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(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201)

AP1(APETALA1)基因?qū)儆贛ADS-box家族基因，它即可以對花分生組織進(jìn)行調(diào)控，又可以對花器官形態(tài)基因進(jìn)行調(diào)控[1]。通過轉(zhuǎn)基因表現(xiàn)出提前開花的形象[2-4]。由此說明，AP1基因具有促進(jìn)植物開花的作用，且AP1基因在不同植物間具有保守性。

隨著越來越多的動植物基因組數(shù)據(jù)的積累，生物信息學(xué)方法已經(jīng)成為研究基因家族序列特征和進(jìn)化關(guān)系的工具。當(dāng)選擇系數(shù)ω為非同義/同義突變率比值，即dN/dS，其可以反映生物體的進(jìn)化趨勢，當(dāng)ω>1，ω=1和ω<1分別代表在進(jìn)化過程中基因承受正向選擇、中性選擇和純化選擇[5]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已克隆出的被子植物較原始類群三白草(Saururus chinensis)基因AP1，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，分析AP1基因在三白草不同組織中的表達(dá)，并使用生物信息學(xué)方法構(gòu)建AP1基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，并對AP1基因做生物進(jìn)化選擇壓力分析，以期發(fā)現(xiàn)較原始類群植物三白草與其它植物間的親緣關(guān)系及其在植物進(jìn)化中承受的選擇壓力。

1 材料與方法

1.1 目的基因的獲取

1.1.1 三白草總RNA的提取及純化

使用Trizol法分別提取三白草幼葉、不同發(fā)育時(shí)期中，包括變白過程(半綠、半白)葉和褪白過程(半綠、半白)葉，完全變白葉、完全褪白葉和花中總的RNA。并純化去除DNA和其余雜質(zhì)。采用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量。

1.1.2 PCR獲取目的基因

將上步所得RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)已克隆的AP1基因設(shè)計(jì)PCR引物(表1)。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序按試劑使用說明操作。

表1 PCR引物

1.2 AP1基因克隆與CDS序列的篩選

用Race技術(shù)從三白草中克隆獲得AP1基因，包括AP1a和AP1b2個同源序列。從NCBI下載的29個不同物種的AP1基因。以ATG為起始密碼子，以TAA、TAG或TGA為終止密碼子從NCBI上篩選(如表2)。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)已下載的各不同物種的AP1基因的CDS序列，進(jìn)行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用于研究它們之間的差異和各物種之間的進(jìn)化關(guān)系。使用MEGA 7.0軟件[7]進(jìn)行分析，AP1基因序列的多重比對使用Clustal X軟件完成，參數(shù)使用默認(rèn)值。然后采用鄰接(neighbor-joining)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[8]，自舉值為1 000，驗(yàn)證進(jìn)化樹的可信程度。

1.4 AP1基因編碼蛋白的進(jìn)化選擇壓力分析

使用PAML 4.9軟件中codeml.exe程序?qū)P1蛋白所經(jīng)歷的選擇壓力進(jìn)行分析?；诒狙芯孔越ㄟM(jìn)化樹及CDS序列多重比對結(jié)果，對31個CDS序列編碼蛋白進(jìn)行選擇壓力分析，位點(diǎn)模型為M 0、M 1、M 2、M 3、M 7和M 8。利用似然比檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)來評估成對模型：M 0 VS M 3，M 1 VS M 2和M 7 VS M 8，檢測是否存在正選擇位點(diǎn)，其結(jié)果遵從x2分布，自由度為2個模型的參數(shù)之差。

表2 AP1基因序列登錄號

2 結(jié)果與分析

2.1 獲取目的基因

使用PCR克隆得到三白草AP1a和AP1b2個同源基因，由于在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格控制了模板的使用量，因此，電泳檢測結(jié)果能一定程度反映不同組織中目的基因的相對表達(dá)量。AP1a和AP1b2個同源基因，在花中的表達(dá)均高于在葉中，然后在變白和退白 的白葉部分表達(dá)量比較高，AP1b基因在三白草各個組織中的表達(dá)結(jié)果如圖1。

2.2 AP1基因CDS序列的同源性分析

使用ClustalX 2.1軟件對三白草AP1a、AP1b和選用的29個物種的AP1基因的CDS序列做多重序列比對(如圖2)，并使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹輸出為tree文件。

注：1為幼葉；2為變白過程的一半綠葉；3為變白過程的一半白葉；4為完全變白葉；5為褪白過程的一半白葉；6為褪白過程的一半綠葉；7為完全褪白葉；8為花。圖1 AP1b基因在不同組織中的克隆

從序列比對結(jié)果可以看出，魚腥草(AB 089153.1)與三白草AP1a的同源性最高；AP1a和AP1b的同源性很高，但也存在一些差異；小百合(AB 618669.1)、水稻(AB 041020.1)、文心蘭(KC 426946.1)與三白草的2個AP1同源基因的同源性也很高，其余植物根據(jù)不同科屬與三白草的2個AP1同源基因的同源性較高，但差異逐漸增加。

2.3 AP1基因編碼氨基酸序列的同源性及結(jié)構(gòu)域分析

使用ClustalX 2.1軟件對三白草AP1a、AP1b和其它物種比對結(jié)果，如圖3。結(jié)果顯示，AP1氨基酸序列的5'端保守性較高，3'端保守性較低，在3'端存在單子葉植物AP1/SQUA基因所特有的paleoAP1(LPPWML)結(jié)構(gòu)域。

圖3 AP1蛋白結(jié)構(gòu)域

2.4 AP1基因編碼蛋白的進(jìn)化選擇壓力分析

通過不同的模型對AP1 2個同源基因編碼蛋白AP1a和AP1b進(jìn)行了分析。通過codeml程序的算法對AP1a和AP1b編碼蛋白進(jìn)行分析得到不同模型M 0、M 1、M 2、M 3、M 7、M 8的相關(guān)參數(shù)(表3)。與模型M 1、M 0、M 7相對應(yīng)的M 2、M 3及M 8的假定條件均允許ω值大于1，即M 2、M 3及M 8的假定中均有正選擇位點(diǎn)，通過相對應(yīng)的2個模型進(jìn)行LRT(likelihoodratiotest)[9]統(tǒng)計(jì)來確定模型是否顯著。從表4可以看出，AP1蛋白的M 0模型預(yù)測的ω值遠(yuǎn)小于1，但是在LRT檢驗(yàn)中M 3模型優(yōu)于M 0模型，而M 2模型并不優(yōu)于M 1模型，M 8模型也并不優(yōu)于M 7模型。6個模型的結(jié)果均顯示ω<1，說明AP1在進(jìn)化過程中承受負(fù)選擇，AP1基因松弛產(chǎn)生功能不同的拷貝。而在幾個模型中并未檢測到陽性選擇位點(diǎn)。

表3 AP1蛋白適應(yīng)性進(jìn)化分析

3 討 論

AP1基因已經(jīng)在多種植物中得到克隆且AP1基因在植物中具有很高的保守性。本研究在已克隆三白草AP1基因的2個同源基因的基礎(chǔ)上，比較不同物種中AP1基因的表達(dá)和在進(jìn)化過程中承受的進(jìn)化選擇壓力。結(jié)果顯示，AP1a基因和AP1b基因在花中的表達(dá)明顯高于葉中，這與前人研究吻合。AP1基因的多重序列比對結(jié)果顯示，三白草AP1同源基因AP1a基因的核酸序列與魚腥草相比有最高的同源性，而AP1b基因與魚腥草和AP1a基因雖然同源性很高，但也存在較多的序列差異，AP1a基因和AP1b基因的核酸序列與小百合，水稻和文心蘭也有較高的同源性。這說明AP1基因在不同植物間有所保守，但在同一個物種中AP1基因又存在著分化。

三白草AP1a、AP1b和其它物種的AP1編碼氨基酸序列多重序列比對結(jié)果顯示，AP1 3′端具有單子葉植物AP1/SQUA基因所特有的paleoAP 1(LPPWML)結(jié)構(gòu)域。

表4 AP1蛋白陽性選擇位點(diǎn)

通過對31個AP1基因編碼蛋白的進(jìn)化選擇壓力分析，反映出AP1基因在系統(tǒng)發(fā)育的過程中主要經(jīng)歷了純化選擇。但未在研究中檢測到陽性選擇位點(diǎn)，推測AP1基因在進(jìn)化過程中有較高的保守性。在系統(tǒng)發(fā)育樹中也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。但實(shí)際上在長期的進(jìn)化過程中氨基酸序列會發(fā)生大量的非同義突變，這些突變大部分是有害的，而當(dāng)AP1基因出現(xiàn)基因松弛時(shí)，就可以出現(xiàn)多個拷貝，出現(xiàn)的不同結(jié)構(gòu)有：a基因功能喪失；b基因亞功能化；c基因新功能。本研究使用的三白草2個AP1的同源基因，也說明AP1基因在三白草中有松弛現(xiàn)象，從多重序列比對結(jié)果可以看出，AP1a基因和AP1b基因同源但又有較大的差異，猜測有可能是出現(xiàn)了基因的新功能化。但AP1基因在三白草中出現(xiàn)了哪些新功能還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。