呂小青，勞蘭蘭，趙鳳，李艷華，麻柱，劉林

（1.北京奶牛中心，北京 100192；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193）

近年來，為了提高奶牛的生產(chǎn)性能，我國大量從國外引進(jìn)遺傳物質(zhì)，促進(jìn)了國內(nèi)奶牛群體的遺傳改良。然而，在引進(jìn)遺傳物質(zhì)的過程中也導(dǎo)致了一些遺傳缺陷在我國奶牛群體間傳播。2016年10月28日，農(nóng)業(yè)部畜牧業(yè)司發(fā)布了《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2460號(hào)》，公告中規(guī)定從境外引進(jìn)種牛及冷凍精液和胚胎的，應(yīng)在系譜上標(biāo)識(shí)或在銷售合同條款中寫明種牛及冷凍精液和胚胎未攜帶脊椎彎曲綜合征(CVM)、白細(xì)胞黏附缺陷綜合征(BLAD)、短脊椎綜合征(BS)等主要遺傳缺陷基因。國家建立的種牛缺陷基因監(jiān)督措施，對(duì)保障種牛及遺傳物質(zhì)的質(zhì)量安全，提高奶農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。

遺傳缺陷所引起的經(jīng)濟(jì)損失包括動(dòng)物胚胎損失、新生畜死亡以及病畜的生產(chǎn)性能和利用價(jià)值降低等，例如牛短脊椎綜合征（BS）[1]、牛脊椎彎曲綜合征（CVM）[2]等遺傳缺陷，致病基因純合時(shí)可導(dǎo)致胚胎死亡，直接造成生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)上的損失。同時(shí)，母牛在懷孕早期流產(chǎn)可能影響母牛的身體健康，甚至引起疾病，從而導(dǎo)致母牛的生產(chǎn)性能和利用價(jià)值降低。

目前，國內(nèi)已經(jīng)建立了很多奶牛遺傳缺陷基因的分子檢測方法，如BLAD[3]、DUMPS、CN[4]、BS[5]等隱性遺傳缺陷基因的檢測，并對(duì)國內(nèi)種公牛遺傳缺陷基因的攜帶情況進(jìn)行了系譜分析，對(duì)保證種公牛的遺傳優(yōu)勢和降低遺傳缺陷基因的傳播風(fēng)險(xiǎn)都起到重要作用。

隨著奶牛全基因組內(nèi)高密度SNPs檢測技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，并隨著檢測個(gè)體的不斷增加，獲得了大量的單倍型信息，通過不同世代個(gè)體比對(duì)，發(fā)現(xiàn)11種群體頻率很高的單倍型從來沒有以純合的形式出現(xiàn)，然后進(jìn)行系譜分析，觀察其遺傳方式，并通過和具體繁殖性狀（SCR、妊娠率、死胎率）的關(guān)聯(lián)分析，推測出5種單倍型，當(dāng)其純合時(shí)會(huì)導(dǎo)致早期流產(chǎn)或死胎。

2011年，VanRaden等首先通過基因組SNP數(shù)據(jù)分析，在荷斯坦牛中發(fā)現(xiàn)了3種導(dǎo)致胚胎死亡的隱性遺傳缺陷單倍型（HH1、HH2和HH3）[6]。2012年，Adams等通過全基因組重測序和高密度單體型分型技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在APAF1基因上63150400bp位置存在一個(gè)C/T突變，使編碼谷氨酰胺的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，導(dǎo)致APAF1基因編碼的蛋白質(zhì)缺失約1/3。同時(shí)發(fā)現(xiàn)APAF1基因在胚胎的生長發(fā)育中發(fā)揮著不可替代的作用，所以發(fā)生突變后導(dǎo)致胚胎死亡[7]。該遺傳缺陷基因攜帶者不表現(xiàn)任何臨床癥狀，只有隱性純合子個(gè)體致死，因此給養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展造成的潛在損失巨大。

2013年，F(xiàn)ritz等報(bào)道了HH1遺傳缺陷在法國荷斯坦牛群體中的頻率為2.6%[8]。目前HH1在我國荷斯坦牛群中的攜帶情況尚不清楚，因此有必要對(duì)HH1遺傳缺陷基因進(jìn)行檢測和篩查。本研究旨在了解北京地區(qū)荷斯坦母牛HH1遺傳缺陷基因的攜帶情況，同時(shí)探索HH1遺傳缺陷基因的分子檢測方法，為科學(xué)選種選配提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

本研究共隨機(jī)采集了158頭北京地區(qū)荷斯坦母牛的血液樣品。

1.2 基因組DNA提取

采用天根血液DNA提取試劑盒（DP318），根據(jù)試劑盒說明書提取基因組DNA。提取的DNA用1%瓊脂糖凝膠檢測，同時(shí)用分光光度計(jì)檢測其濃度與純度。

1.3 KASP檢測方法的建立

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

檢索Ensembl數(shù)據(jù)庫的?；蚪M序列（UMD 3.1），獲得A P A F 1 基因的部分序列（B T A 5:63150200-63150600），以此為模板進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)。利用Primer3.0設(shè)計(jì)引物（如表1所示），針對(duì)SNP位點(diǎn)，上游引物APAF1-F1和APAF1-F2的3′端為等位基因突變堿基，將APAF1-F1和APAF1-F2在5’端加上相應(yīng)的通用接頭序列(熒光標(biāo)簽序列)。

表1 KASP引物序列信息

1.3.2 PCR程序

PCR體系為5μL，包括2.5μL DNA、2.5μL KASP Master Mix（LGC Genomics,Hoddeston,UK）、0.07μL混合引物。為避免對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的誤判，設(shè)置空白對(duì)照，其DNA模板用ddH2O代替。PCR擴(kuò)增條件：94℃熱激活15min、94℃變性20s、61～55℃退火和延伸60s，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)；94℃變性20s、55℃退火和延伸60s，進(jìn)行26個(gè)循環(huán)；94℃變性20s、57℃退火和延伸60s，進(jìn)行3個(gè)循環(huán)。

1.3.3 數(shù)據(jù)掃描

PCR結(jié)束后，取出孔板進(jìn)行數(shù)據(jù)掃描，具體參照《ABI7900 HT Fast RealTime PCR system實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程》。

1.4 群體基因組頻率計(jì)算

雜合基因型頻率（%）=雜合個(gè)體數(shù)/測定個(gè)體數(shù)×100%

有害基因頻率=雜合基因型頻率/2

2 結(jié)果

2.1 基因型檢測結(jié)果

本研究設(shè)計(jì)的KASP引物能夠準(zhǔn)確區(qū)分SMC2基因的純合型和雜合型，從而確定遺傳缺陷基因的攜帶者。本研究中對(duì)于待檢測的SNP位點(diǎn)其檢出率為100%，樣品SNP檢測結(jié)果見圖1。圖中兩個(gè)坐標(biāo)分別代表不同顏色的熒光強(qiáng)度，用于區(qū)分同一位點(diǎn)不同的SNP基因型，左上端藍(lán)色是單道熒光值比較高的，可以認(rèn)為是純合子（即CC型），中間的綠色是兩種基因型都存在的雜合子（即CT型），因本研究中TT純合型是致死的，所以沒有檢測到TT型（右下端紅色區(qū)域無顯示）。

圖1 APAF1基因位點(diǎn)的KASP檢測結(jié)果

2.2 有害基因頻率計(jì)算

本研究共隨機(jī)檢測了158頭荷斯坦母牛，檢測到20頭攜帶HH1的個(gè)體，HH1攜帶率為12.66%，其有害基因頻率為6.33%，提示HH1在我國荷斯坦母牛群體中存在一定的比例。

3 討論

目前檢測奶牛遺傳缺陷基因的方法主要有PCRPIRA[9,10]、PCR-SSCP[11～13]、PCR-RFLP[14]以及焦磷酸測序[15]，本研究首次建立了影響荷斯坦牛繁殖力遺傳缺陷基因HH1的KASP分型檢測方法，該方法快速、高效、經(jīng)濟(jì)，可以對(duì)樣本進(jìn)行高通量的檢測。KASP是競爭性等位基因特異性PCR的縮寫，可在廣泛的基因組DNA樣品中，對(duì)SNPs和特定位點(diǎn)上的插入和缺失進(jìn)行精準(zhǔn)的雙等位基因判斷，是基于引物末端堿基的特異匹配來對(duì)SNP進(jìn)行分型。

本研究對(duì)HH1在北京地區(qū)高產(chǎn)荷斯坦母牛群中的攜帶情況進(jìn)行了初步了解，其攜帶率為12.66%，提示HH1在我國荷斯坦母牛群體中存在一定的比例。因此，奶牛場需要嚴(yán)格系譜登記制度，同時(shí)在購買公牛凍精時(shí)，需要查看公牛系譜，避免使用攜帶HH1的公牛凍精配種，從而避免產(chǎn)生遺傳缺陷基因HH1純合個(gè)體，減少不必要的損失。此外，牛場應(yīng)定期對(duì)牛群進(jìn)行隨機(jī)抽樣篩查，國家還應(yīng)嚴(yán)格監(jiān)控進(jìn)口奶牛遺傳缺陷基因的攜帶情況。本研究為我國奶牛育種工作中有計(jì)劃地降低遺傳缺陷基因提供了技術(shù)支撐，為奶牛場進(jìn)行科學(xué)的選種選配提供了依據(jù)，對(duì)降低奶農(nóng)的經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。