王 偉 （廣東永順生物制藥股份有限公司 廣東 廣州 510000） 王永花 （山東省蒙陰縣科技局）

纖維素酶作為重要的糖苷水解酶，對纖維素有較好的水解作用。目前已知的天然纖維素酶已廣泛應(yīng)用于各方面，但其產(chǎn)量難以達(dá)到生產(chǎn)需求，造成了大量資源的浪費(fèi)。為了充分利用纖維素資源，獲得高產(chǎn)的纖維素酶菌株，目前國內(nèi)外對纖維素酶基因工程的研究已成為熱點(diǎn)。本文對纖維素酶基因及其表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行綜述，總結(jié)近幾年來纖維素酶基因工程的研究進(jìn)展，為后續(xù)研究提供依據(jù)。

纖維素酶來源廣泛(細(xì)菌、真菌、動物體內(nèi))，其中細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶是胞內(nèi)菌且活性低，產(chǎn)量低，種類單一。真菌則能夠分泌大量的胞外纖維素酶，而且酶的種類齊全，其中對木霉屬、曲霉屬和青霉屬[1]研究最多。現(xiàn)已知的纖維素酶其基因的表達(dá)通常受多種因素的影響和制約，產(chǎn)量較低，難以滿足工業(yè)生產(chǎn)。在此基礎(chǔ)上人們嘗試將纖維素酶基因和高效的啟動子融合，改變纖維素酶基因的表達(dá)方式，使其異源或同源表達(dá)，顯著的提高了纖維素酶的產(chǎn)量，這將是提高纖維素酶生產(chǎn)效率的有效途徑。近幾年來分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)發(fā)展較快，對纖維素酶分子層面的研究也在不斷深入，其中纖維素酶基因的克隆與表達(dá)成了研究的焦點(diǎn)。

1 纖維素酶研究進(jìn)展

1.1 纖維素酶簡介

纖維素酶是由三中不同種類的酶組成的復(fù)合酶，并且各種酶之間相互協(xié)同，將纖維素最終水解為葡萄糖。纖維素酶的分類有三種：

1.1.1 內(nèi)切葡聚糖酶 不同的來源名稱不同，明該類酶主要作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，來自細(xì)菌的叫Cen，真菌的叫Eg。有研究表并且對CMC-NA等這種無定型纖維素的非定型區(qū)具有水解作用[2]。

1.1.2 外切葡聚糖酶 該酶又可分為β-1，4-D葡聚-葡萄糖水解酶和纖維二糖水解酶。其中β-1，4-D葡聚-葡萄糖水解酶是纖維素酶體系中的重要組成部分，對微晶纖維素和結(jié)晶度高的纖維素的水解起主導(dǎo)作用。

1.1.3 β-葡萄糖苷酶 它主要分解纖維二糖和纖維素糊精的非還原末端，水解葡萄糖殘基生成葡萄糖。

1.2 纖維素酶的應(yīng)用

21世紀(jì)以來，我國人口數(shù)量不斷上升，畜牧業(yè)集約化水平也在不斷提高，但資源短缺的現(xiàn)象卻日益顯現(xiàn)。面對資源匱乏的嚴(yán)峻形勢，纖維素類物質(zhì)卻被大量浪費(fèi)：焚燒，丟棄…這些做法既污染了環(huán)境又造成了資源大量的流失。為了避免纖維素資源的浪費(fèi)，目前纖維素酶已被廣泛地應(yīng)用于食品、釀酒、飼料加工、紡織、洗衣、農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域中[3]。

1.2.1 食品工業(yè)的應(yīng)用 將纖維素酶應(yīng)用于果實(shí)和蔬菜加工過程，不僅可以避免果蔬香味和維生素的損失，而且可使植物組織軟化膨松，提高可消化性并改良口感。在油料作物加工中用纖維素酶處理法代替有機(jī)溶劑法，不僅能提高油的產(chǎn)量和質(zhì)量，還能減少副產(chǎn)物的生成和降低廢物處理費(fèi)用[4]。除此之外，纖維素酶還被廣泛應(yīng)用于茶葉加工、食醋釀造、醬油釀造和啤酒生產(chǎn)等行業(yè)中。

1.2.2 飼料工業(yè)的應(yīng)用 纖維素酶在畜牧業(yè)和飼料工業(yè)上也發(fā)揮著重要的作用。纖維素酶作為外源酶添加到動物日糧中，能很好的提高動物對飼料的消化率和轉(zhuǎn)化率，而且也能夠緩解目前能量飼料短缺的局面。在飼料中添加纖維素酶后，喂養(yǎng)效果明顯，喂蛋雞可提高產(chǎn)卵量，喂乳牛時(shí)，不僅體重增加，產(chǎn)乳量也顯著上升。程松峰等[5]在斷奶羔羊的日糧中放入纖維素復(fù)合酶，然后與未加纖維素酶的一組進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加纖維素酶一組的羔羊平均日增重提高到了4.22%，料重比降低了5.2%。在肉雞的日糧中拌入纖維素酶復(fù)合物可使肉雞飼料消耗總量下降16.15%，肉雞體重增加2.78%，料肉比降低10.08%。

1.2.3 其他方面的應(yīng)用 纖維素酶也廣泛的應(yīng)用于造紙、洗滌、草藥提取、生態(tài)農(nóng)業(yè)等方面。堿性纖維素酶作用于洗滌工業(yè)，改善了去污機(jī)制，與之前洗滌劑相比，去污能力有了很大的提高。纖維素酶也可作用于天然植物的降解，不僅節(jié)約了資源，環(huán)境也得到了很大的改善。

2 纖維素酶及其基因的研究進(jìn)展

2.1 纖維素酶的研究概況

纖維素酶在19世紀(jì)就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，并且隨著技術(shù)的發(fā)展，人們在蝸牛的滑液中發(fā)現(xiàn)了具有分解能力的纖維素酶。纖維素酶的發(fā)展主要經(jīng)過了以下幾個(gè)階段：1980年以前，主要采用傳統(tǒng)分離純化的方法培養(yǎng)產(chǎn)纖維素酶的微生物，并且在培養(yǎng)的過程中對纖維素酶有了更近一步的認(rèn)識；到了八九十年代，主要研究纖維素酶基因，利用基因工程的手段對基因進(jìn)行克隆與表達(dá)；近年來，在蛋白組學(xué)、宏基因組、基因組學(xué)的研究背景下，對纖維素酶分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能研究較多，并且對纖維素的酶解機(jī)理有了更深入的了解。

2.1.1 國外研究 早在100多年前，Bary．A和Ward Marshall就在真菌中發(fā)現(xiàn)了纖維素酶。1906年，Seillicre在蝸牛的消化液中發(fā)現(xiàn)了有分解能力的纖維素酶。1912年，Pringsheim首次從嗜熱性纖維素細(xì)菌中分離出纖維素酶，從此揭開了纖維素酶研究的序幕。20世紀(jì)40-50年代，在對產(chǎn)纖維素酶微生物分離篩選的過程中，建立起較為完整的分離篩選方法。20世紀(jì)60年代后期，分離技術(shù)的發(fā)展推動了纖維素酶的分離純化工作，加快了纖維素酶的組分、作用方式及誘導(dǎo)作用等方面的研究進(jìn)展，實(shí)現(xiàn)了纖維素酶制劑的工業(yè)生產(chǎn)。20世紀(jì)70年代，有些學(xué)者提取到了3種酶，并且發(fā)現(xiàn)這3種酶協(xié)同作用下可以提高纖維素酶的活性。1997年，韓國和美國學(xué)者對里氏木霉及5株溫度突變菌株產(chǎn)纖維素酶的條件進(jìn)行研究，指出由于多種酶的協(xié)同作用，葡萄糖的產(chǎn)率比單獨(dú)的纖維素酶作用的總和高1.5～8倍。

2.1.2 國內(nèi)研究 我國在1960年就開始了對纖維素酶的研究，隨后北京、上海等地的科研院所對纖維素酶進(jìn)行了大量的研究，并且選育出一批纖維素酶菌種。1968年，北京選育出一批纖維素酶菌種。1970年，中國科學(xué)院上海植物生理研究所用誘變方法獲得了產(chǎn)酶能力較高的變異株。1975年，廣東省微生物研究所分離篩選出纖維素酶產(chǎn)生菌株—長梗木霉。20世紀(jì)90年代，在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)陳祖潔教授和曹淡君教授的親自指導(dǎo)下，黑龍江省海林市萬力達(dá)集團(tuán)公司首條年產(chǎn)2000t纖維素酶生產(chǎn)線投產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)了纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

2.2 纖維素酶基因的研究現(xiàn)狀

（1）20世紀(jì)80年代，DNA重組技術(shù)發(fā)展迅速，并廣泛用于基因的研究，其中編碼Eng和Exg的胞外纖維素酶基因被研究較多。2009年，Rahman[6]等用T.reesei的cbh1啟動子和終止子構(gòu)建表達(dá)載體來制備同源和異源性蛋白質(zhì)。2011年，華南理工大學(xué)將構(gòu)建的隨機(jī)整合型pWEF3基因和定點(diǎn)整合型pWEF32基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入里氏木霉，發(fā)現(xiàn)pWEF31適合用于隨機(jī)性的重組試驗(yàn)，而pWEF32適用于同源性重組。Anthony等[7]2012年第一次在C. biazotea中發(fā)現(xiàn)了GH1家族中由新型纖維二糖酶基因編碼的β-葡萄糖苷酶。（2）隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，獲得完整纖維素酶基因的方法也在不斷地進(jìn)步。人們將細(xì)菌或真菌的纖維素酶基因放在異源菌(大腸桿菌或酵母細(xì)胞)中進(jìn)行表達(dá)。李旺等[8]總結(jié)，在纖維素酶基因研究和克隆的早期，若想獲得纖維素酶基因較完整的信息，可通過構(gòu)建DNA文庫和cDNA文庫的方法。而隨著技術(shù)的進(jìn)步，目前可采用人工合成和選擇性的從宏基因組中擴(kuò)增等方式獲得纖維素酶基因。

3 纖維素酶基因工程的研究進(jìn)展

目前，雖然天然產(chǎn)纖維素酶的菌株有很多，但其產(chǎn)酶量低，產(chǎn)酶條件嚴(yán)苛，難以大規(guī)模的應(yīng)用于生產(chǎn)[9]。在此基礎(chǔ)上，人們嘗試對基因進(jìn)行克隆、異源表達(dá)來改造產(chǎn)纖維素酶菌株，以獲得產(chǎn)酶量高、活性高、易培養(yǎng)的工程菌[10，11]。

3.1 纖維素酶基因克隆

（1）在當(dāng)今科技發(fā)展的背景下，基因的克隆技術(shù)取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展?；蚩寺〉姆椒ㄒ延蓸?gòu)建DNA文庫或cDNA文庫，進(jìn)步為人工合成法、特異性引物擴(kuò)增法，而且許多目的基因可以通過特異性引物從某一區(qū)域的宏基因組中克隆獲得。（2）到目前為止，7000多個(gè)纖維素酶基因序列及其相應(yīng)的氨基酸序列被發(fā)現(xiàn)并記錄在Gen Bank，EMBL等共享數(shù)據(jù)庫中。同時(shí)，目前所能克隆到的纖維素酶基因都實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。如：在畢赤酵母中成功表達(dá)了來源于枯草芽孢桿菌的纖維素酶基因；放線菌的纖維素酶基因Cel6A 和Cel6B實(shí)現(xiàn)了在煙草中的表達(dá)；從白蟻中克隆的纖維素酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)等等。

3.2 纖維素酶基因原核表達(dá)系統(tǒng)

（1）原核表達(dá)系統(tǒng)是基因表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早，應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)。與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，具有目的基因表達(dá)水平高，培養(yǎng)周期短，抗污染能力強(qiáng)，成本相對低等特點(diǎn)。常用的原核表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)。（2）黃艷等[12]從康氏木霉中克隆得到纖維素酶EGⅠ基因，并通過表達(dá)載體pETHis成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌。王萬能[13]利用反轉(zhuǎn)錄PCR法，從福壽螺中克隆出纖維素酶基因CelAg，將其與載體pET-30a(+)連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，通過檢測得到重組菌的纖維素酶活達(dá)8.31U/ml。任慧杰等[14]將得到的松材線蟲纖維素酶編碼基因BXC46，克隆到表達(dá)載體pET-15b上，通過大腸桿菌BL21(DE3)菌株進(jìn)行表達(dá)，其中部分純化的重組蛋白具有纖維素酶的活性。阮濤等[15]從綠木霉ZY－01中克隆得到了外切葡聚糖酶CBHI，并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，成功獲得了CBHI可溶性蛋白。（3）大腸桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)，水平很低，而且產(chǎn)生的纖維素酶大部分不能分泌到胞外，提取有很大的困難，無法達(dá)到纖維素酶生產(chǎn)的要求?？莶菅挎邨U菌不僅在臨床等方面的應(yīng)用上具有安全性，而且可以直接高效的分泌目的蛋白。李方正[16]將1株全長1518bp的枯草芽孢桿菌EG基因，通過表達(dá)質(zhì)粒pMG36e-EG電轉(zhuǎn)化至乳球菌MG1614感受態(tài)細(xì)胞，成功構(gòu)建了產(chǎn)內(nèi)切纖維素酶的基因工程乳酸菌。劉暉[17]將內(nèi)切葡聚糖酶基因Tv-EgVⅡ和葡萄糖苷酶基因An-BglⅠ與大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體PMA5連接，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌168內(nèi)，獲得了遺傳性能穩(wěn)定、產(chǎn)纖維素酶較高的基因工程菌。

3.3 纖維素酶基因真核表達(dá)系統(tǒng)

（1）真核表達(dá)系統(tǒng)與原核表達(dá)系統(tǒng)相比有其優(yōu)點(diǎn)。真核系統(tǒng)更容易誘導(dǎo)基因的高效表達(dá)，而且不會發(fā)生基因之間的非特異性激活或抑制，利用真核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)目的蛋白越來越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。（2）木霉本身不但能合成纖維素酶，而且還能作為外源基因的表達(dá)系統(tǒng)，其具有成熟的發(fā)酵技術(shù)和較強(qiáng)的蛋白質(zhì)胞外分泌能力[18]。在此基礎(chǔ)上，Takashima 等[19]分別從腐質(zhì)霉和木霉中克隆了纖維素酶基因，并將這些纖維素酶基因轉(zhuǎn)化到米曲霉中，實(shí)現(xiàn)了這兩個(gè)基因在真核宿主中的高效表達(dá)，并獲得了異源纖維素酶。（3）纖維素酶基因在異源宿主表達(dá)的過程中容易遇到蛋白水解酶和糖基化等問題，這使得酵母菌成為表達(dá)的首選菌，它不僅可以使表達(dá)出的蛋白具有生物活性，而且酵母本身分泌的蛋白成分很少，利于表達(dá)蛋白的分離純化，是目前較為理想的真核表達(dá)系統(tǒng);此外，酵母菌繁殖速度快、營養(yǎng)要求低、培養(yǎng)基價(jià)格低廉，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)[20，21]。Zhuge等[22]成功將來源于細(xì)菌的纖維素酶基因轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中，實(shí)現(xiàn)了原核細(xì)菌基因在酵母中的表達(dá)。張煜等[23]采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了瑞氏木霉CBHⅡ基因的表達(dá)。田生禮等[24]將從嗜堿性芽孢桿菌ATCC21833中擴(kuò)增得到的堿性纖維素酶基因，與酵母整合型表達(dá)載體pGAPZaA連接，并轉(zhuǎn)化至巴氏畢赤酵母GS115，成功構(gòu)建了表達(dá)堿性纖維素酶的畢赤酵母工程菌。黃時(shí)海等[25]克隆了康氏木霉CBHⅠ基因，并在畢赤酵母中成功表達(dá)，檢測表達(dá)產(chǎn)物其酶活達(dá)到24.1U/L。（4）酵母表達(dá)系統(tǒng)具有將纖維素的最終分解產(chǎn)物—葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精的能力，如果能將纖維素酶系的基因克隆到酵母表達(dá)系統(tǒng)中，可以實(shí)現(xiàn)從纖維素到葡萄糖再到酒精的完整發(fā)酵過程，成為纖維素酶基因工程發(fā)展的一個(gè)重要方向。王利英等[26]反轉(zhuǎn)錄得到葡聚糖內(nèi)切酶EGⅠ和EGⅢ基因cDNA，將其克隆到酵母載體中，成功構(gòu)建了產(chǎn)生纖維素酶的釀酒酵母工程菌。

4 總結(jié)

（1）從發(fā)現(xiàn)纖維素酶至今，人們將注意力集中至高產(chǎn)酶量菌株的選育工作中，并且已取得了重要進(jìn)展，但是因?yàn)檫x育的許多菌株產(chǎn)酶活性低、菌種易退化等問題使纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)受到限制。因此，人們把注意力轉(zhuǎn)移到纖維素酶基因上，利用基因工程技術(shù)對纖維素酶基因進(jìn)行克隆和異源表達(dá)，為構(gòu)建高效纖維素酶分解菌等方面開辟了新途徑。（2）隨著生物及工程技術(shù)的發(fā)展，纖維素酶基因工程的發(fā)展也日新月異。為了更好地利用自然界中豐富的纖維素資源，人們對纖維素酶基因工程的研究還在繼續(xù)。相信在不遠(yuǎn)的將來，會有更先進(jìn)的技術(shù)來探索纖維素酶基因。