王紅，樊世明，許欣，沈有錄

(青海大學附屬醫(yī)院，西寧810001)

冠心病(CHD)患者冠狀動脈(冠脈)發(fā)生粥樣硬化，冠脈管腔堵塞，從而引起心肌缺血，心臟發(fā)生病理生理改變。目前臨床治療冠心病CHD的有效方法為經皮冠脈介入治療(PCI)。PCI因其創(chuàng)傷小、恢復快，且能在緊急情況下迅速血運重建，從而快速有效緩解缺血癥狀，故而廣泛用于臨床CHD的治療。但由于支架植入后，血管內皮損傷并引發(fā)炎癥反應，長期炎癥促使血管內膜過度增生、平滑肌細胞增殖、內膜增厚，導致病變血管再狹窄，影響PCI的療效[1]。有研究表明CHD患者PCI術后再狹窄與炎癥反應有關。許多炎癥介質和細胞因子參與PCI術后炎癥反應，其中超敏C反應蛋白(hs-CRP)和可溶性血管內皮細胞黏附分子(sVCAM-1)是介導PCI術后炎癥反應的介質。故目前臨床主要通過控制炎癥反應防止術后再狹窄的發(fā)生[2]。微小RNA(miRNA)是一類廣泛存在于真核生物中保守的、內源性的、非編碼的小分子單鏈RNA，參與基因轉錄后的表達調控過程。研究表明，miRNA的表達與動脈粥樣斑塊的形成與炎癥反應有關，也在心肌肥厚、心律失常及心力衰竭等病理生理過程中起重要作用[3]。其中miRNA-126在內皮細胞中高表達，是目前惟一已知的在內皮細胞系特異表達的miRNA，參與調節(jié)血管生長發(fā)育甚至血管炎性反應等病理生理過程[4]。本研究將從miR-126入手，探討CHD患者PCI術后血漿miR-126表達與炎癥反應的關系，旨在為臨床預防PCI術后血管再狹窄提供更多的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年11月～2018年2月本院確診為CHD并行PCI治療的患者72例，其中急性冠脈綜合征(ACS)-PCI組37例、穩(wěn)定型心絞痛(SAP)-PCI組35例。診斷標準：ACS診斷標準參照《2015年急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南解析》《非ST段抬高型急性冠狀動脈綜合征診斷和治療指南(2016)》及不穩(wěn)定型心絞痛相關診斷與治療指南[5～7]；SAP診斷標準參照《慢性穩(wěn)定型心絞痛診斷與治療指南》[8]。納入標準：年齡≥18歲；經冠脈造影檢查至少1支冠脈狹窄≥50%。排除標準：先天性心臟病、慢性阻塞性肺炎；肝腎功能嚴重不全或血液系統(tǒng)疾病。ACS-PCI組男17例、女20例，年齡(55.89±6.58)歲，合并糖尿病10例、高血壓12例。SAP-PCI組男16例、女19例，年齡(54.63±6.97)歲，合并糖尿病9例、高血壓10例。同期選擇性別、年齡相匹配的志愿者37例為對照組，對照組男18例、女19例，年齡(57.36±8.92)歲，合并糖尿病6例、高血壓9例；無心肌缺血，且經冠脈造影未發(fā)現(xiàn)有意義的阻塞性病變、心肌橋病變。三組性別、年齡具有可比性。受試者均簽署知情同意書，且本研究經倫理委員會批準。

1.2 球囊直徑、球囊擴張次數(shù)和球囊擴張總壓力測算 CHD患者均行PCI術治療。按照球囊與靶血管直徑1∶1的原則選擇球囊導管，按照支架與靶血管直徑1∶1的原則選擇支架。將指引導管置入冠脈開口處，將指引導絲送至血管狹窄遠端后，沿著導絲將球囊送至狹窄處，以適當?shù)膲毫按螖?shù)擴張后，將支架放置在狹窄處。支架放置完畢后觀察血流通暢情況。術中記錄球囊直徑、球囊擴張次數(shù)和球囊擴張總壓力。

1.3 樣本采集 CHD患者于PCI術前5 min及術后3 d，對照組于住院第1天抽取肘靜脈血10 mL，其中5 mL加入含EDTA抗凝劑的試管中，4 000 r/min離心10 min，收集血漿用于miR-126檢測；另外5 mL靜置30～60 min，4 000 r/min離心10 min，收集血清用于炎癥因子的測定。

1.4 血漿miR-126表達檢測 將0.25 mL血漿樣本加入TRIzol 1 mL重復混勻后靜置5 min，繼續(xù)加入氯仿0.2 mL充分混勻振蕩后靜置5 min。12 000 r/min離心10 min吸取上清液加入等體積的異丙醇，混勻后靜置3 min。4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，保留沉淀，75%乙醇洗滌，12 000 r/min離心1 min兩次后保留沉淀，加入DEPC水重懸測RNA濃度并逆轉錄成cDNA。以cDNA 1 L為模板、

U6為內參，采用實時熒光定量PCR反應測定血漿中miR-126的表達。反應條件：95 ℃ 5 min循環(huán)1次，95 ℃ 15 s，58 ℃ 45 s，55～95 ℃ 0.5 s，40個循環(huán)。記錄各樣本Ct值。取各樣本miRNA評價Ct值，采用參照基因Ct法，以管家基因U6的Ct值作為內參，2-ΔΔCt法計算miRNA的相對表達量。

1.5 血清hs-CRP、sVCAM-1檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組血清hs-CRP、sVCAM-1。按照試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司)說明書進行操作，在酶標儀上讀取相應波長的吸光度值并計算濃度。

2 結果

2.1 各組術中球囊直徑、球囊擴張次數(shù)和球囊擴張總壓力比較 ACS-PCI組與SAP-PCI組術中球囊直徑、球囊擴張次數(shù)和球囊擴張總壓力比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組術中球囊直徑、球囊擴張次數(shù)和球囊擴張總壓力比較

2.2 各組血漿miR-126表達及血清hs-CRP、sVCAM-1水平比較 見表2。

表2 各組血漿miR-126表達及血清hs-CRP、sVCAM-1水平比較

注：與同時點對照組比較，*P<0.05；與同組術前比較，#P<0.05；與同時點SAP-PCI組比較，△P<0.05。

2.3 CHD患者血漿miR-126水平與相關指標的關系 CHD患者血漿miR-126水平與血清hs-CRP、sVCAM-1水平及球囊擴張次數(shù)、球囊擴張壓力呈負相關(r分別為-0.433、-0.471、-0.440、-0.393，P均<0.05)。

3 討論

目前CHD已成為威脅人類健康的嚴重疾病之一。流行性病學研究顯示美國每6例死亡病例中就有1例死于CHD，中國CHD病死率自2012年以來處于上升趨勢[1]。臨床主要通過控制冠脈粥樣硬化，以改善缺血缺氧導致的心臟機械功能障礙，維持良好的心臟灌注[9]。PCI術經皮穿刺周圍動脈，沿動脈向心臟的方向置球囊導管或支架至冠脈目標位置，對冠脈病變部位進行疏通及擴展，以改善缺血癥狀，可在緊急情況下迅速使狹窄閉塞的血管再通，使血運狀態(tài)得到改善，緩解缺血狀態(tài)，并且創(chuàng)傷小、恢復快[10]。但術后，由于支架植入血管壁發(fā)生損傷、血栓形成和炎性反應刺激下各種細胞因子和生長因子的分泌增多、平滑肌細胞內膜遷移導致的內膜過度增生，易導致血管再狹窄[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，PCI術后6個月高達50%的患者出現(xiàn)術后再狹窄，術后1年再狹窄率高達10%[12]。

hs-CRP是肝臟受白細胞介素6刺激后分泌的一種蛋白，是全身低度炎癥的標志。CHD患者大量分泌hs-CRP并活化炎性細胞，通過浸潤、聚集和產生細胞因子引起血管內皮損傷，血管痙攣、脂質代謝紊亂，參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，導致心肌缺血[13，14]。目前有研究發(fā)現(xiàn)PCI術后患者血漿hs-CRP水平高于術前，說明hs-CRP有可能參與了PCI誘導的炎癥反應[15]。也有研究發(fā)現(xiàn)sVCAM-1也參與了炎癥的發(fā)生發(fā)展[16]。sVCAM-1在生理狀態(tài)下表達較少，當內皮細胞損傷后，炎性因子促使sVCAM-1表達上調，使大量白細胞黏附在血管內皮上，導致炎癥的發(fā)生。miRNA是一類非編碼小RNA，可在轉錄后通過與靶mRNA 3′端非翻譯區(qū)結合來抑制靶mRNA的翻譯，或與靶mRNA 5′端結合來激活靶mRNA表達。miRNA參與細胞分化、凋亡、生長發(fā)育等過程中。近期研究表明，miRNA參與了CHD發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié)，可作為預測心血管疾病預后的生物標記物[13]。miR-126是miRNA家族的一員，主要在血管內皮細胞上表達，通過促進血管形成和增生、調控脂質代謝及血管內皮病變參與CHD進展[17]。有研究發(fā)現(xiàn)在CHD患者和健康受試者中，miR-126的表達存在顯著差異，CHD患者血漿miR-126表達低于健康志愿者。證實血漿miR-126低表達可能對CHD有一定的預警作用[18，19]。而miR-126在CHD患者行PCI術后的作用還有待進一步研究。

本研究結果表明，CHD患者PCI術前血漿miR-126水平較對照組低，而hs-CRP和sVCAM-1水平較對照組高；CHD患者PCI術后血漿miR-126水平較術前下降，而hs-CRP和sVCAM-1水平較術前升高。hs-CRP、sVCAM-1均參與CHD的發(fā)生發(fā)展過程。既往研究表明miR-126可作用于sVCAM-1，且其具有促進血管生成、增生的作用[20]，故在健康人群中miR-126表達較高，sVCAM-1水平較低。CHD患者hs-CRP、sVCAM-1水平較健康受試者高，升高的sVCAM-1通過調控血管炎癥反應來下調miR-126，加劇動脈粥樣硬化的形成。PCI術后，支架植入血管，損傷血管內皮，導致hs-CRP、sVCAM-1大量釋放，與其他炎癥因子、黏附分子共同加重血管損傷、炎癥反應。而sVCAM-1水平升高繼續(xù)下調miR-126表達。球囊擴張時會阻斷心肌血流導致心肌缺血，而球囊擴張壓力越大也會加重血管的損傷，導致炎癥反應的發(fā)生。進一步研究表明miR-126與hs-CRP、sVCAM-1、球囊擴張次數(shù)和球囊擴張壓力均呈負相關。說明hs-CRP、sVCAM-1的上調可能會調控miR-126的下調，則miR-126可能是一種炎癥保護因子，通過消耗自身來控制機體的炎癥反應。而球囊擴張次數(shù)及擴張壓力的增加可能也使炎癥反應增加。同時，本研究發(fā)現(xiàn)ACS-PCI組hs-CRP、sVCAM-1水平較SAP-PCI組高。hs-CRP可促發(fā)sVCAM-1的表達上調，同時上調的sVCAM-1又反過來刺激hs-CRP的分泌。

綜上所述，CHD患者miR-126低表達，炎癥因子hs-CRP、sVCAM-1水平升高；而PCI術后，hs-CRP、sVCAM-1水平進一步升高，miR-126表達進一步降低。提示可通過上調miR-126表達調控CHD患者PCI術后炎癥。