余 蕾，趙雪紅，樊小力，李雪萍

(1.西安醫(yī)學(xué)院，西安710021；2.湖北文理學(xué)院 醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)部，襄陽 441053；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，西安 710016)

制動、失重等條件下骨骼肌發(fā)生萎縮，這種由于運(yùn)動減少、缺乏鍛煉所致的肌肉萎縮稱為廢用性肌萎縮。中長期的航天飛行過程中宇航員會出現(xiàn)肌肉萎縮尤其是下肢抗重力肌的萎縮，這極大地限制了宇航員在太空中的作業(yè)，待其返回地面后，萎縮的肌肉無法立即恢復(fù)正常，并且容易出現(xiàn)站立不穩(wěn)、平衡失調(diào)等情況，嚴(yán)重影響宇航員的生活[1-2]。對于骨折患者的制動治療雖然可保護(hù)受損組織利于骨折的愈合，但限制了周圍健康關(guān)節(jié)、肌肉的運(yùn)動，可導(dǎo)致明顯的肌肉萎縮。廢用條件下肌緊張減弱，大鼠出現(xiàn)肌肉萎縮，其中肌梭的萎縮比梭外肌出現(xiàn)的要早，其萎縮程度也較梭外肌更為嚴(yán)重，這提示肌梭在廢用性肌萎縮的發(fā)生發(fā)展過程中起著舉足輕重的作用[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，蟾蜍離體單一肌梭在肌苷的作用下，其自發(fā)放電可明顯增多[6]。到目前為止，以大鼠單一肌梭作為研究對象，觀察在廢用性肌萎縮發(fā)生過程中藥物對肌梭放電的影響尚未見報道。本研究通過建立后肢制動模型導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)廢用性肌萎縮，而后記錄大鼠比目魚肌離體單一肌梭的電生理活動，并分別觀察不同劑量的三磷酸腺苷(1、2和3 mg/kg)對肌梭電生理活動的影響，為廢用性肌萎縮的預(yù)防與治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與藥品

實(shí)驗(yàn)選取雄性SD大鼠作為研究對象(購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)，體重200～220 g。按體重配對原則隨機(jī)將大鼠分為5組，即正常對照組(CON)、后肢制動組、后肢制動+1 mg/kg三磷酸腺苷鈉組(Na2ATP 1)、后肢制動+2 mg/kg三磷酸腺苷鈉組(Na2ATP 2)、后肢制動+3 mg/kg三磷酸腺苷鈉組(Na2ATP 3)，每組5只。氯化琥珀膽堿注射液(1 g/2 mL)，購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司。Na2ATP注射液(10 mg/1 mL)，購自遼寧可濟(jì)藥業(yè)有限公司。

1.2 大鼠后肢制動模型建立

實(shí)驗(yàn)采用改良Booth等的方法[7]建立大鼠后肢制動模型。大鼠經(jīng)0.4 g/kg水和氯醛腹腔注射麻醉后清潔其左后肢，在左后肢上包裹一層輕薄的棉花，尤其注意關(guān)節(jié)及血管等處防止這些部位受到石膏壓迫，而后將石膏繃帶置于棉花上纏繞包裹左后肢，繃帶松緊適宜，由踝關(guān)節(jié)起向上經(jīng)膝關(guān)節(jié)纏繞至腹股溝處，注意固定過程中膝關(guān)節(jié)處于伸展?fàn)顟B(tài)，踝關(guān)節(jié)處于背伸狀態(tài)，最終使左后肢固定于靜息位一周。石膏外側(cè)包繞銅網(wǎng)，防止動物撕咬。室溫維持在25℃左右，將大鼠置于鼠籠內(nèi)喂養(yǎng)，一鼠一籠，保證大鼠正常飲水進(jìn)食以及活動。

1.3 大鼠比目魚肌單一肌梭標(biāo)本的制備

腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉大鼠，取后肢比目魚肌置于改良任氏液(CaCl2濃度為 1.8 mol/L)中，水浴37℃，持續(xù)通氧。肌梭與梭外肌并聯(lián)，外觀呈梭形，以此作為標(biāo)志，在雙目解剖顯微鏡和倒置顯微鏡下尋找肌梭。沿肌纖維走形方向，使用分離針小心剝離肌梭周圍的結(jié)締組織和梭外肌。分離過程注意保護(hù)肌梭梭囊的完整，并保留至少3 mm的傳入神經(jīng)纖維。為保證肌梭活性，整個分離過程不超過10 min，超時仍未分離出肌梭則需更換新的比目魚肌及改良任氏液重新分離。

1.4 單一肌梭電活動記錄

實(shí)驗(yàn)采用空氣隔絕法[8]記錄單一肌梭傳入放電。將制備好的肌梭標(biāo)本放入屏蔽箱內(nèi)通氧平衡10 min，CON組及后肢制動組記錄肌梭自發(fā)傳入放電；而后給予50 mg/L Sch灌流，記錄肌梭誘發(fā)放電情況。后肢制動+Na2ATP 1、后肢制動+Na2ATP 2、后肢制動+Na2ATP 3給予相應(yīng)濃度的Na2ATP灌流，記錄肌梭自發(fā)傳入放電；而后給予50 mg/L Sch灌流，記錄肌梭誘發(fā)放電情況。

1.5 數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計(jì)分析

表1 后肢制動一周對大鼠比目魚肌離體單一肌梭放電變化Table 1 The influence of hindlimb immobilization for one week on the discharges of isolated soleus muscle spindle in rats

*：P<0.05,compared with CON;△：P<0.05,compared with the electrical activity of muscle spindle before administration of Sch

2 結(jié)果

2.1 后肢制動一周大鼠比目魚肌單一肌梭放電變化

實(shí)驗(yàn)記錄了正常對照組及后肢制動組各12例肌梭自發(fā)及誘發(fā)放電情況，結(jié)果顯示后肢制動一周后大鼠比目魚肌離體單一肌梭傳入放電形式與正常對照組一致，均為簇狀放電，簇狀放電之間間隔一定的周期。然而后肢制動組放電頻率較正常對照組明顯減少(P<0.05)，放電周期間隔延長明顯(P<0.05)，給予50 mg/L Sch后誘發(fā)放電未見明顯增多。

2.2 三磷酸腺苷對后肢制動大鼠比目魚肌單一肌梭放電的影響

實(shí)驗(yàn)觀察并記錄了分別給予Na2ATP 1、2和3 mg/kg后，后肢制動大鼠比目魚肌單一肌梭放電的變化，每組記錄12例肌梭放電。

2.2.1 自發(fā)放電變化

平均頻率：給予1 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭傳入放電平均頻率為(0.08±0.01)Hz，較給藥前制動大鼠平均頻率(0.07±0.01)Hz未見明顯變化；給予2 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭傳入放電平均頻率由(0.08±0.01)Hz增至(0.14±0.01)Hz(P<0.05)；給予3 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭傳入放電平均頻率由(0.07±0.01)Hz增至(0.15±0.01)Hz(P<0.05)。

峰值頻率：給予1 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭傳入放電峰值頻率為(6.30±1.85)Hz，較給藥前制動大鼠峰值頻率(5.62±1.03)Hz未見明顯變化；給予2 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭傳入放電峰值頻率由(4.80±0.87)Hz增至(8.53±1.22)Hz(P<0.05)；給予3 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭傳入放電峰值頻率由(5.61±0.79)Hz增至(9.94±1.05)Hz(P<0.05)。

周期間隔：給予1 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭傳入放電周期間隔為(4.08±1.03)min，較給藥前制動大鼠自發(fā)放電周期間隔(4.79±0.89)min未見明顯改變；給予2 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭自發(fā)放電周期間隔由(4.66±0.72)min縮短至(4.08±1.03)min；給予3 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭傳入放電自發(fā)放電周期間隔由(4.71±0.83)min縮短至(2.96±0.94)min(P<0.05)。

2.2.2 誘發(fā)放電變化

各組給予50 mg/L Sch灌流觀察其誘發(fā)放電情況，結(jié)果顯示，Na2ATP 1組中僅2例肌梭放電增加，誘發(fā)陽性率為16.7%。誘發(fā)放電的平均頻率為(0.08±0.01)Hz，峰值頻率為(7.80±2.57)Hz，自發(fā)放電的周期間隔為(4.15±1.21)min；Na2ATP 2組中僅3例肌梭放電增加，誘發(fā)陽性率為25%。誘發(fā)放電的平均頻率為(0.16±0.01)Hz，峰值頻率為(10.37±1.89)Hz，自發(fā)放電的周期間隔為(3.74±0.94)min；Na2ATP 3組中6例肌梭放電增加，誘發(fā)陽性率為50%。誘發(fā)放電的平均頻率為(0.24±0.01)Hz(P<0.05)，峰值頻率為(15.18±1.64)Hz(P<0.05)，自發(fā)放電的周期間隔為(2.81±0.75)min。

A：平均頻率；B：峰值頻率；C：放電周期間隔。*：P<0.05,compared with hindlimb immobilization；Δ：P<0.05,compared with before the administration of Sch

圖1 Na2ATP對后肢制動大鼠單一比目魚肌肌梭傳入放電的影響
Figure 1 Effects of Na2ATP on the afferent discharges of hindlimb immobilization rat′s soleus muscles′ single spindles

3 討論

肌梭是骨骼肌內(nèi)的本體感受器，它與梭外肌平行排列，位于初長度時肌梭可產(chǎn)生自發(fā)的傳入放電。在重力的作用下，肌梭自發(fā)傳入放電不斷傳向中樞，從而產(chǎn)生了肌緊張，使地球上的人和動物維持站立的狀態(tài)。失重和制動均可使骨骼肌活動減少，最終導(dǎo)致廢用性肌萎縮的發(fā)生。既往研究發(fā)現(xiàn)模擬失重情況下在體肌梭傳入放電明顯減少[3]，肌緊張減弱，梭內(nèi)內(nèi)肌與梭外肌均萎縮，且肌梭發(fā)生萎縮的時間早于梭外肌。然而在體條件下，肌梭與梭外肌纖維并聯(lián)，梭外肌收縮導(dǎo)致肌梭縮短，傳入放電減少；且梭內(nèi)肌纖維受來自脊髓前角的γ-運(yùn)動神經(jīng)元支配，而γ-運(yùn)動神經(jīng)元則受到高位中樞功能狀態(tài)的調(diào)控[9]，為排除上述影響因素，本實(shí)驗(yàn)采用空氣隔絕法記錄離體單一肌梭放電，單純觀察后肢制動對肌梭傳入放電的影響并尋找相應(yīng)的有效對抗措施。

本實(shí)驗(yàn)建立了大鼠后肢制動模型，發(fā)現(xiàn)后肢制動一周大鼠比目魚肌離體單一肌梭自發(fā)放電頻率較正常明顯減少，肌梭簇狀放電的周期間隔延長，且對興奮肌梭的藥物Sch無明顯反應(yīng)，這與趙雪紅等人[10]對模擬失重情況下在體肌梭放電減少的研究結(jié)果一致。分別給予1、2和3 mg/kg 3種濃度的Na2ATP灌流后肢制動7 d的大鼠比目魚肌的離體單一肌梭，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一定濃度的三磷酸腺苷可興奮肌梭，使其自發(fā)放電明顯增加，然而僅較高濃度的三磷酸腺苷可使誘發(fā)放電明顯增加。

三磷酸腺苷興奮肌梭可能與以下因素有關(guān)：1)研究表明模擬失重僅3 d，梭內(nèi)、外肌細(xì)胞即出現(xiàn)了胞漿游離Ca2+濃度增多的現(xiàn)象；模擬失重14 d，梭內(nèi)、外肌細(xì)胞胞漿出現(xiàn)鈣超載現(xiàn)象，并可見到梭內(nèi)肌纖維中鈣結(jié)合蛋白D28K的表達(dá)明顯減少，D28K與胞漿游離Ca2+的結(jié)合減弱，胞漿游離Ca2+增多[11]。廢用性肌萎縮發(fā)生時細(xì)胞可出現(xiàn)鈣超載，三磷酸腺苷作為能量補(bǔ)充劑，一方面經(jīng)ATP酶水解后可促使肌絲滑行，梭內(nèi)肌纖維收縮，肌梭傳入沖動增多；另一方面可加快肌漿網(wǎng)對Ca2+的攝取，提高梭內(nèi)肌纖維的舒張速度。2)在三磷酸腺苷的作用下，神經(jīng)肌肉接頭處突觸前膜內(nèi)的遞質(zhì)乙酰膽堿釋放增多，乙酰膽堿擴(kuò)散至終板膜與其受體結(jié)合，可提高終板膜對Ca2+的通透性，觸發(fā)Ca2+內(nèi)流[12]。Ca2+內(nèi)流一方面可觸發(fā)核袋纖維收縮，肌梭傳入放電增多；另一方面可降低梭內(nèi)肌細(xì)胞膜電位水平，產(chǎn)生感受器電位[13]，提高梭內(nèi)肌纖維的興奮性，從而使肌梭傳入放電增多。3)另有研究表明，當(dāng)被稱為腫瘤抑制器的叉頭轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a活化時，MAFbx 表達(dá)上調(diào)，從而引起肌萎縮。外源性ATP可促使FoxO3a磷酸化，MAFbx表達(dá)下調(diào)，起到緩解肌萎縮的作用[14-15]。

制動情況下肌肉發(fā)生萎縮，肌梭自發(fā)放電減少，傳向中樞的神經(jīng)沖動減少，肌緊張減弱，最終導(dǎo)致或加重了肌肉萎縮[16-17]。到目前為止尚未發(fā)現(xiàn)對抗廢用性肌萎縮的較好的方法，本實(shí)驗(yàn)采用空氣隔絕法測單一肌梭放電，結(jié)果顯示后肢制動一周單一肌梭傳入放電明顯減少，給予一定濃度的三磷酸腺苷可對抗肌梭傳入放電減少的情況，其對抗肌萎縮的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果為大鼠肌梭生理的研究與廢用性肌萎縮的實(shí)驗(yàn)研究中提供了有意義的資料，為制動所致肌萎縮的防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。