發(fā)生發(fā)展。

*：本組與pH 7.4對照組比較 ,P=0.0007<0.001，n=3。圖4 Western-blot檢測pH5.5酸性環(huán)境刺激HEEC細(xì)胞24h后CDX2蛋白的表達(dá)變化

2.4 鈣螯合劑BAPTA-AM對酸刺激誘導(dǎo)的CDX2表達(dá)變化的影響 為了進(jìn)一步檢測細(xì)胞內(nèi)鈣變化對調(diào)控CDX2表達(dá)的重要作用，在給予pH5.5酸性緩沖液孵育細(xì)胞的同時加入細(xì)胞內(nèi)鈣螯合劑BAPTA-AM(10μmol/L)共同作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組(pH7.4)比較，pH5.5酸刺激HEEC細(xì)胞后CDX2蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯升高(P<0.001)，而加入BAPTA-AM共同作用后pH 5.5誘導(dǎo)的CDX2表達(dá)上調(diào)被明顯逆轉(zhuǎn)(P<0.001，見圖5)，提示細(xì)胞內(nèi)鈣變化是酸刺激調(diào)控CDX2表達(dá)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

#：本組與pH 7.4對照組比較P=0.0009<0.001,n=3;*：本組與pH 7.4對照組比較P=0.046<0.05,n=3；&：本組與pH 5.5酸刺激組比較,P=0.030<0.05,n=3。圖5 Western blot檢測人pH5.5及細(xì)胞內(nèi)鈣螯合劑BAPTA-AM對HEEC細(xì)胞CDX2表達(dá)變化的影響

3 討論

Barrett食管的一個特征在于復(fù)層鱗狀上皮被單層柱狀上皮所替代，目前認(rèn)為Barrett食管是食管腺癌發(fā)生過程中重要的危險因素[6]。過去數(shù)十年，BE相關(guān)腺癌的發(fā)病率在西方人群中顯著增加。但最近幾年，隨著我國人民生活方式的日益西化，BE發(fā)病率也呈上升趨勢，這必將導(dǎo)致BE相關(guān)食管腺癌的發(fā)病率迅速升高。更重要的是臨床研究發(fā)現(xiàn)如果早期合理的治療Barrett食管，部分患者的病變是可以發(fā)生逆轉(zhuǎn)的。因此，闡明其發(fā)生機(jī)制對BE相關(guān)食管腺癌的早期診斷和治療具有重要意義。

大量的臨床研究證據(jù)表明酸暴露刺激引起的食管粘膜微環(huán)境改變與Barrett食管的發(fā)生最為密切[7]。已有報道證實(shí)胃食管反流性疾病引起的胃酸刺激會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的pH降低，減少細(xì)胞程序性死亡，增加細(xì)胞的增殖，促進(jìn)食管粘膜的癌變過程[8]。當(dāng)食管下段粘膜長期反復(fù)受到胃酸、膽汁酸刺激時，可導(dǎo)致食管粘膜遭到腐蝕破壞以及炎癥性改變，更為嚴(yán)重的是可導(dǎo)致食管單層鱗狀上皮向柱狀上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)變[9]。因此目前認(rèn)為酸暴露及膽汁反流刺激引起的食管粘膜微環(huán)境改變可能與Barrett食管發(fā)生密切相關(guān)。已有報道證實(shí)胃食管反流性疾病引起的胃酸刺激會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的pH降低，長期的胃酸刺激可以誘導(dǎo)食管粘膜從正常生理向癌轉(zhuǎn)變，腸化上皮的異常增殖并降低BE患者食管癌的發(fā)生率。更為重要的是，在動物實(shí)驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)，無論是通過食管下段與空腸起始部手術(shù)吻合模擬十二指腸食管反流模型，還是給予長期高酸反流的條件誘導(dǎo)刺激，都能成功地建立Barrett食管的動物模型，這有力地支持了酸暴露刺激與膽汁反流在Barrett食管發(fā)生發(fā)展中的重要作用。

在正常食管粘膜-BE-食管腺癌的演變過程中，CDX2基因至關(guān)重要， CDX2是一種腸型分化的標(biāo)志物和核心分子，主要表達(dá)于腸上皮細(xì)胞、胰腺上皮細(xì)胞以及胃與食管中的腸上皮化生細(xì)胞，但在正常食管、胃粘膜和其它正常上皮均低表達(dá)或無表達(dá)，其在腸上皮早期分化及腸型維持方面具有關(guān)鍵作用[10-11]。CDX2能直接激活許多種腸上皮特異性基因表達(dá)，如(mucin 2)MUC2、Villin[12]，已知在小腸胚胎干細(xì)胞中CDX2的表達(dá)能促使干細(xì)胞向小腸上皮分化，而抑制其表達(dá)則能誘導(dǎo)出鱗狀上皮，而在胃上皮的研究中已證實(shí)CDX2 的表達(dá)是胃粘膜上皮腸化生的關(guān)鍵因素[13-14]。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)在臨床的Barrett食管中CDX2的陽性率和表達(dá)強(qiáng)度較正常食管粘膜明顯增高，并且給予pH 5.5的酸性環(huán)境后，可以誘導(dǎo)正常永生化食管鱗狀上皮細(xì)胞HEEC中 CDX2的表達(dá)上調(diào)，提示CDX2是Barrett食管發(fā)生中重要的下游靶基因，而進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)在給予pH 5.5的酸性環(huán)境刺激后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平明顯增高。細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號是重要的第二信使[15]。已知Ca2+作為應(yīng)答胞外信號快速轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)信號的重要媒介，其參與了機(jī)體各種生理及病理過程，在正常生理情況下，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化被精確的調(diào)控(包括細(xì)胞內(nèi)鈣離子來源、升高的濃度、持續(xù)的時間以及頻率)。當(dāng)在炎癥損傷以及腫瘤發(fā)生等病理過程中，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的精確調(diào)控發(fā)生紊亂進(jìn)而活化下游一系列信號通路，調(diào)控疾病的發(fā)生發(fā)展。我們進(jìn)一步的結(jié)果也證實(shí)給予細(xì)胞內(nèi)鈣離子阻斷劑BAPTA-AM共同作用后，pH5.5誘導(dǎo)的 HEEC細(xì)胞CDX2的表達(dá)上調(diào)能夠被明顯逆轉(zhuǎn)，提示細(xì)胞內(nèi)的鈣變化的確是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

雖然鈣信號下游調(diào)控CDX2的具體機(jī)制尚不明確，但通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)胃酸可以激活一系列的信號途徑，例如食管上皮細(xì)胞暴露于酸性微環(huán)境時可激活包括ERK、NF-KB和p38MAPK在內(nèi)調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡行為的多條信號通路[16-17]，進(jìn)而誘導(dǎo)COX2、前列腺素E2的表達(dá)[18]。還有研究發(fā)現(xiàn)在pH極低的酸性環(huán)境刺激誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激途徑的激活，進(jìn)而促進(jìn)了Barrett食管的發(fā)生發(fā)展過程，而氧化應(yīng)激途徑的激活又與NF-KB、JAK-STAT、MAPK等炎癥相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活密切相關(guān)[19]。課題組將進(jìn)一步研究證實(shí)酸性刺激誘導(dǎo)BE的相關(guān)信號通路及調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣變化的具體通道，為防治BE尋找到新靶點(diǎn)，進(jìn)而有效地防止食管腺癌的發(fā)生發(fā)展。