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(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 藥學(xué)部,貴州 貴陽(yáng) 550003)

復(fù)方腫節(jié)風(fēng)清咽合劑為貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，該制劑為耳鼻喉科臨床醫(yī)生在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐的基礎(chǔ)上，通過(guò)自主研發(fā)而成的中藥成方院內(nèi)制劑，經(jīng)過(guò)多年臨床觀察，療效確切，患者反映良好，并于2014年獲得醫(yī)院制劑批文( 批準(zhǔn)文號(hào): 黔藥制字Z20140036) 。復(fù)方腫節(jié)風(fēng)清咽合劑由腫節(jié)風(fēng)、麥冬、魚(yú)腥草、桔梗和紅花五味中藥組成，具有清熱解毒、消腫止痛、清利咽喉等功效，主要用于伴有咽喉腫痛、咽癢、咳嗽癥狀的扁桃腺炎，喉痹(急、慢性咽炎)，尤其對(duì)急性咽炎有良好的治療效果[1]。這個(gè)制劑后來(lái)在原有湯劑的工藝上進(jìn)行了劑型改進(jìn)，成為合劑[2]，具有使用方便、起霧效果好等特點(diǎn)，經(jīng)口腔黏膜超聲后，既起到局部理療的作用，又使藥液直達(dá)患處，具有抗炎、消腫止痛、清熱解毒、潤(rùn)喉利咽之功效。本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法對(duì)處方中腫節(jié)風(fēng)、桔梗、紅花進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法測(cè)定制劑中反丁烯二酸的含量，并對(duì)測(cè)定的方法學(xué)進(jìn)行了考察，結(jié)果證實(shí)檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠，可用于復(fù)方腫節(jié)風(fēng)清咽合劑的質(zhì)量控制?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)過(guò)程報(bào)道如下。

1 材料與儀器

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)試劑包括乙酸乙酯、甲醇、環(huán)己烷、甲酸、正丁醇、丙酮、三氯甲烷、乙腈(色譜純)、磷酸、雙重蒸餾水等；反丁烯二酸對(duì)照品(含量99.4%，批號(hào)：111541-201102，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，用于含量測(cè)定)；硅膠G板、硅膠H板(青島海洋化工廠)；聚酰胺薄膜板(浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠出品)。實(shí)驗(yàn)樣品由本院自制。

1.2 儀器

①Agilant 1260高效液相色譜儀(包括G1311C四元泵，G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G4212B 二極管陣列檢測(cè)器，G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器，G4212B DAD檢測(cè)器， G1311C四元泵，G1316A 1260柱溫箱，LC-1260色譜工作站)；②SK5210HP型超聲波清洗器；③ESJ182-4電子天平(十萬(wàn)分之一)；④98-1-B型電子調(diào)溫電熱套；⑤101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱；⑥ZF-20D暗箱式紫外分析儀；⑦DZKW-4型電子恒溫水浴鍋。

2 方法及結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 腫節(jié)風(fēng)鑒別 取本樣品15 mL，加入15 mL水稀釋，用60 mL乙酸乙酯分兩次萃取，合并乙酸乙酯萃取液，水浴蒸干，加1 mL甲醇溶解殘?jiān)?，作為供試品溶液。取缺腫節(jié)風(fēng)的陰性制劑15 mL，同法制備陰性對(duì)照液。另取腫節(jié)風(fēng)對(duì)照藥材2.0 g，濾液同供試品制備法制備對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取對(duì)照藥材溶液5 μL，其余兩種溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(8∶5∶1)的溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10 %硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱5 min，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾[3]。見(jiàn)圖1。

2.1.2 麥冬鑒別 取本品20 mL，加10 mL水稀釋，加入0.3 g硅藻土混勻，離心15 min，取上清液加鹽酸0.9 mL，小火微沸8 min，冷卻，用20 mL三氯甲烷分2次萃取，合并三氯甲烷液，水浴蒸干，殘?jiān)? mL甲醇使溶解，作為供試品溶液。取缺麥冬的陰性制劑20 mL，同法制備陰性對(duì)照液。另取麥冬對(duì)照藥材2.0 g，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液水浴蒸干，加水20 mL使溶解，按照以上“加鹽酸”同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取對(duì)照藥材溶液5μL，其余兩種溶液各10～15 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-丙酮(8∶2)的溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)清晰，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾[3]。見(jiàn)圖2。

2.1.3 紅花鑒別 取本品20 mL，加30 mL水稀釋，置分液漏斗中，用50 mL正丁醇萃取，分取正丁醇層，水浴蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用50 mL乙酸乙酯振搖提取，棄去乙酸乙酯層；水層用50 mL正丁醇振搖萃取，取正丁醇液，水浴蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液。取缺紅花的陰性制劑20 mL，同法制備陰性對(duì)照液。另取紅花對(duì)照藥材1.0 g，加80 %丙酮溶液50 mL，超聲3 0min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取對(duì)照藥材溶液3 μL，其余兩種溶液各5 μL點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(10∶2∶1∶0.2)的溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1 %三氯化鋁乙醇液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾[3]。見(jiàn)圖3。

2.2 反丁烯二酸含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為DIKMA Diamonsil?C18(5 μm,4.6 mm×250 mm),流動(dòng)相為乙腈-0.1 %磷酸溶液(2∶98)，二極管陣列波長(zhǎng)掃描范圍：190～360 nm，柱溫：30 ℃，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取反丁烯二酸對(duì)照品9.49 mg置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得對(duì)照品貯備液于5℃冰箱保存?zhèn)溆茫芪? mL置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。(每1mL含反丁烯二酸30.368 μg)。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取復(fù)方腫節(jié)風(fēng)清咽合劑樣品5 mL，置100 mL量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和缺腫節(jié)風(fēng)藥材的陰性空白溶液進(jìn)樣，見(jiàn)圖4。反丁烯二酸的保留時(shí)間為6.5 min，陰性空白色譜圖在反丁烯西二酸峰位置處無(wú)干擾峰，反丁烯二酸與其他組分分離完全(分離度>1.5)。理論板數(shù)以反丁烯二酸峰計(jì)算應(yīng)不低于6 000。

2.2.5 方法學(xué)考察 線性關(guān)系考察:精密量取反丁烯二酸對(duì)照品貯備液2 mL置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成15.184 μg/mL的對(duì)照品溶液，分別精密吸取該對(duì)照品溶液1、5、9、13、17、21、25 μL，注入液相色譜儀，以反丁烯二酸進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，線性回歸方程為：Y=8 310.4X+11.999，R2=0.999 8，反丁烯二酸在0.0151 84～0.379 6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。線性回歸曲線見(jiàn)圖5。

圖1 制劑中腫節(jié)風(fēng)薄層鑒別 圖2 制劑中麥冬薄層鑒別 圖3 制劑中紅花薄層鑒別

圖4 復(fù)方腫節(jié)風(fēng)清咽合劑的HPLC色譜

圖5 反丁烯二酸對(duì)照線性回歸曲線

精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液(15.184μg/mL)10μL按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣，結(jié)果反丁烯二酸的平均峰面積為1284.7835(n=6)；RSD為0.98%。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品(批號(hào)：20160601)，按“2.2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液(n=6)，進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，供試品中反丁烯二酸的平均含量為0.27mg/mL，RSD為0.83%，表明該方法的重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取重復(fù)性試驗(yàn)中的第一份供試液，考察0、2、4、6、10、12h測(cè)定反丁烯二酸峰面積，結(jié)果反丁烯二酸平均含量為0.26mg/mL，RSD為1.4%，說(shuō)明在12h內(nèi)供試液穩(wěn)定性良好。

回收率試驗(yàn)：精密吸取已知反丁烯二酸含量的復(fù)方腫節(jié)風(fēng)清咽合劑樣品(批號(hào)：20160601 反丁烯二酸含量0.271 42mg/mL)2mL，置100mL量瓶中，加入反丁烯二酸對(duì)照品溶液(0.303 5mg/mL)2mL，按供試品溶液的制備方法制備，進(jìn)樣10μL，測(cè)定，計(jì)算回收率。回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 復(fù)方腫節(jié)風(fēng)清咽合劑中反丁烯二酸回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.6 樣品測(cè)定 按上述供試品溶液制備，并按上述色譜條件測(cè)定8批復(fù)方腫節(jié)風(fēng)清咽合劑中反丁烯二酸的含量，按外標(biāo)法計(jì)算峰面積。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究，經(jīng)過(guò)多種提取方法和展開(kāi)系統(tǒng)的考察，最終確定對(duì)該制劑的質(zhì)量控制除腫節(jié)風(fēng)、紅花、麥冬可以定性鑒別外，在對(duì)應(yīng)的色譜中相應(yīng)的位置上，其余藥材均有陰性干擾，因此未能列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案中[4，5]；在反丁烯二酸定量方法建立時(shí)，分別采用了不同溶劑及不同時(shí)間下以直接稀釋法或超聲法制備供試品溶液，以水作為溶劑直接稀釋法制備樣品時(shí)反丁烯二酸含量較高且方法簡(jiǎn)便；同時(shí)還分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液的不同比例色譜條件，結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸溶液(2∶98)時(shí)分離度及峰型均較好，并通過(guò)回收率實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了本方法準(zhǔn)確可靠。反丁烯二酸的平均含量為0.2775mg/mL ，從大批量規(guī)模生產(chǎn)考慮，本品每毫升含反丁烯二酸的量，其限度以80%計(jì)算，換算成每瓶含(100mL/瓶)反丁烯二酸(C4H4O4)計(jì)，不得少于22mg。通過(guò)HPLC-DAD方法學(xué)的考察，證實(shí)該方法簡(jiǎn)便易操作，準(zhǔn)確度較高，可作為復(fù)方腫節(jié)風(fēng)清咽合劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

表2 八批樣品含量測(cè)定結(jié)果 (n=2)