，，， ，，葉斌，，，

(1.東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.江西環(huán)境工程職業(yè)學(xué)院，江西 贛州 341000)

繁育系統(tǒng)是指控制植物種群或分類(lèi)群中自體受精或異體受精相對(duì)頻率的生理、形態(tài)機(jī)制，決定著植物的進(jìn)化路線(xiàn)和表型變異[1]。研究一種物種的進(jìn)化歷史或過(guò)程，須加強(qiáng)對(duì)繁育系統(tǒng)多樣化的研究，結(jié)合其作用機(jī)制和運(yùn)作模式，從而理清它們的進(jìn)化路線(xiàn)[2]。植物的繁育系統(tǒng)主要包括花部綜合特征、開(kāi)放式樣、性器官壽命、媒介種類(lèi)和頻率、自交親和性及交配系統(tǒng)，而交配系統(tǒng)作為繁育系統(tǒng)的核心，在植物種群進(jìn)化中發(fā)揮著舉足輕重的作用[3]。

紅丁香(Syringavillosa)系木犀科丁香屬觀花灌木，主要分布在遼寧、河北、山西、陜西、甘肅等地[4]。其成年植株枝葉繁茂，花序豐滿(mǎn)，花色絢爛，耐寒、抗旱性強(qiáng)。紅丁香根系發(fā)達(dá)，可用于涵養(yǎng)水源，利于水土保持，是城市綠化中不可或缺的觀花、觀形植物。此外，紅丁香可吸附二氧化硫、氟化氫等有毒氣體。有研究表明，從紅丁香的花朵中可提取丁香酚用于消炎止痛，其根、莖亦可入藥，有清新解熱、鎮(zhèn)咳止痰之效[5]。

前人已有在紅丁香解剖結(jié)構(gòu)[6-7]、繁殖技術(shù)[5,8]等方面進(jìn)行了研究相關(guān)報(bào)道，但都較為零散。紅丁香在園林綠化中具有十分重要的價(jià)值，但長(zhǎng)期的無(wú)性繁殖導(dǎo)致其品種退化，氣候和其他因素導(dǎo)致其花期不穩(wěn)定，花期縮短，極大地影響了紅丁香的觀賞效果。本試驗(yàn)擬從紅丁香生殖特性角度出發(fā)，對(duì)其花部綜合特征、開(kāi)花動(dòng)態(tài)、繁育系統(tǒng)、結(jié)實(shí)特點(diǎn)等進(jìn)行系統(tǒng)研究，揭示其繁殖規(guī)律，為紅丁香常規(guī)雜交育種提供理論依據(jù)，同時(shí)為提高其在城市綠化中的應(yīng)用推廣提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與區(qū)域環(huán)境

試驗(yàn)材料為引種至黑龍江省森林植物園的壯齡紅丁香(東經(jīng)126°42′，北緯45°04′)，露地栽培。該地屬中溫帶大陸性季風(fēng)氣候，全年平均氣溫為19～23 ℃，平均降水量為569.1 mm，花期內(nèi)平均氣溫為11～23 ℃，平均降水量為58.4 mm。正常水肥管理。試驗(yàn)于2017年和2018年的5—9月進(jìn)行。

1.2 研究方法

1.2.1 花部特征、開(kāi)花動(dòng)態(tài)及花期判定

在紅丁香進(jìn)入始花期前，選取15株植物進(jìn)行掛牌標(biāo)號(hào)，觀察并記錄單株花期，按照Dafni[9]的方法，以群體水平有5%以上的個(gè)體開(kāi)花時(shí)視為始花期，50%的個(gè)體達(dá)到開(kāi)花高峰時(shí)視為群體開(kāi)花高峰期，95%的個(gè)體開(kāi)花結(jié)束時(shí)視為群體花期結(jié)束。記錄紅丁香的單株花期。隨機(jī)標(biāo)記15個(gè)植株的90個(gè)花序，每天觀察1次花序發(fā)育狀況，直至花朵完全枯萎或坐果開(kāi)始，計(jì)算單花序和單花花期[10]。

隨機(jī)選取盛花期的單朵30朵，用游標(biāo)卡尺測(cè)量花冠直徑、柱頭長(zhǎng)度、花絲長(zhǎng)度等各項(xiàng)指標(biāo)。在Nikon SMZ 800型體式解剖鏡下對(duì)花朵進(jìn)行實(shí)體解剖，并用奧林巴斯CX 31型顯微鏡觀察花朵各部分構(gòu)造特點(diǎn)。取紅丁香新開(kāi)放的花朵15朵，清潔后將柱頭、花粉粒、授粉后的柱頭分離，經(jīng)2.5%戊二醛和1%鋨酸雙固定，0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗，乙醇梯度70%、85%、95%、100%脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點(diǎn)干燥，粘樣和噴金后用XL 30 ESEM環(huán)境掃描電鏡選取不同角度觀察并拍照，了解其結(jié)構(gòu)形態(tài)[11]。

1.2.2 花粉活力測(cè)定與柱頭可授性檢測(cè)

從紅丁香單花開(kāi)放第1天開(kāi)始進(jìn)行花粉活力測(cè)定。采用離體萌發(fā)法測(cè)定花粉活力[12]。用毛筆蘸取少量花粉，使之均勻分散于滴有培養(yǎng)液(0.15%聯(lián)苯胺︰0.5% α-萘酚∶0.25%碳酸鈉=1︰1︰1、0.3%過(guò)氧化氫溶液各1滴)的凹面載玻片上，蓋好蓋玻片，置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，25 ℃下恒溫箱中培養(yǎng)4～6 h。于顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況。按照相同方法制作3個(gè)載玻片，每個(gè)載玻片每次觀察3個(gè)視野，以花粉粒大于50個(gè)的視野作為1個(gè)有效視野，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。當(dāng)花粉管長(zhǎng)度超過(guò)花粉直徑時(shí)認(rèn)作花粉萌發(fā)。

觀察花朵開(kāi)放過(guò)程中柱頭分泌粘液的情況。聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法檢測(cè)柱頭可授性[13]。開(kāi)花前1天開(kāi)始每天采集單花柱頭，滴1滴聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫反應(yīng)液(1%聯(lián)苯胺︰3%過(guò)氧化氫︰水=4︰11︰22，體積比)到凹玻片上，把柱頭浸入反應(yīng)液中，顯微鏡下觀察。一定范圍內(nèi)柱頭四周出現(xiàn)藍(lán)色或紫黑色的氣泡越多，柱頭可授性越強(qiáng)。每天采集30朵單花，記錄檢測(cè)結(jié)果。

1.2.3 花粉/胚珠比測(cè)定

采用血球計(jì)數(shù)器法測(cè)定[14]。隨機(jī)采取植株上剛剛開(kāi)放且花藥未開(kāi)裂的單花15朵，拔取充分成熟的花藥90枚，平均放入3個(gè)青霉素小瓶?jī)?nèi)。等待花藥自然干燥、充分散出時(shí)，每瓶種滴入2 mL 1%的六偏磷酸鈉，加蓋充分震蕩使花粉處于懸浮狀態(tài)。吸取1滴懸浮液滴于血球計(jì)數(shù)伴上，在顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。重復(fù)5次，取平均值。

單花花藥花粉量n=(400個(gè)小方格內(nèi)總花粉數(shù)×10 000×2)/30；

單花花粉量N=n×3.5[15]。

解剖單花子房，用解剖鏡觀察并記錄胚珠數(shù)量。計(jì)算P/O。P/O=單花花粉量/胚珠數(shù)。根據(jù)Cruden[16]的標(biāo)準(zhǔn)，P/O為2.7～5.4 時(shí)，其繁育系統(tǒng)屬于閉花受精型；P/O 為18.1～39.0時(shí)，繁育系統(tǒng)為專(zhuān)性自交型；P/O 為31.9～396.0時(shí)，繁育系統(tǒng)為兼性自交型；P/O 為244.7～2 588.0時(shí)，繁育系統(tǒng)為兼性異交型；P/O 為2 108.0 ～ 195 525.0時(shí)，繁育系統(tǒng)為專(zhuān)性異交型。

1.2.4 雜交指數(shù)估算

根據(jù)Dafni[9]的標(biāo)準(zhǔn)估算雜交指數(shù)。 1) 單花直徑<1 mm記為0；1～2 mm記為1；2～6 mm記為2；>6 mm記為3。 2) 計(jì)算柱頭可授和花藥開(kāi)裂之間的時(shí)間間隔，雌蕊先成熟或兩者同時(shí)成熟記為0；雄蕊先成熟則記為1。 3) 觀察柱頭相對(duì)于花藥的位置關(guān)系，同一水平記為0；空間分離記為1。OCI為以上3個(gè)指標(biāo)之和，判斷標(biāo)準(zhǔn)為：OCI=0時(shí)，繁育系統(tǒng)為閉花受精型；OCI=1時(shí)，繁育系統(tǒng)為專(zhuān)性自交型；OCI=2時(shí)，繁育系統(tǒng)為兼性自交型；OCI=3時(shí)，有時(shí)需要傳粉者，繁育系統(tǒng)為自交親和；OCI=4時(shí)，異交，需要傳粉者，繁育系統(tǒng)為部分自交親和。

1.2.5 不同授粉方式的座果率

采用套袋試驗(yàn)研究紅丁香的授粉結(jié)實(shí)率。試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)處理，每處理隨機(jī)標(biāo)記30朵單花，3次重復(fù)。處理方法(T)分別為：T 1，不去雄，不套袋，自然授粉；T 2， 不去雄，套袋，自花授粉；T 3，去雄，套袋，人工同株異花授粉；T 4，去雄，套袋，人工異株授粉； T 5，去雄，套袋，不授粉；T 6，去雄，不套袋，自然授粉。果實(shí)成熟后收集，統(tǒng)計(jì)座果率。

座果率(%)=(每花序不同位置的座果數(shù)/每花序不同位置的單花數(shù))×100%。

1.2.6 種子產(chǎn)量與構(gòu)成因素測(cè)定

種子成熟時(shí)隨機(jī)選取花序30個(gè)，分別統(tǒng)計(jì)每花序單花數(shù)、單花胚珠數(shù)、種子單粒質(zhì)量、單花序種子產(chǎn)量，計(jì)算單花序潛在種子產(chǎn)量。

單花序潛在種子產(chǎn)量=每花序單花數(shù)×單花胚珠數(shù)×平均種子單粒質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅丁香的開(kāi)花物候及單株、單花序、單花水平上的花期

統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2017年紅丁香5月22日進(jìn)入始花期，5月28日進(jìn)入盛花期，5月28—30日為最佳觀賞期，6月10日花期結(jié)束。整個(gè)群體花期持續(xù)約 20 d。2018年紅丁香的開(kāi)花物候較2017年稍晚，于5月25日進(jìn)入始花期，6月3日達(dá)到開(kāi)花高峰，6月12日花期結(jié)束。整個(gè)群體花期持續(xù)19 d。2年紅丁香的開(kāi)花進(jìn)程基本類(lèi)似，均為單峰曲線(xiàn)。紅丁香單株具花序約48個(gè)，單株花期約20 d，單株盛花期3 d。單花序花期為8～9 d。單花花期為4～5 d。

相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，紅丁香花序的始花時(shí)間、花期長(zhǎng)度、開(kāi)花數(shù)目、座果率之間存在顯著關(guān)系(表1)。其中花期長(zhǎng)度與開(kāi)花數(shù)目呈顯著正相關(guān)。座果率與花期長(zhǎng)度也呈顯著正相關(guān)關(guān)系。始花時(shí)間與花期長(zhǎng)度、座果率之間呈顯著負(fù)相關(guān)。說(shuō)明開(kāi)花時(shí)間越早、花期越長(zhǎng)的花序座果率越高。這可能與花期內(nèi)花序的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)有關(guān)，晚開(kāi)花的花序較難獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致座果率降低。

表1 始花時(shí)間、開(kāi)花數(shù)目、花期長(zhǎng)度及座果率的相關(guān)分析

注：“*”表示在0.01水平上差異顯著，“**”表示在0.005水平上差異顯著。

2.2 紅丁香花部特征及其開(kāi)放動(dòng)態(tài)

觀察發(fā)現(xiàn)，紅丁香花蕾初期為淺綠色，隨著花朵的生長(zhǎng)，其逐漸膨大并變?yōu)榈霞t色?；ㄐ?yàn)轫斏鷪A錐花序(圖版Ⅰ-A～B)，合瓣花，花色為淡粉紅色或白色，花冠直徑(1.02±0.07)cm，花冠筒長(zhǎng)(1.44±0.06)cm，圓筒形，4裂，少數(shù)5裂。紅丁香的花為典型的柱頭縮入式雌雄異位，復(fù)雌蕊，位于花冠筒中下部，長(zhǎng)度(0.31±0.04)cm，花柱細(xì)長(zhǎng)，柱頭2裂。子房呈卵球形，2心室，每心室1～2個(gè)胚珠。雄蕊黃色，2枚，少數(shù)3枚，長(zhǎng)度(1.16±0.07)cm，著生于花冠筒上部略偏下位置，貼壁生長(zhǎng)。花藥初期為黃綠色(圖版Ⅰ-I)，后逐漸成熟并轉(zhuǎn)為黃色?；ǘ溟_(kāi)放時(shí)，由內(nèi)展至直角狀外展，裂片為卵圓形，先端具內(nèi)彎兜狀喙(圖版Ⅰ-C～H)。

紅丁香花被片呈淡粉色，表面光滑，細(xì)胞表面有絮狀物，多為皺紋狀(圖版Ⅱ-F)。 柱頭表面未見(jiàn)明顯分泌物，為干柱頭，表面褶皺較多(圖版Ⅱ-A～D)?；ǚ蹫閱瘟?，較大，20.2～24.3 φ 32.0～37.8μm。赤道觀呈長(zhǎng)橢圓形，具三孔溝。外壁表面粗網(wǎng)狀，網(wǎng)脊較光滑，網(wǎng)眼呈不規(guī)則多邊形，轉(zhuǎn)角光滑，三條溝長(zhǎng)至兩端(圖版Ⅱ-E)。

注：A、B為單個(gè)花序；C為單花花蕾期；D為單花開(kāi)放初期；E為單花完全開(kāi)放；F、G為單花開(kāi)放末期；H為單花開(kāi)放動(dòng)態(tài)；I為單花縱剖形態(tài)；J為未成熟果序；K為成熟果序；L為種子。圖版Ⅰ 紅丁香花序及單花開(kāi)放動(dòng)態(tài)

2.3 花粉活力和柱頭可授性

紅丁香開(kāi)花第1天的花粉萌發(fā)率為34.7%，第2、3、4 天分別為12.1%、9.2%、3.1%，第5天花粉活力幾為0?；ǚ刍盍?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅丁香花粉萌發(fā)率隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低。柱頭可授性檢測(cè)結(jié)果表明，紅丁香的柱頭可授性隨開(kāi)花時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，第1天可授性幾乎為0，第2天開(kāi)始具有可授性，第3天可授性較強(qiáng)，在第4天時(shí)達(dá)到最大值，之后可授性減弱，第6天時(shí)不具可授性。

圖1 紅丁香花粉活力

2.4 花粉/胚珠比與雜交指數(shù)估算結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，紅丁香單花花粉粒數(shù)量為38 000個(gè)，單花胚珠數(shù)4個(gè)，P/O值為9 500，按照Crude的標(biāo)準(zhǔn)，紅丁香的繁育系統(tǒng)屬兼性異交類(lèi)型。

注：A為雌蕊；B為柱頭；C為少量授粉后的柱頭；D為大量授粉后的柱頭；E為花粉粒；F為花瓣表皮。圖版Ⅱ 掃描電鏡下的紅丁香花微觀結(jié)構(gòu)

注：小寫(xiě)字母表示在0.05水平差異顯著。(F=2 558.8,p<0.05)。圖2 紅丁香套袋試驗(yàn)結(jié)果

紅丁香的花朵直徑為10 mm，記為3。雌蕊成熟與花粉活力有近3 d的重復(fù)期，雌雄蕊成熟時(shí)間相近，記為0?；ㄩ_(kāi)后花柱與花藥在空間上始終分離，記為1。因此OCI值(雜交指數(shù))為4。按照Dafni的標(biāo)準(zhǔn)，紅丁香的繁育系統(tǒng)屬部分自交親和，異交，需要媒介進(jìn)行傳粉。

2.5 紅丁香授粉座果率

授粉試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)花朵去雄、套袋、不授粉的處理座果率為0，表明其不存在無(wú)融合生殖[17]。自然授粉的座果率為23.3%，套袋、不去雄的座果率為10.0%，兩者之間差異顯著(p<0.05)。不去雄、套袋、人工自花授粉的座果率為10.2%，表明紅丁香可部分進(jìn)行自動(dòng)自交，但自交率較低。自然授粉、去雄、不套袋的座果率為20.0%，人工同株異花授粉、去雄、套袋的座果率為18.2%，兩者之間差異不顯著(p>0.05)，且這2種處理方式的座果率均低于人工異株授粉、去雄、套袋的座果率(83.3%)，前2種處理與后者之間差異顯著(p<0.05)，表明紅丁香具有異交優(yōu)勢(shì)。

2.6 種子產(chǎn)量與構(gòu)成因素測(cè)定

經(jīng)試驗(yàn)測(cè)定，紅丁香每個(gè)花序單花數(shù)約為182，單花胚珠數(shù)約為3.5，單粒種子質(zhì)量約為13.5 ×10-3g。計(jì)算得出，紅丁香單花序潛在種子產(chǎn)量為8.6 g，而實(shí)際花序的種子產(chǎn)量為2.3 g左右，只占潛在種子產(chǎn)量的26.3%，紅丁香的實(shí)際產(chǎn)量比潛在產(chǎn)量低很多，還有很大提升空間。

3 結(jié)論與討論

熟悉植物生活史的前提是增加對(duì)花器官結(jié)構(gòu)的了解并判斷其性別表現(xiàn)，可為其各方面研究提供背景知識(shí)[18]。繁育系統(tǒng)類(lèi)型的多樣化往往受植物性別系統(tǒng)的影響，自然界中罕見(jiàn)純粹的自交種和異交種[19]。許多研究都表明，多數(shù)自交物種均可進(jìn)行異交授粉獲得種子，而多數(shù)異交植物也可通過(guò)自交授粉實(shí)現(xiàn)繁育[20-22]。本研究中，紅丁香植株的花器官具備諸多自交和異交特征：其雌、雄蕊成熟有重合期，雄蕊空間位置較雌蕊略高，柱頭相對(duì)表面積大，褶皺多，利于柱頭接受花粉，進(jìn)行自交；其花色較艷麗，有香味，花粉數(shù)量多，異交座果率高。前人研究發(fā)現(xiàn)，OCI、P/O是植物繁育系統(tǒng)的指示參數(shù)，簡(jiǎn)便易行，應(yīng)用廣泛[23-24]。本研究結(jié)果顯示，紅丁香的繁育系統(tǒng)為部分自交親和、需要傳粉者、以異交為主，屬兼性異交類(lèi)型；試驗(yàn)過(guò)程中也觀察到傳粉昆蟲(chóng)的訪(fǎng)花活動(dòng)，花朵套袋試驗(yàn)也驗(yàn)證了這一結(jié)論[25]。

在自然界中，植物并非所有的花都能通過(guò)授粉進(jìn)而座果并產(chǎn)生種子，授粉成功性強(qiáng)弱直接導(dǎo)致了座果率的高低。造成植物座果率低的原因是花粉限制和資源限制帶來(lái)的限制。本試驗(yàn)中，紅丁香自花授粉座果率較異株授粉座果率低，其具有較低的自花授粉親和性。人工異花授粉的座果率較自然授粉座果率高很多，說(shuō)明存在花粉限制，這可能與昆蟲(chóng)訪(fǎng)花頻率較低有關(guān)，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)早開(kāi)花的花序座果率較晚開(kāi)花花序座果率高，說(shuō)明紅丁香的座果率同時(shí)存在資源限制。盛花期和末花期的花序無(wú)法獲得較多的資源，因此較難達(dá)到生殖成功。估算種子產(chǎn)量結(jié)果表明，紅丁香實(shí)際的單花序種子產(chǎn)量占種子潛在產(chǎn)量的26.3%，這進(jìn)一步證實(shí)了養(yǎng)分和授粉情況是限制紅丁香種子形成的重要因素。

此外，物種所處生境影響其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，尤其是開(kāi)花特性和果實(shí)生長(zhǎng)[26]。有研究表明，紅丁香在華北地區(qū)栽培條件下的自然授粉座果率僅為8.3%[27]，顯著低于本試驗(yàn)的研究結(jié)果，這說(shuō)明環(huán)境條件對(duì)紅丁香的結(jié)實(shí)具有顯著影響，哪些環(huán)境因子影響紅丁香的座果率，將在今后的實(shí)驗(yàn)中做進(jìn)一步的定性定量分析。本研究對(duì)紅丁香在東北地區(qū)的擴(kuò)繁以及新品種選育具有指導(dǎo)性意義，也為其在城市園林綠化中的應(yīng)用和推廣提供了技術(shù)支持。