楊倩 黃力毅

廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院感染科（南寧530000）

近年來，隨著抗菌藥物的廣泛應用及免疫缺陷病患者數(shù)量增多，真菌感染是較常見的臨床問題，念珠菌是最常見的真菌病原體之一，同時也是醫(yī)院獲得性感染的主要病原菌，而白色念珠菌感染在相關念珠菌屬中的發(fā)病率最高［1-2］，其常寄生在人體的口腔、皮膚、腸道黏膜及陰道等部位。當宿主免疫力低下或寄居處微環(huán)境發(fā)生改變，則易導致淺表性或全身系統(tǒng)性感染?，F(xiàn)有的抗真菌藥物濃度對浮游態(tài)白色念珠菌有效，但對已形成生物膜中的白色念珠菌細胞無效，雖然更高的濃度可以有效地對抗生物膜，但這些高劑量往往會對宿主造成嚴重的副作用（肝或腎毒性），耐藥率也越來越高，難以徹底根治［3-4］。白色念珠菌耐藥性與生物膜形成有關［5］，研究表明微生物生物膜占人類所有細菌和真菌感染的80%［6］，因此開發(fā)新的抗生物膜方法顯得尤為迫切，光動力療法（photodynamic therapy，PDT）作為一種可替代傳統(tǒng)抗菌療法的新型非侵入性療法，可使生物膜實質性的減少，甚至徹底的根除［7］。相關研究［8-11］表明PDT 可以抑制白色念珠菌生物膜形成、破壞生物膜結構、殺滅生物膜內菌體以及影響生物膜相關基因的表達，從而有效滅活耐藥性白色念珠菌。本文主要從以下5 個方面闡述PDT 對白色念珠菌生物膜作用的研究進展。

1 PDT 的概念及作用機制

PDT 是光敏劑（photosensitizer，PS）在光源照射下發(fā)生激化反應引起一系列級聯(lián)反應產生大量活性氧物質導致靶細胞發(fā)生不可逆損傷的治療方法。其作用機制涉及吸收光子激發(fā)PS 到其短壽命的單重態(tài)，然后經歷電子躍遷到更長壽命的三重態(tài)，較長的壽命允許三重態(tài)PS 與兩種不同的光化學（Ⅰ型和Ⅱ型）途徑之一的環(huán)境（基態(tài)）氧反應。在Ⅰ型光化學反應中，PS 通過電子轉移方式生成羥自由基、超氧陰離子、過氧化氫等；Ⅱ型光化學反應是PS通過能量碰撞轉移方式產生單線態(tài)氧。根據(jù)激發(fā)態(tài)PS 所處的位置，所產生具有細胞毒性的活性氧物質，迅速誘導損傷周圍環(huán)境中微生物的細胞壁、脂膜、蛋白質等，最終非特異性地殺滅微生物［12］。

2 白色念珠菌生物膜的形成過程及影響其形成的因素

白色念珠菌生物膜形成過程大致分為4 個階段：早期（0～11 h）白色念珠菌細胞以芽生孢子的形式附著于物體表面并繼續(xù)繁殖；中期（12～30 h）細胞分泌胞外聚合物，黏結單個真菌細胞而形成真菌團塊，進而形成分散的微菌落，并逐漸融合形成生物膜的基底層；成熟期（31～72 h）細胞外基質的不斷產生和釋放，覆蓋在真菌微菌落表面直至將細胞完全包裹，同時隨菌絲或假菌絲的形成，結構逐漸復雜，發(fā)育為成熟的生物膜；72 h 后生物膜結構發(fā)生解離，酵母相的細胞脫落下來，繼續(xù)形成新的生物膜。胞外聚合物、微生物細胞表面和細胞內生物分子是影響生物膜形成的三大因素，其中胞外聚合物通過“聚合物橋接”過程克服微生物細胞與基質之間的靜電排斥，從而確保微生物細胞附著或錨定到基質［7］，這一過程對細胞的初始黏附是至關重要的。

3 白色念珠菌生物膜耐藥性及耐藥機制

白色念珠菌復雜的生物膜形成，使其耐藥性增加。研究表明，念珠菌生物膜細胞對抗真菌藥物如兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑和酮康唑的抗藥性比浮游細胞高30 ～2 000 倍［13］。其耐藥機制可能與生物膜外基質的屏障作用、生物膜內細胞生長緩慢和營養(yǎng)限制、相關耐藥基因表達、細胞膜甾醇代謝異常、藥物外排泵的上調以及持留細胞的存在等有關［14-16］。研究證實PDT 的抗菌作用與微生物細胞是否存在抗菌藥物抗藥性無關［17］。

4 PDT 對白色念珠菌生物膜的作用

4.1 抑制生物膜形成酵母和菌絲型細胞的發(fā)育對生物膜的形成至關重要。PINTO 等［8］體外研究證實甲苯胺藍-O（toluidine blue o，TBO）介導的PDT 能夠抑制生物膜的整個形成階段。經過不同濃度（0.01、0.02、0.05、0.1 mg/mL）的TBO 介導的PDT 處理白色念珠菌ATCC10231，通過測定在不同發(fā)育階段（6、12、24、48 h）形成的生物膜的代謝率，證實上述4 種濃度的TBO 均可以不同程度地抑制生物膜形成，并且在生物膜的不同發(fā)育階段都觀察到這種抑制效應，其中0.1 mg/mL 的TBO 介導的PDT 可以抑制約50%生物膜形成。該研究利用光學顯微鏡觀察比較PDT（0.1 mg/mL TBO）治療前后生物膜的變化，治療前，12 h 的生物膜形成過程中，酵母和絲狀體的細胞數(shù)量減少，而48 h 的生物膜形成呈現(xiàn)出更多的細胞，包括絲狀體。治療后，觀察到生物膜結構中細胞數(shù)量的減少，在12 和48 h 的生物膜形成中，絲狀體完全沒有細胞，而對照組中當細胞被單獨照射或單獨使用TBO 時，形成的生物膜的形態(tài)沒有改變。研究結果表明，TBO 介導的PDT 可以通過減少從酵母菌到絲狀體的過渡過程，從而有效地減少生物膜形成，這可能是PDT 抑制生物膜形成的機制之一。QUISHIDA［18］研究也得到了相似的結論，發(fā)現(xiàn)白色念珠菌ATCC90028 不同發(fā)育階段（24、48 h）生物膜對不同濃度（80、100、120 μmol/L）的姜黃素介導的PDT 都是敏感的，且24 h 生物膜比48 h 生物膜對PDT 更敏感。CARVALHO 等［9］研究證實二氫卟酚e6介導的PDT 可降低白色念珠菌ATCC10231 形成生物膜的能力，當二氫卟酚e6 濃度為7 μmol/L，可抑制50%生物膜形成；當二氫卟酚e6 濃度為20 μmol/L，生物膜形成率降低了90%以上。同時，通過光學顯微鏡觀察到酵母細胞和菌絲形成都大大減少，在生物膜結構中完全沒有絲狀形式，表明PDT 對生物膜形成的抑制與減少芽殖酵母形式到絲狀形式的轉變有關，這是定植和毒力的重要階段。DAVIES 等［19］體外實驗證實PDT 能夠減少白色念珠菌生物膜形成，在室溫37 ℃條件下，經過52.2 μmol/L 的咪康唑孵化2 h，緊接著7.3 μmol/L 的四甲苯磺酸卟啉孵育30 min，能量密度為58.5 J/cm2的可見光照射，用XTT 實驗測定發(fā)現(xiàn)ATCC 菌株（白色念珠菌MYA-2732、白色念珠菌MYA-274）及臨床分離株（白色念珠菌6122/06）生物膜形成分別減少60%、46%、73%，其抑制效果均顯著高于單獨使用咪康唑組或四甲苯磺酸卟啉介導的PDT 組。這種聯(lián)合療法為將來用于假牙和口腔表面念珠菌生物膜的治療提供依據(jù)。KHAN 等［20］探索了新型納米金顆粒（gold nanoparticles，GNP）增強亞甲藍（methylene blue，MB）介導的PDT 對頑固性致病性白色念珠菌生物膜的作用，用MB 介導的PDT 可以抑制81.9%生物膜的形成，實驗證明同時結合GNP，可以增加對生物膜的抑制，其抑制率為95.4%。QUISHIDA等［21］研究證實不同濃度（175、200 mg/L）的二氫卟吩e6 衍生物光狄沙嗪介導的PDT 均能減少白色念珠菌ATCC90028 生物膜生物量，并且連續(xù)3 次PDT 的應用效果更明顯。

4.2 破壞生物膜結構生物膜復雜的空間網(wǎng)狀結構使得抗真菌藥物無法直接作用于內部的真菌，其機械穩(wěn)定性取決于微生物分泌的胞外聚合物的組成和數(shù)量［22］，同時胞外聚合物作為抵御抗生素和生物殺菌劑擴散的第1 道防線，也限制了PS 的滲透［7］。由于PDT 涉及到活性氧物質的原位生成，生物膜結構上的重要元素很有可能被氧化破壞，從而削弱生物膜的完整性［23］。KHAN 等［20］利用體外實驗評估GNP 裝載MB 介導的PDT 對白色念珠菌ATCC90028生物膜結構的影響，用掃描電子顯微鏡觀察，與對照組比較，實驗組出現(xiàn)生物膜萎縮，菌絲完全破裂，并以不規(guī)則形狀物質的形式聚集，導致生物膜規(guī)則空間三維結構的消失，白色念珠菌生物膜結構被MB 介導的PDT 破壞。CARVALHO 等［9］研究證實20 μmol/L 的二氫卟酚e6 介導的PDT可有效改變白色念珠菌ATCC10231 生物膜結構，用光學顯微鏡觀察，與對照組比較，實驗組中酵母細胞和菌絲形成都大大減少，在生物膜結構中完全沒有絲狀形式。孫紅英等［24］利用共焦顯微鏡檢測5-氨基酮戊酸介導的PDT 對白色念珠菌ATCC90028 生物膜活性的抑制作用，計算殺菌率的變化，通過定量分析5-氨基酮戊酸介導的PDT 對生物膜結構的破壞效果，證實其對生物膜結構有一定的破壞作用。這種破壞生物膜結構的現(xiàn)象，在動物模型中也得到證實，SHERWANI 等［11］在雌性BALB/c 小鼠背部及口腔分別建立感染白色念珠菌ATCC90028 的模型，經組織病理學分析，證實單獨GNP-MB 組、GNP-TBO 組以及GNP-MB 和GNP-TBO 組介導的PDT 均可以減少小鼠舌背的酵母細胞和菌絲纖維的穿透，并且發(fā)現(xiàn)GNP-MB 和GNP-TBO 具有明顯的協(xié)同作用，從動物模型中可見GNP 能夠增強PDT 的抗生物膜能力，其抗生物膜作用在牙周炎和種植體周圍炎等牙科感染中有特殊應用［25-26］。迄今為止，在控制牙科生物膜感染的新方法中，PDT 是導致微生物耐藥概率最小的一種療法［27］。

4.3 殺滅生物膜內菌體生物膜本質上主要由菌細胞群體組成，PDT 是一種細胞毒性治療方法，它能引起細胞凋亡或壞死，研究證實PDT 在體內外均能殺死生物膜內的細胞［22］。SHI 等［10］體外研究發(fā)現(xiàn)經5 mmol/L 的ALA 孵育5 h，用波長為635 nm、不同能量密度（50、100、200、300 J/cm2）的紅光分別處理白色念珠菌ATCC90028 形成的生物膜，用LIVE/DEAD 真菌生存試劑盒進行快速免疫熒光染色，與對照組相比，白色念珠菌ATCC90028 生物膜中的細胞分別被抑制59.82%、67.95%、71.70%、74.45%。ROSSONI 等［28］體外研究白色念珠菌血清型A 和B 的生物膜對PDT 的敏感性。300 μmol/L 的MB 孵育5 min，波長660 nm，能量密度26.3 J/cm2的激光分別照射白色念珠菌A（ATCC36801）和白色念珠菌B（ATCC36802）形成的生物膜后，用無菌牙簽將生物膜細胞刮下壁，在超聲勻漿器中對于生物膜進行破壞后進行培養(yǎng)測定，與對照組相比，發(fā)現(xiàn)MB 介導的PDT使白色念珠菌A 和B 生物膜細胞分別減少了64%和99%。ERNáKOVá等［29］體外研究證實PDT 抗白色念珠菌生物膜的作用是顯著有效的，經1 mmol/L 的MB 孵育1 h ，波長為660 nm、輸出功率為190 mW/cm2的紅色激光分別處理氟康唑敏感菌株白色念珠菌SC5314 和氟康唑耐藥菌株白色念珠菌CY1123 形成的生物膜，能量密度為15、23、57 J/cm2時，敏感菌株和耐藥菌株生物膜的生存率分別為24.57%、23.46%、22.29%和40.28%、17.91%、5.89%。結合激光共聚焦顯微鏡觀察證實以活力菌絲為主的白色念珠菌SC5314 生物膜，PDT 的能力受到限制，增加能量密度并沒有提高PDT 抗生物膜的效率，而酵母形態(tài)為主的白色念珠菌CY1123 生物膜對PDT 更敏感，隨著能量密度的提高，PDT 抗生物膜的效率顯著增加。在PDT 中，PS 的選擇對抗菌療效至關重要，研究發(fā)現(xiàn)微生物細胞比哺乳動物細胞更具有明顯的負電荷，陽離子PS 選擇性的結合，與微生物細胞的結合相對較快，而哺乳動物細胞對陽離子PS 的吸收較慢［12］。

4.4 影響生物膜相關基因的表達白色念珠菌生物膜的基因表達與浮游細胞不同，其形成過程錯綜復雜，受多種調控機制的影響。分泌型天冬氨酸蛋白酶（SAP）、磷脂酶B（PLB）、脂肪酶（LIP）、菌絲壁蛋白1（HWP1）、凝集素樣序列（ALS）等基因在白色念珠菌生物膜中持續(xù)表達。FREIRE 等［30］研究了300 μmol/L 的MB 介導的PDT 處理9個白色念珠菌的臨床分離株（分別從9 例艾滋病患者口腔分離）和1 個白色念珠菌參考菌株ATCC18804，分析以上基因的表達情況，結果表明SAP5 基因的表達減少了60%，LIP9 和PLB2 基因的表達減少了50%，但與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，證明以MB 為PS 介導的PDT 對基因的表達僅有輕微的作用。此外，F(xiàn)REIRE 等［31］的另一個研究通過評價300 μmol/L 的MB 介導的PDT 和400 μmol/L 的赤蘚紅介導的PDT 對3 種白色念珠菌（1 種為標準菌株ATCC18804，另2 種分別從HIV 陽性患者和義齒口腔炎患者的臨床樣本中分離得出）生物膜的影響，應用實時定量聚合酶鏈反應檢測方法證實以上兩種PDT 組合均使白色念珠菌生物膜ALS3、HWP1、BCR1、TEC1、CPH1 和EFG1 基因表達均下調，毒力降低，而對照組中以上分析基因均無明顯的變化，同時通過分析這兩個PDT 組合抗白色念珠菌生物膜療效，兩者之間差異無統(tǒng)計學意義，但與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義。SHERWANI 等［11］轉錄分析研究表明GNP 介導的PDT 處理白色念珠菌ATCC90028 生物膜后，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義，對兩種重要基因ALS3 和HYR1 均有抑制作用。何淼等［32］體外研究標準株ATCC10231 和ATCC90028 形成生物膜的早期、中期和成熟期，分別提取總RNA，應用半定量逆轉錄-聚合酶鏈反應檢測8 個ALS 基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)在整個生物膜形成的時期，ALS1、ALS2、ALS3 和ALS5 持續(xù)高表達，是主要表達的黏附素基因，而ALS6、ALS7、ALS9，尤其是ALS4 則表達較弱。鄧可可等［33］研究也發(fā)現(xiàn)ALS3 的表達與白色念珠菌形成生物膜的能力相關。研究結果提示PDT 可能抑制白色念珠菌生物膜ALS 基因家族的其他有關高表達基因。

5 結語和展望

生物膜是導致人類微生物持續(xù)感染的主要原因。PDT 在治療復發(fā)和慢性生物膜感染有良好的前景。PDT具有多靶點，不僅能有效殺死微生物細胞本身，而且生成的活性氧物質可以通過攻擊大量生物分子削弱和降解基質結構、胞外聚合物。不同于傳統(tǒng)抗菌藥物的單一行為模式，PDT 既不引起微生物的耐藥性，也不受現(xiàn)有耐藥狀況的影響，其非特異廣譜殺菌性質意味著在感染病原體被鑒定以前就可以使用，雖然人類許多感染發(fā)生在身體深處，但是現(xiàn)在有可能通過內窺鏡儀器、窄直徑的間隙插入針、光纖將PS 和光傳送到幾乎任何解剖部位發(fā)揮抗菌作用，從而有效應對抗菌藥物耐藥性危機。目前相關研究主要集中在體外和動物模型實驗，臨床實驗研究較少。未來新型安全PS 的研發(fā)問題、可見光光源最適宜PS 的波段選擇以及機體對PDT 治療過程中產生的過敏反應問題，如果能得到進一步的研發(fā)和解決，將會是一個碩果累累的研究方向。隨著對生物膜作用機制的進一步研究以及實驗條件的優(yōu)化，PDT 的抗生物膜潛力將具有越來越高的臨床應用價值，尤其應用在醫(yī)療器械（如植入物和導管）生物膜感染以及艾滋病患者合并口腔念珠菌慢性感染的治療。