肖治均，張?zhí)?，潘婷?/p>

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大豆多糖顆粒劑的制備及對(duì)草酸鈣晶體生長(zhǎng)調(diào)控的研究＊

肖治均，張?zhí)?，潘婷?/p>

（商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000）

以大豆為原料提取大豆多糖（SPS），并以此為主要成分制備大豆多糖顆粒茶，擬開發(fā)出能夠用于防治泌尿系結(jié)石新制劑。通過(guò)多糖含量測(cè)定試驗(yàn)、溶化性試驗(yàn)、粒度試驗(yàn)、水分測(cè)定試驗(yàn)對(duì)大豆多糖顆粒劑進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。體外考察了多糖顆粒劑抑制草酸鈣結(jié)晶活性，著重考察了影響草酸鈣成核、生長(zhǎng)和聚集過(guò)程中的關(guān)鍵指標(biāo)，即最大誘導(dǎo)時(shí)間、成核抑制率和聚集抑制率。結(jié)果表明，和對(duì)照組相比，成核速率在0.466×10-3/min左右、聚集速率在0.108×10-3/min左右，最大誘導(dǎo)時(shí)間在15.33 min左右，成核速率和聚集速率均下降，且最大誘導(dǎo)時(shí)間增加，成核抑制率和聚集抑制率分別達(dá)到77.78%和72.91%，抑制效果明顯。

大豆多糖；大豆多糖顆粒茶；生長(zhǎng)調(diào)控；紫外分光光度法

1 引言

泌尿系統(tǒng)結(jié)石是世界范圍內(nèi)的常見(jiàn)病，且其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。歐美國(guó)家5～10年內(nèi)該病的復(fù)發(fā)率為40%～50%，在中國(guó)則高于75%.草酸鈣（CaOxa）是尿結(jié)石中主要的結(jié)石晶體，約占70%.而存在于尿液中的某些有機(jī)大分子，會(huì)在尿結(jié)石的形成過(guò)程中起到抑制或促進(jìn)作用。這些大分子不僅與尿結(jié)石形成與否密切相關(guān)，而且在結(jié)石鹽成核、生長(zhǎng)、聚集和固相轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1-3]。

生物大分子酸性粘多糖（GAGs）是目前研究較多的一類CaOxa結(jié)石抑制物。利用從天然產(chǎn)物中提取的多糖來(lái)抑制尿結(jié)石形成的研究日趨深入，張朝燕等對(duì)富含硫酸基的草葉馬尾藻多糖的防石活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明SGP對(duì)草酸鈣的成核、聚集抑制率分別為69.2%、76.8%；王淼等人的研究也表明降解海藻多糖不僅可以抑制晶體的生長(zhǎng)和聚集，而且可以誘導(dǎo)與尿路細(xì)胞粘附力較弱的晶體生物形成，從而減少草酸鈣晶體的生成。

大豆多糖（SPS）是從大豆中提取精制的水溶性多糖，具有抗氧化、抑菌、調(diào)節(jié)免疫活性等生物學(xué)功能。分子結(jié)構(gòu)類似球狀體，黏性較低，具有分散性、穩(wěn)定性、乳化性和黏著性等特點(diǎn)，其分子結(jié)構(gòu)與尿液中存在的尿石鹽抑制劑葡氨聚糖（GAGs）較為相似，可以清除羥基自由基，這使得SPS極有可能成為一種潛在的外源性綠色防石藥物。

本文將大豆作為原料提取大豆多糖（SPS），并以此為主要成分制備大豆多糖顆粒，擬開發(fā)出能夠用于防治泌尿系結(jié)石新制劑[4-9]。鑒于體內(nèi)對(duì)泌尿系統(tǒng)結(jié)石的研究較為困難，該類研究目前都是在體外進(jìn)行模擬研究，以此揭示尿石形成機(jī)理。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

大豆（陜西田源農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司），草酸鈉（天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠），無(wú)水乙酸鈉，無(wú)水氯化鈣，氯化鈉，苯酚，硫酸，三氯乙酸，蔗糖，糊精（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），乙醚（天津市化學(xué)試劑有限公司），丙酮，無(wú)水乙醇，95%乙醇（利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司），三氯甲烷（利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司），正丁醇（天津市化學(xué)試劑六廠）。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電熱恒溫水浴鍋HH-S6（北京科偉永興儀器有限公司），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9123A（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司），電子分析天平SI-2002（上海齊欣科學(xué)儀器廠），紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-1780（島津（中國(guó)）有限公司），離心機(jī)TD5A（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司），冰箱BCD-228UTMA（合肥美的榮事達(dá)電冰箱有限公司），超純水機(jī)ULUPUPE-H（四川優(yōu)普超純科技有限公司），高速中藥粉碎機(jī)XFB-200（吉首市忠誠(chéng)制藥機(jī)械廠），循環(huán)水真空泵SHZ-III（鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52（北京科偉永興儀器有限公司），藥典篩GB/T6003.1—1997（新鄉(xiāng)市同心機(jī)械責(zé)任有限公司），超聲波清洗機(jī)KQ5200E（昆山市超聲儀器有限公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

取適量葡萄糖對(duì)照品于105 ℃干燥至恒重，從中精密稱取50 mg置于500 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解定容，配制質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。

2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液0 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL于10 mL容量瓶中，蒸餾水定容至10 mL。從中量取1.0 mL的溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的苯酚溶液1 mL混勻，迅速加入5 mL濃硫酸，靜置10 min，搖勻，于30 ℃水浴中放置30 min，以0.0 mL為空白對(duì)照，于490 nm處測(cè)定不同濃度下的吸光度，并以對(duì)照品溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性回歸方程=9.414+0.040 8，2=0.990 4表明葡萄糖的質(zhì)量濃度在0～0.1 mg/mL之間與吸收度的線性關(guān)系良好。

2.2.2 大豆多糖顆粒的制備

將大豆多糖、蔗糖、糊精研磨過(guò)100目篩，再按多糖∶蔗糖∶糊精=1∶9∶10的比例稱取并混合均勻，將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇作為稀釋劑制軟材，20目篩擠壓制粒，于55 ℃鼓風(fēng)干燥60 min，10目、50目篩整粒[10]即得大豆多糖顆粒。

2.2.3 大豆多糖顆粒茶質(zhì)量檢查

顆粒劑主要質(zhì)量指標(biāo)的測(cè)定方法[11]如下。

2.2.3.1 多糖顆粒劑的含量測(cè)定

精確稱取大豆多糖顆粒200 mg溶于20 mL蒸餾水中過(guò)濾。從中精密量取1 mL于10 mL離心管中，加入5 mL無(wú)水乙醇，搖勻，靜置5 min，以4 000 r/min離心10 min，傾去上清，沉淀用蒸餾水溶解并定容至100 mL容量瓶中，作為供試樣品。精確吸取1mL供試樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算大豆多糖顆粒劑中多糖的含量。

2.2.3.2 溶化性試驗(yàn)

稱取制備的大豆多糖顆粒5 g，加熱水100 mL，攪拌5 min觀察顆粒溶解情況。

2.2.3.3 粒度試驗(yàn)

稱取制備的大豆多糖顆粒10 g，置于藥篩內(nèi)過(guò)篩，左右往返邊篩動(dòng)邊輕叩3 min，其中不能通過(guò)10目篩和能通過(guò)50目篩的顆?？偭坎怀^(guò)總顆粒質(zhì)量的15%.

2.2.3.4 水分測(cè)定試驗(yàn)

稱取制備的大豆多糖顆粒2 g，置于干燥且恒重的稱量瓶中，精密稱定后，打開瓶蓋在105 ℃干燥5 h，蓋好瓶蓋，移至干燥器中冷卻30 min，再次精密稱定。重復(fù)上述操作直到連續(xù)兩次稱重的差異不超過(guò)5 mg為止，計(jì)算含水量。根據(jù)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，供試品中含水量不得超過(guò)6%.

2.2.4 SPS抑制草酸鈣晶體生長(zhǎng)的活性檢測(cè)

用紫外分光光度法測(cè)出晶體成核、聚集的參數(shù)[9，12]。

2.2.4.1 測(cè)出晶體成核參數(shù)

臨用配置含1.0 mmol/L草酸鈉、200 mmol/L氯化鈉、10 mml/L醋酸鈉的混合溶液以及8.0 mmol/L的氯化鈣溶液。加入氯化鈉和醋酸鈉是為了將pH值調(diào)至5.7，此值最接近結(jié)石患者清晨尿液中的值。實(shí)驗(yàn)中所有的操作均在37℃的恒溫水浴箱中進(jìn)行，以此來(lái)模擬人類體溫。

先將1.0 mL氯化鈣溶液移至比色皿中并置于分光光度計(jì)中，然后加入1.0 mL含草酸鈉的混合溶液，此時(shí)得到的混合溶液為含有4 mmol/L鈣離子和0.5 mmol/L草酸根離子的亞穩(wěn)溶液。當(dāng)加入氯化鈣溶液后，在620 nm條件下每20 s分光光度計(jì)記錄一次，計(jì)錄30 min，此為空白組實(shí)驗(yàn)。

2.2.4.2 測(cè)出晶體聚集參數(shù)

臨用現(xiàn)配含1.5 mmol/L的草酸鈉，300 mmol/L的氯化鈉和15 mmol/L的醋酸鈉的混合溶液，以及12 mmol/L的氯化鈣溶液。以大豆多糖顆粒配置含SPS為0.01 g/100 mL的溶液作為抑制物。實(shí)驗(yàn)時(shí)所有的操作均在37 ℃的恒溫水浴箱中進(jìn)行。

先將1.0 mL氯化鈣溶液轉(zhuǎn)移到比色皿中并置于分光光度計(jì)中，再加入含草酸鈉的混合溶液和抑制物溶液各1.0 mL，以獲得4 mmol/L鈣離子和0.5 mmol/L草酸根離子的亞穩(wěn)溶液。當(dāng)加入氯化鈣溶液后，分光光度計(jì)每30 s記錄一次，記錄時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)至60 min左右。分光光度計(jì)使用前調(diào)至620 nm，并預(yù)熱20 min，平行測(cè)定3次。

3 結(jié)果與分析

3.1 大豆多糖顆粒劑的質(zhì)量檢測(cè)

3.1.1 多糖含量測(cè)定

大豆多糖顆粒劑中多糖的含量為4.43%.

3.1.2 溶化性試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)中，制備的大豆多糖顆粒隨著攪拌，逐漸崩解。溶解時(shí)間1 min左右，最終得到澄清透明的淡白色溶液。

3.1.3 粒度試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)中不能通過(guò)1號(hào)篩（10目）和能通過(guò)3號(hào)篩（50目）的顆粒總質(zhì)量為0.963 g，占總顆粒重的6.42 %，符合制劑相關(guān)要求。

3.1.4 水分測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果

兩次干燥稱重的差值為0.084 g，含水量為4.2%，符合制劑相關(guān)要求。

3.2 SPS顆粒劑抑制草酸鈣晶體生長(zhǎng)的活性檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定CaOx在620 nm處的吸光度值變化進(jìn)行SPS顆粒劑抑制草酸鈣晶體生長(zhǎng)的活性檢測(cè)?？瞻捉M的OD值變化曲線如圖1所示，由圖1可知，OD值變化趨勢(shì)為先升高后降低。其中在OD值上升階段：上升的OD值變化曲線斜率即為成核曲線速率，簡(jiǎn)寫為N；達(dá)到最大值時(shí)所需的時(shí)間稱為最大誘導(dǎo)時(shí)間，即max.在OD值下降階段：下降的OD值變化曲線斜率即為聚集曲線速率，簡(jiǎn)寫為A，而OD值下降的原因?yàn)橛捎诰w聚集從而導(dǎo)致微粒數(shù)減少，最終體現(xiàn)在OD值變化上。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較max、N和A參數(shù)值，以此評(píng)價(jià)SPS的抑制CaOx成核、聚集能力。

從圖1可看到，在沒(méi)有添加抑制物時(shí)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)大量晶體形成，吸光度逐漸達(dá)到最大值，之后因CaOx晶體的聚集OD值而逐漸下降。通過(guò)計(jì)算得max為8.67 min，N為2.1×10-3min-1，聚集速率A為0.4×10-3min-1。大豆多糖顆粒劑對(duì)草酸鈣晶體生長(zhǎng)影響活性檢測(cè)如圖2所示。SPS顆粒劑抑制草酸鈣晶體生長(zhǎng)的活性檢測(cè)如表1所示。

圖1 草酸鈣晶體生長(zhǎng)活性檢測(cè)

注：（a）（b）（c）為三組平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2和表1可知，與對(duì)照組相比，成核速率由原來(lái)的2.1×10-3min-1降低到0.466×10-3min-1左右，聚集速率由原來(lái)的0.4×10-3min-1降低到0.108×10-3min-1左右，最大成核時(shí)間由8.67 min延長(zhǎng)至15.33 min左右，且成核抑制率和聚集抑制率分別達(dá)到77.78%和72.91%.因此，大豆多糖顆粒溶液對(duì)草酸鈣晶體的成核、聚集能力具有良好的抑制效果。

表1 SPS顆粒劑抑制草酸鈣晶體生長(zhǎng)的活性檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)號(hào)評(píng)價(jià)指標(biāo) 成核速率SN聚集速率SA/min-1最大成核時(shí)間tmax/min成核抑制率/（%）聚集抑制率/（%） 10.5×10-30.105×10-314.3176.273.75 20.46×10-30.12×10-315.578.170 30.44×10-30.1 ×10-316.279.0575 均值0.466×10-30.108 ×10-315.3377.7872.91

注：成核抑制率=[1－（NM/NC）]×100%；聚集抑制率=[1－（AM/AC）]×100%

4 結(jié)論與討論

4.1 結(jié)論

以大豆多糖為主要原料制備的大豆多糖顆粒，其劑型符合顆粒劑相關(guān)質(zhì)量要求，多糖含量為4.43%.進(jìn)一步考察了大豆多糖顆粒茶對(duì)草酸鈣晶體生長(zhǎng)活性的影響，結(jié)果表明：加入大豆多糖顆粒茶后，N由2.1×10-3min-1降到0.466×10-3min-1左右、A由0.4×10-3min-1降到0.108×10-3min-1，max由8.67 min延長(zhǎng)至15.33 min，且成核抑制率和聚集抑制率分別達(dá)到77.78%和72.91%.由此可見(jiàn)，所制備的大豆多糖顆粒溶液對(duì)草酸鈣晶體的成核、聚集能力有良好的抑制效果。

4.2 討論

CaOx結(jié)石的病因與發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，在控制CaOx的發(fā)生率和復(fù)發(fā)率方面，還有很多研究工作要做。本課題研究的目的是探索大豆多糖存在下制備的顆粒劑對(duì)草酸鈣結(jié)石形成的影響，從而為人類防治結(jié)石提供新的思路。而由于人體的內(nèi)部環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的體系，制劑的主要成分在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過(guò)程使得制劑的作用發(fā)生很大的改變，因此，利用注射、灌胃口服等技術(shù)手段，設(shè)計(jì)合理的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，選擇科學(xué)的分析統(tǒng)計(jì)方法，將有利于研究大豆多糖顆粒劑在體內(nèi)環(huán)境對(duì)草酸鈣結(jié)石的影響，從而為結(jié)石類新藥篩選提供有利的保證。

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潘婷婷（1988—），女，山西臨汾人，助教，碩士學(xué)位，主要研究方向?yàn)橹兴庂Y源開發(fā)。

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：201611396007）

2095－6835（2019）02－0024－03

TS201.2

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2019.02.024

〔編輯：嚴(yán)麗琴〕