楊健莉，劉 佳，鄭志紅

(中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，沈陽 110122)

實驗大小鼠的使用在哺乳動物實驗中約為75%左右[1]，主要應(yīng)用于藥代動力學(xué)、毒理學(xué)、行為學(xué)、遺傳學(xué)以及腫瘤學(xué)等領(lǐng)域，對實驗大小鼠進(jìn)行血液采集是實驗操作過程中重要的實驗操作，不同的采血方法對動物組織損傷程度、采血間隔及采血量要求等各不相同；那么選擇適合的采血方法，獲得高質(zhì)量的血液樣本，是獲得良好動物實驗數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)。本文主要介紹幾種大小鼠常用的采血方法，對采血量的確定、采血頻率的選擇及不同采血方法對動物福利的影響進(jìn)行闡述，為實驗者在操作過程中選擇合適的采血方法提供依據(jù)。

1 常用的采血方法

依據(jù)采血位點不同實驗大小鼠常用的采血方法可分為鼠尾采血、眼眶采血、頸靜脈采血、隱靜脈采血、面部采血、心臟采血和腹主動脈采血；下面分別對不同的采血方法要點及應(yīng)用進(jìn)行介紹。

1.1 鼠尾采血

鼠尾采血主要包括尾尖采血、鼠尾刺血和尾靜脈穿刺采血，適用于少量多次采血。尾尖采血又稱剪尾采血，一般可采集血量：大鼠0.3～0.5 mL，小鼠0.1～0.2 mL；剪尾長度：小鼠不超過1 mm，大鼠不超過2 mm，最長剪尾長度均不超過5 mm；所采集血液為動靜脈混合血，不適用于老齡鼠[2]。鼠尾刺血常用于大鼠，一般可采集血量0.01～0.05 mL。尾靜脈穿刺采血可采集血量：小鼠0.1～0.15 mL，大鼠0.1～2 mL；常規(guī)方法選擇使用注射器采血，操作時應(yīng)注意抽拉速度，避免因為抽拉過快致使血管內(nèi)呈負(fù)壓，阻止血液流出，為此實驗人員將原有的注射式采血針進(jìn)行改進(jìn)，即選用真空采血管進(jìn)行血液采集[3]，有效的避免了使用注射器抽取血液因抽拉不均勻而產(chǎn)生的風(fēng)險。

從動物福利角度出發(fā)鼠尾采血應(yīng)優(yōu)先選擇用于需血量較少的連續(xù)多次采血，如血常規(guī)或血糖的動態(tài)監(jiān)測等[4]。

1.2 眼眶采血

眼眶采血是大小鼠常用的采血方法，采血量一般大鼠0.4～0.6 mL，小鼠0.2～0.3 mL，適于多次重復(fù)采血。采血后需要一段的組織修復(fù)時間，一般同一眼眶重復(fù)采血至少需要10 d的組織修復(fù)過程，否則會對采血量產(chǎn)生一定的影響[5]。大鼠眼眶采血常規(guī)方法即選用毛細(xì)玻璃管進(jìn)行內(nèi)眥取血，采血時選擇使用無菌的毛細(xì)玻璃管，可以有效降低眼周感染和眼部損傷，同時也應(yīng)保證毛細(xì)管周圍的平滑度從而將眼損傷降至最低[6]。一些文獻(xiàn)表明眼眶的多次取血會引起組織學(xué)改變，使動物臨床表現(xiàn)異常，出現(xiàn)不適[7]，從而對動物的晝夜節(jié)律性有一定的潛在影響，甚至最終導(dǎo)致動物死亡[2]。然而也有研究顯示重復(fù)進(jìn)行眼眶采血對動物的晝夜節(jié)律性沒有影響[8]，可用于進(jìn)行眼眶組織的長期研究[9]。

眼眶采血因其風(fēng)險性，英國實驗動物“3R”國際中心(簡稱NC3RS)[10]建議眼眶采血應(yīng)用于終末期實驗的采血，或動物處于全麻狀態(tài)下，且無其他可替代方法，并提供合理的科學(xué)依據(jù)。

1.3 頸靜脈采血

頸靜脈采血一般可采集血量為大鼠2～2.5 mL，小鼠0.3～0.5 mL。頸靜脈采血一般無需麻醉，直接從穿刺點進(jìn)針采集血液[11]，但是此種方法要求操作者技術(shù)嫻熟，而且由于動物未麻醉和相應(yīng)的器械固定，動物容易掙扎，增加進(jìn)針難度，易使動物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)造成皮下出血；對此楊萍等人[12]選擇麻醉后使用一次性真空采血管進(jìn)行采血，該方法操作簡捷、創(chuàng)傷小、采血量大，；但是多次大量采血時，由于動物長時間處于麻醉狀態(tài)，易損壞動物神經(jīng)系統(tǒng)，且一次性真空采血導(dǎo)管不適宜重復(fù)使用，此時套管技術(shù)的應(yīng)用大大彌補了重復(fù)采血多次進(jìn)針的不足，最大限度的降低了動物的痛苦以及不適感，通過此種方法可連續(xù)采集到血液樣本0.25 mL[13]；同時 可以對大鼠血流動力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行實時的檢測，有效的應(yīng)用于嚙齒動物膿毒血癥的模型中[14]。

頸靜脈采血所采集的血液質(zhì)量較高，單次采血一次可采集全身循環(huán)血量的15%，常應(yīng)用于藥代動力學(xué)研究，尤其頸靜脈套管技術(shù)的不斷應(yīng)用，為連續(xù)多次采血提供了便利。

1.4 隱靜脈采血

隱靜脈采血常用于大小鼠的少量血液采集，單次采血的安全采血量為動物體重的0.5%，間隔一天多次采血采血量為動物體重的0.05%，隱靜脈采血無需麻醉，待動物固定后，后腿外側(cè)區(qū)域剃毛后暴露采血點，采血針刺入采血點，即可獲得血液樣本；隱靜脈采血常用于藥代動力學(xué)研究，以及生化指標(biāo)和血液計數(shù)的檢測等[15]；由于在穿刺部位形成的痂可在后期輕輕擦掉，因此可從原來的穿刺點連續(xù)取樣[16]。

隱靜脈采血操作簡單，因其靜脈位置表淺，穿刺準(zhǔn)確性較高，操作過程無需麻醉，消除了麻醉劑對實驗結(jié)果的影響，有文獻(xiàn)研究表明隱靜脈采血可作為眼眶采血的替代方法用于相關(guān)實驗研究[17]。

1.5 面部靜脈采血

面部靜脈采血主要適用于成年小鼠，一般可采集血量約0.2～0.5 mL，常用采血位點為面靜脈和顳淺靜脈[18]，面部采血一般無需麻醉，待動物固定，確定采血點后采血針迅速刺入，獲得血液樣本； 面部采血可通過對面頰兩側(cè)分別采血進(jìn)行重復(fù)采血，所得血樣為動靜脈混合血。相較于面靜脈而言顳淺靜脈的應(yīng)用較少，因其靠近內(nèi)耳，血液采集時若操作不當(dāng)會損害內(nèi)耳，對動物造成不可避免的壓力和疼痛[19]；面部取血一般不適用于與血凝相關(guān)的實驗研究[20]，因為會有不可控的出血過多產(chǎn)生，小鼠可能面臨低血容量和死亡的風(fēng)險[21]。

因此面部取血的主要采血位點是面靜脈，其采血量較大，且操作過程無需麻醉，操作方法簡便快捷，對動物損傷較小，但因其有不可控的出血過多產(chǎn)生，所以應(yīng)避免應(yīng)用于與血凝相關(guān)的實驗研究。

1.6 心臟采血

心臟采血為無菌采血，采血量大，可采集血量大鼠1～1.5 mL，小鼠0.5～0.8 mL；此方法需在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行，操作時，選擇胸部左側(cè)心臟博動最強處進(jìn)針，緩慢回抽針筒可見血液流入針管，避免氣體進(jìn)入心臟研究發(fā)現(xiàn)不同性別的小鼠心臟采血后白細(xì)胞計數(shù)差異有顯著性，雌性小鼠白細(xì)胞計數(shù)最低，提示在白細(xì)胞計數(shù)和分化的研究中，動物性別和采血部位應(yīng)保持一致，確保實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性[22]。

心臟采血所采血液為循環(huán)血液，由于其會給動物帶來潛在的痛感，引起心包出血以及心包填塞等，故常用于實驗終末期的動物采血[1]；心臟采血中的右心室采血所得結(jié)果具有代表性，較優(yōu)于其它的終末采血方法[23]。

1.7 腹主動脈采血

適用于大、小鼠實驗終末期采血，可采集血量大鼠1.0～2.0 mL，小鼠0.8～1.2 mL；李學(xué)娟等人[24]通過動物麻醉固定后，解剖暴露腹主動脈的方式采集血液，此過程耗時30～60 s。李研等人[25]將采血針進(jìn)行了改良，采用真空采血管進(jìn)行采血，本法較傳統(tǒng)的腹主動脈采血法有“方便、快捷、準(zhǔn)確、不易凝血、不易溶血”等優(yōu)點。

腹主動脈采血法取血量大、不易溶血,適用于多項目檢測,不損傷器官不會出現(xiàn)因操作不當(dāng)造成氣栓與瘀血等,有利于病理組織學(xué)檢查，但操作比較復(fù)雜,技術(shù)性較強，應(yīng)注意掌握適宜的麻醉深度，防止心跳驟停、減少出血、及大鼠躁動[26]。

綜上所述，結(jié)合不同采血方法的特點，總結(jié)見表1。

2 采血方法的選擇

不同的采血方法采血量不同，且對動物福利的影響也不相同，因此我們應(yīng)結(jié)合實驗要求選擇最適合的采血方法。

2.1 采血量的選擇

實驗大鼠的循環(huán)血容量一般約為58～70 mL/kg，小鼠的循環(huán)血容量一般約為63～80 mL/kg[1]，動物的采血量一般與被采血動物的體重、采血頻率以及采血前是否給予補液有關(guān)系，且同種動物不同采血位點的采血量一般也不相同。每2～4周可以采集血量為循環(huán)血容量的10%，每7 d可以采集循環(huán)血容量的7.5%，每24 h可以采集循環(huán)血容量的1%[27]。

2.2 采血方法的選擇對實驗動物福利的影響

實驗中應(yīng)考慮不同的采血方法對動物福利的影響，在滿足“3R”原則的同時，應(yīng)選擇對動物的疼痛、組織損傷及壓力最小的采血方法，實驗過程中與壓力相關(guān)的福利指標(biāo)通常指血清或血漿中的皮質(zhì)酮水平、血糖值、生長激素或泌乳素、心率、血壓以及行為學(xué)等，依據(jù)不同的實驗?zāi)康目梢詫ρ簶颖具M(jìn)行相應(yīng)的福利指標(biāo)檢測[28]。

近些年大量文獻(xiàn)針對不同采血方法對動物福利的影響進(jìn)行了研究，Tsai等人[29]比較了大小鼠常用的五種采血方法對BALB/cO1aHsd小鼠動物福利指標(biāo)的影響，結(jié)果顯示在無麻醉少量采血時應(yīng)選擇眼眶采血，因其對動物的壓力最小，頸靜脈和面部靜脈的采血方法對動物的壓力最大，隱靜脈對動物的損害最持久；Aasland等人[30]將隱靜脈和尾靜脈兩種采血方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示尾靜脈采血尤其多次采血相較于隱靜脈會對動物造成更多的壓力；Shirasaki等人[11]比較頸靜脈穿刺和尾靜脈切割兩種采血方法，結(jié)果顯示尾靜脈切割相較于頸靜脈穿刺會更易產(chǎn)生溶血，兩種方法對動物產(chǎn)生的壓力相似，因此頸靜脈采血更適用血液變量等相關(guān)研究中的多次連續(xù)的大量采血；Holmberg等人[31]研究眼眶采血和面部采血對血友病小鼠的血液質(zhì)量和動物福利影響，結(jié)果顯示面部采血后FVIII小鼠會有失血過多產(chǎn)生，而眼眶采血僅引起了小鼠的輕微出血，且無臨床致盲現(xiàn)象，對動物的壓力較小，因此眼眶采血相較于面部采血更適用于凝血功能的檢測。

綜上可見，隱靜脈相較于尾靜脈更適合多次少量的采血，頸靜脈采血適合于多次連續(xù)的大容量采血，面部靜脈采血由于其采血后出血的不可控性，故不適宜應(yīng)用于與凝血功能相關(guān)的實驗研究，但其可用于無麻醉下多次采血的其他實驗研究。

3 小結(jié)

不同實驗所需要檢測的參數(shù)指標(biāo)不同，應(yīng)該根據(jù)自身的實驗性質(zhì)(是否涉及凝血功能等)選擇合適的采血方法，避免因為選擇不當(dāng)致使動物出血過多，發(fā)生致盲，組織損傷等損害；選擇適合的采血方法，明確實驗中所需血樣的特點，確定最適采血位點及采血頻率，熟練的掌握各種采血方法的操作技能，從而獲得良好的實驗數(shù)據(jù)，最大程度的降低了對實驗結(jié)果的影響。

表1 實驗大小鼠常用采血方法比較Table 1 Common methods of blood collection from rats and mice

注：*表示頸靜脈套管技術(shù)除外，套管技術(shù)需在麻醉的情況下進(jìn)行。
Note.*Except for the jugular cannula, which should be performed under anesthesia.