孫 憶 丁蘇芹 史益敏 唐東芹

(上海交通大學(xué)設(shè)計(jì)學(xué)院園林系，上海 200240)

花粉形態(tài)特征是由基因控制并在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中不斷演化而形成的，包含大量的遺傳信息，在進(jìn)化過(guò)程中具有保守性、可靠性和穩(wěn)定性，對(duì)研究植物的起源、系統(tǒng)發(fā)育、系統(tǒng)分類、品種演化、親緣關(guān)系等都具有重要意義[1～5]。此外，孢粉學(xué)標(biāo)記分析操作簡(jiǎn)單，在雜交育種中進(jìn)行花粉形態(tài)觀察，可作為分析品種間遺傳多樣性的指標(biāo)之一，可見(jiàn)其具有良好的實(shí)踐指導(dǎo)意義。因其分析方法簡(jiǎn)便，近幾十年來(lái)，孢粉學(xué)在眾多有花植物中得到廣泛應(yīng)用，其中包括不少觀賞植物。如通過(guò)觀察木蘭科4屬7種植物[6]、木蘭科16種含笑屬植物[7]、牡丹13個(gè)品種[8]、蓮31份種質(zhì)間[9]、微型月季10個(gè)品種[10]的花粉形態(tài)，均發(fā)現(xiàn)不同種質(zhì)之間具有一定差異，體現(xiàn)了不同分類等級(jí)種質(zhì)間存在不同程度的遺傳多樣性與遺傳分化。在球根花卉方面，對(duì)百合的孢粉學(xué)研究比較多。如張西麗等[11]對(duì)9種百合、吳祝華等[12]對(duì)12個(gè)百合野生種和6個(gè)栽培品種、張彥妮和錢燦[13]對(duì)百合屬4個(gè)野生種和8個(gè)栽培品種、顧欣等[14]對(duì)中國(guó)西部四省15種野生百合等，分別進(jìn)行了花粉形態(tài)觀察并分析了種質(zhì)間的親緣關(guān)系。此外，學(xué)者們也先后報(bào)道了鳶尾[15～17]、郁金香[18]、石蒜[19]等其它球根花卉的花粉形態(tài)特征，并探討了其系統(tǒng)學(xué)意義。

小蒼蘭(Freesiahybrida)是鳶尾科(Iridaceae)香雪蘭屬(Freesia)的多年生球莖花卉，現(xiàn)代意義上的小蒼蘭為其園藝雜交品種統(tǒng)稱，品種資源豐富，因其具有豐富花色且香氣濃郁的實(shí)出特點(diǎn)而深受世人喜愛(ài)，是著名的切花之一[20]。然而，迄今為止卻沒(méi)有關(guān)于小蒼蘭的花粉形態(tài)方面的報(bào)道。本研究選用多個(gè)小蒼蘭栽培品種，通過(guò)觀察比較其花粉形態(tài)，進(jìn)而利用孢粉學(xué)標(biāo)記探討小蒼蘭品種間的親緣關(guān)系，旨在為將來(lái)對(duì)小蒼蘭的種質(zhì)鑒定和利用雜交育種等手段開(kāi)展種質(zhì)創(chuàng)新等工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以15個(gè)小蒼蘭園藝品種(Freesiahybrida)作為試驗(yàn)材料開(kāi)展研究(表1)，包括5個(gè)自育品種[21]和10個(gè)進(jìn)口品種(均購(gòu)自荷蘭Van den bos公司，https://www.vandenbos.com/zh-cn)，均為單瓣型品種，其中包括白色系品種2個(gè)、黃色系品種4個(gè)、紅—紫紅色系品種6個(gè)以及紫色系品種3個(gè)。所有品種選擇健壯種球于2015年10月定植于上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院工程訓(xùn)練中心標(biāo)準(zhǔn)大棚中，進(jìn)行常規(guī)水肥管理。2016年2～4月在小蒼蘭各品種開(kāi)花期間采集花粉樣品進(jìn)行觀測(cè)。

表1 供試小蒼蘭品種一覽表

1.2 試驗(yàn)方法

天氣晴朗的上午選擇生長(zhǎng)健壯，無(wú)病蟲(chóng)害的植株采集花粉，裝入干燥器中并置4℃條件保存3d。將制備好的樣品輕彈于粘有導(dǎo)電膠的樣品臺(tái)上，用離子濺射儀(E-1045)鍍金屬膜，在掃描電子顯微鏡(TESCAN-MIRA/WITEC)下測(cè)量花粉的極軸(P)、赤道軸(E)的長(zhǎng)度并觀察記錄花粉的形狀、外壁紋飾等。

掃描電鏡的試驗(yàn)樣品制備與觀測(cè)照相在上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心完成。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

每個(gè)品種觀測(cè)10～15粒發(fā)育良好的花粉并選擇有代表性的視野拍照，P、E值測(cè)量后取平均值，花粉大小以P×E值表示，花粉形狀以P/E表示，其中P/E≥2為超長(zhǎng)球形，1.14≤P/E<2為長(zhǎng)球形[22]。針對(duì)所有定量數(shù)據(jù)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差和平均值計(jì)算其變異系數(shù)CV(%)。

利用SPSS軟件對(duì)花粉的外壁紋飾類型等定性數(shù)據(jù)以及極軸長(zhǎng)(P)、赤道軸長(zhǎng)(E)的平均值、P/E值等定量數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換后，定性數(shù)據(jù)采用二元數(shù)據(jù)(有記為1，無(wú)或極少記為0)表示，采用組間聯(lián)接結(jié)合歐氏距離法(平方Euclidean)進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小蒼蘭花粉的外部形態(tài)及外壁紋飾特征

用掃描電鏡對(duì)15個(gè)小蒼蘭品種的花粉形態(tài)進(jìn)行了觀察。從外形上看，小蒼蘭的花粉整體形狀為橢球體，所有品種花粉均呈單粒存在且兩側(cè)對(duì)稱，極面觀為舟形或心形，赤面觀為超長(zhǎng)球形或長(zhǎng)球形(圖1)?；ǚ劬呙劝l(fā)孔，且所有品種均為長(zhǎng)達(dá)兩極的單溝，但不同品種萌發(fā)孔的開(kāi)合狀態(tài)有所不同，萌發(fā)孔一開(kāi)始呈窄長(zhǎng)線形，隨著花粉成熟程度，逐漸由2頭向中間加寬，有些品種溝內(nèi)有不規(guī)則隆起，并且部分品種孔溝內(nèi)可見(jiàn)小顆粒狀突起(圖2)。從花粉的外壁紋飾來(lái)看，所有品種均有小刺狀突起，并且絕大多數(shù)具有穿孔和圓形斑紋，僅上農(nóng)橙紅和Red Passion沒(méi)有明顯穿孔，而Red River和Red Passion則沒(méi)有圓形斑紋(圖2)。

圖1 小蒼蘭花粉外形 A.花粉極面觀；B.花粉赤道面觀；C.萌發(fā)孔Fig.1 Pollen shape of Freesia A.Aperture in pollen；B.Pollen shape in equatorial view；C.Pollen exine ornamentation

圖2 小蒼蘭15個(gè)品種的花粉形態(tài)及表面紋飾 A.花粉萌發(fā)孔；B.花粉赤道面觀；C.花粉外壁紋飾特征 1.上農(nóng)乳香；2.上農(nóng)緋桃；3.上農(nóng)紫玫瑰；4.上農(nóng)橙紅；5.上農(nóng)黃金；6.Gold River；7.Fragrant Sunburst；8.Red River；9.Red Passion；10.Pink Passion；11.Snoozy；12.White River；13.Grumpy；14.Lovely Lavender；15.CastorFig.2 Pollen morphology and exine ornamentation of 15 Freesia cultivars A.Aperture in pollen；B.Pollen shape in equatorial view；C.Pollen exine ornamentation 1.SN Ruxiang；2.SN Feitao；3.SN Purple Rose；4.SN Orange；5.SN Huangjin；6.Gold River；7.Fragrant Sunburst；8.Red River；9.Red Passion；10.Pink Passion；11.Snoozy；12.White River；13.Grumpy；14.Lovely Lavender；15.Castor

圖3 小蒼蘭15個(gè)品種的花粉形態(tài)聚類圖Fig.3 Pollen morphology clustering map of 15 Freesia cultivars

測(cè)定發(fā)現(xiàn)，15個(gè)小蒼蘭品種的極軸長(zhǎng)(P值)為90～112.6 μm不等，變異系數(shù)為6.37%，其中只有4個(gè)品種的P值低于100.0 μm；赤道軸長(zhǎng)(E值)變化范圍為37.0～47.7 μm，變異系數(shù)為6.27%，Grumpy最短且為唯一一個(gè)E值低于40.0 μm的品種(表2)。進(jìn)而計(jì)算P/E值(表2)，按文獻(xiàn)劃分標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)所觀測(cè)小蒼蘭的花粉外形絕大部分為超長(zhǎng)球形(P/E≥2)，僅有Castor一個(gè)品種為長(zhǎng)球形(P/E為1.96)，其變異系數(shù)為8.65%。比較15個(gè)小蒼蘭的花粉大小(P×E)發(fā)現(xiàn)，Grumpy、Snoozy、Red Passion體積較小(<4 000 μm2)，而Fragrant sunburst、上農(nóng)紫玫瑰、上農(nóng)橙紅的體積較大(>4 800.00 μm2)，其中Grumpy最小(3 761.10 μm2)，而Fragrant sunburst最大(5 130.59 μm2)，兩者相差約36%，從該指標(biāo)的變異系數(shù)來(lái)看，是所有數(shù)量指標(biāo)中變化最大的，達(dá)到9.15%。

2.2 花粉形態(tài)聚類分析

根據(jù)以上觀測(cè)的花粉形態(tài)特征進(jìn)行聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在遺傳距離5以上的水平，可以將15個(gè)小蒼蘭品種分為5個(gè)類群，除Fragrant Sunburst單獨(dú)成一個(gè)類群外，每個(gè)類群均含3～4個(gè)品種(圖3)。

表2 小蒼蘭的花粉形態(tài)特征

第一類群包括上農(nóng)紫玫瑰、上農(nóng)橙紅、White River和Fragrant Sunburst共4個(gè)品種?；ǚ坌螤罹鶠槌L(zhǎng)球形，花粉表面均有圓形斑紋，此外，除上農(nóng)橙紅觀察到極少穿孔外，其它品種均有明顯穿孔。3個(gè)品種的極軸長(zhǎng)在101.2～112.6 μm，赤道軸長(zhǎng)在42.9～47.7 μm，P/E在2.13～2.56，花粉大小范圍為4 697.9～5 130.59，是所有品種中花粉第二大的一個(gè)類群。

第二類群包括Snoozy、Grumpy、Red Passion共3個(gè)品種。花粉形狀均為超長(zhǎng)球形，Snoozy和Grumpy的花粉表面明顯穿孔和圓形斑紋，而Red Passion則兩者飾紋均無(wú)。極軸長(zhǎng)在90.7～101.6 μm，赤道軸長(zhǎng)在37.0～42.5 μm，P/E在2.16～2.75，花粉大小范圍為3 761.1～3 851.86，是所有品種中花粉最小的一個(gè)類群。

第三類群包括上農(nóng)黃金、Pink Passion、Red River、Castor共4個(gè)品種，前3個(gè)品種的花粉形狀均為超長(zhǎng)球形，而Castor為長(zhǎng)球形。花粉表面均有穿孔，此外，除Red River沒(méi)有觀察到圓形斑紋外，其它品種均有明顯圓形斑紋。該類群的極軸長(zhǎng)在90～103.6 μm，赤道軸長(zhǎng)在41.3～46 μm，P/E在1.96～2.52，花粉大小范圍為4 144.15～4 273.23。

第四類群包括Gold River、Lovely Lavender、上農(nóng)乳香、上農(nóng)緋桃等4個(gè)品種，花粉形狀均為超長(zhǎng)球形，花粉大小居于前2個(gè)類群之間而成為第3大的類群。同時(shí)，它們的花粉表面均有明顯穿孔和圓形斑紋。4個(gè)品種的極軸長(zhǎng)在97.1～105.6 μm，赤道軸長(zhǎng)在42.3～46.0 μm，P/E在2.13～2.46，花粉大小范圍為4 386.84～4 541.93。

3 討論

花粉形態(tài)受到基因控制，遺傳性狀基本穩(wěn)定且受外界環(huán)境條件的影響很小，故孢粉分析已經(jīng)應(yīng)用于許多植物的分類和品種親緣關(guān)系分析[23]。作為較高分類依據(jù)的科與亞科之間，花粉形態(tài)微觀特征差異較大，同科不同屬之間差異相對(duì)較小，而品種間的差異更小，共同點(diǎn)多。簡(jiǎn)單萌發(fā)孔在演化水平上是原始的，復(fù)合萌發(fā)孔在演化水平上是進(jìn)化的[24]。本研究首次觀測(cè)了小蒼蘭的花粉形態(tài)，發(fā)現(xiàn)所有品種均具有遠(yuǎn)極單溝且屬于簡(jiǎn)單萌發(fā)孔，與同屬于鳶尾科的鳶尾屬植物[15～17]以及其它單子葉球根花卉如石蒜、百合、郁金香等的萌發(fā)孔相似[13,18～19]，同時(shí)，與在分類地位上屬于較原始的被子植物木蘭科植物[6～7]也是一致的。而如牡丹、蓮、薔薇屬等萌發(fā)孔則表現(xiàn)為更復(fù)雜的類型，分別為三擬孔溝、三溝花粉兼具部分散溝花粉和三孔溝[8～9,25]，這些植物應(yīng)屬于更進(jìn)化的類型。因此從花粉萌發(fā)孔的演化角度來(lái)看，包括小蒼蘭在內(nèi)的鳶尾科植物在植物類群中應(yīng)該屬于較原始的類群。此外，根據(jù)Erdtman[26]對(duì)花粉大小的劃分標(biāo)準(zhǔn)(大粒花粉的極軸平均長(zhǎng)度在50 μm以上，中?；ǚ墼?9.0～49.9 μm)，而大粒的花粉屬于原始的類型。因此，小蒼蘭屬于典型的大?；ǚ?，在進(jìn)化上應(yīng)屬于較原始的類群。

花粉由無(wú)結(jié)構(gòu)層向穿孔演化發(fā)展，再繼續(xù)演化成條紋狀類型，是孢粉學(xué)家達(dá)成共識(shí)的植物花粉表面紋飾進(jìn)化規(guī)律[27～28]?；ǚ弁獗诩y飾的差異可以從條嵴的有無(wú)、寬窄以及深淺等指標(biāo)反映出來(lái)，而且也可衡量被子植物進(jìn)化程度[22]。觀察發(fā)現(xiàn)，小蒼蘭花粉均呈單粒存在，因此屬于比較原始的類群，但有趣的是，在Pink Passion這個(gè)品種中發(fā)現(xiàn)有部分花粉存在條紋化、網(wǎng)狀化的趨勢(shì)，說(shuō)明該品種相對(duì)其它品種而言比較進(jìn)化。而觀測(cè)小蒼蘭花粉外壁紋飾發(fā)現(xiàn)，上農(nóng)橙紅和Red Passion沒(méi)有明顯穿孔，可以推測(cè)這兩個(gè)品種不如其它13個(gè)品種進(jìn)化。從文獻(xiàn)來(lái)看，小蒼蘭與同科的鳶尾屬植物相比較，兩者不僅在花粉外形存在差異，更在表面紋飾上存在明顯差異，鳶尾屬植物多數(shù)花粉呈現(xiàn)為扁球形并且有網(wǎng)狀紋飾[15～16,29]，小蒼蘭花粉的E值及P/E值明顯大于鳶尾屬植物。因此，從這個(gè)角度來(lái)看，鳶尾屬植物可能比香雪蘭屬植物更為進(jìn)化。

前人研究認(rèn)為，越進(jìn)化的花粉其調(diào)節(jié)功能越強(qiáng)，并且認(rèn)為花粉進(jìn)化程度與P/E值存在對(duì)應(yīng)關(guān)系，認(rèn)為(超)長(zhǎng)球形(高P/E值)花粉較扁球形(低P/E值)進(jìn)化[30]。本試驗(yàn)中的15個(gè)小蒼蘭品種花粉粒有超長(zhǎng)球形與長(zhǎng)球形2種類型，極軸長(zhǎng)/赤道軸長(zhǎng)比值(P/E)變化幅度為1.96～2.75，從這點(diǎn)上看，小蒼蘭總體上似乎又屬于較進(jìn)化的類群，這個(gè)結(jié)論與上述得出小蒼蘭屬于較原始類群正好相反?？梢?jiàn)，利用花粉特征分析植物的進(jìn)化關(guān)系需要綜合多方面指標(biāo)來(lái)考慮。

當(dāng)前市場(chǎng)上以切花四倍體小蒼蘭品種居多[31]，但也不乏一些二倍、三倍體品系混淆其中，這導(dǎo)致了現(xiàn)有品種遺傳背景變得更為復(fù)雜，給小蒼蘭種質(zhì)資源的分類和遺傳關(guān)系的研究造成了更多困難。有研究表明，植物的倍性與花粉大小等特征存在一定關(guān)系。如莊東紅等[32]研究發(fā)現(xiàn)，木槿氣孔器的長(zhǎng)度、寬度和花粉粒的大小與其染色體基數(shù)和倍性呈顯著正相關(guān)；王振江等[33]觀察廣東桑的花粉形態(tài)，也認(rèn)為花粉大小及結(jié)構(gòu)特征可作為其倍性鑒定的重要標(biāo)準(zhǔn)。本文中測(cè)定小蒼蘭品種花粉粒大小后發(fā)現(xiàn)，其范圍為3 761.10～5 130.59 μm2，總體差異較大，是所有觀測(cè)數(shù)量指標(biāo)中變異系數(shù)最大的一個(gè)指標(biāo)，可見(jiàn)現(xiàn)代小蒼蘭品種存在較豐富的遺傳多樣性。進(jìn)而利用花粉特征進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，花粉大小在劃分大類群時(shí)具有明顯的作用，有一定程度上意味著花粉大小可能與品種親緣關(guān)系存在較為密切的關(guān)系。因此，如若花粉粒大小與倍性成正比關(guān)系，我們可以在不便計(jì)數(shù)染色體時(shí)，根據(jù)成熟花粉粒的大小來(lái)估計(jì)植物的倍性水平，從而為種質(zhì)資源的分類和研究提供依據(jù)。

上述研究表明，花粉形態(tài)在小蒼蘭不同品種間存在較多的共性，但不同品種間花粉形態(tài)特征也具有一定差異，尤其是外壁紋飾細(xì)部特征和萌發(fā)器官的差別，體現(xiàn)了不同小蒼蘭品種間存在一定的遺傳多樣性和遺傳分化，可為品種間親緣關(guān)系及種質(zhì)鑒定等提供有價(jià)值的依據(jù)。根據(jù)花粉特征推測(cè)其進(jìn)化關(guān)系，總體上來(lái)看，小蒼蘭屬于較原始的類群。然而，單憑孢粉學(xué)的證據(jù)推測(cè)其進(jìn)化關(guān)系、判定品種間親緣關(guān)系可能會(huì)不夠全面，要進(jìn)行更全面的分析只有同時(shí)結(jié)合形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)及生物化學(xué)等多方面的結(jié)果，方可得出相對(duì)客觀的結(jié)論。