李 梅

(浦城縣投資開發(fā)公司，福建 浦城 353400)

蘇云金芽胞桿菌簡稱Bt，它可以用于森林、棉花、玉米、蔬菜、水果以及茶、麻、煙葉等作物害蟲，也可用于貯藏害蟲和環(huán)境害蟲的防治，對(duì)蔬菜、茶等害蟲的防治效果達(dá)90%以上，且符合國家食品A級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，是目前全世界公認(rèn)明有效、最有前途的生物農(nóng)藥。Bt是目前我國生產(chǎn)和銷售量最大的一種生物殺蟲劑。

Bt菌種在長期的生產(chǎn)過程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)退化導(dǎo)致減產(chǎn)，選育高產(chǎn)高效的生產(chǎn)菌種是每一個(gè)Bt生產(chǎn)單位菌種科室的首要任務(wù)。本文以用凝膠電泳法檢測(cè)毒素蛋白為初篩條件進(jìn)行大量初篩，再以小菜蛾生物檢測(cè)的效價(jià)進(jìn)行復(fù)篩。

1 材料和方法

1.1 菌種

WE-2015-1。

1.2 培養(yǎng)基

肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏6%、蛋白胨10%、氯化鈉0.1%、瓊脂2% 1.0 MPa滅菌20 min制成肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)2天后檢查無雜菌，接入菌種培養(yǎng)28℃兩天制成出發(fā)菌種備用。

搖瓶培養(yǎng)基：花生粉1.0%、黃豆餅粉3.6%、淀粉：0.5%、酵母粉0.5%、硫酸鎂0.1%、碳酸鈣0.1%、氯化鋅0.05%、磷酸二氫鉀0.1%1.0 MPa滅菌30 min。

1.3 紫外線處理

將培養(yǎng)好的肉湯菌種刮入裝有生理鹽水的平皿中，用功率15 W、波長256 nm的紫外燈距離30 cm處照射1 min，然后進(jìn)行稀釋10-8稀釋自然分離，挑單菌落轉(zhuǎn)入斜面培養(yǎng)。

1.4 菌種初篩

第一步初篩：將經(jīng)過紫外線處理并經(jīng)過自然分離的菌株培養(yǎng)于肉湯斜面28℃培養(yǎng)2天，用品紅染色液涂片染色鏡檢伴孢晶體的形態(tài)。保留伴孢晶體形態(tài)規(guī)則、一致、個(gè)體較大的或者有特點(diǎn)的菌株進(jìn)行下一步篩選。

第二步初篩：經(jīng)過第一步初篩過的選出的菌株，接入搖瓶培養(yǎng)基培養(yǎng)30℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)40 h后用品紅染色液涂片鏡檢生長較好并且用凝膠電泳法檢測(cè)毒素蛋白高于出發(fā)菌株10%的菌種保留進(jìn)行下一步的復(fù)篩。

1.5 菌種復(fù)篩

第一步復(fù)篩：將初篩得到的菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中30℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)40 h后鏡檢生長正常，用小菜蛾做生物檢測(cè)毒力效價(jià)高于原出發(fā)菌株10%的菌株保留進(jìn)行下一步的復(fù)篩。

第二步的復(fù)篩：將第一次復(fù)篩得到的菌株接入100 L的中試罐中培養(yǎng)基中30℃、180 r/min通氣量1∶1條件下培養(yǎng)40 h鏡檢生產(chǎn)正常，用小菜蛾做生物檢測(cè)毒力穩(wěn)定的菌株作為生產(chǎn)菌種或者作為下一步選育的出發(fā)菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選結(jié)果

經(jīng)過紫外線誘變處理后，挑單菌菌傳斜面培養(yǎng)鏡檢菌株共2100個(gè)，第一步初篩留 種率控制在25%左右，第二步初篩留種率控制在30%左右，最后共挑選150個(gè)菌落進(jìn)入復(fù)篩。經(jīng)過兩次復(fù)篩，選擇了WE-2015-1-156、WE-2015-1-899、WE-2015-1-1968用于生產(chǎn)和下一步的選育。

2.2 篩選效果

第一步復(fù)篩150個(gè)菌株發(fā)酵平均效價(jià)3860 IU/mL，比對(duì)照3199 IU/mL高20.66%。

第一步復(fù)篩150個(gè)菌株中，有15株發(fā)酵效價(jià)比對(duì)照的低15%，占總數(shù)的10%；有30株發(fā)酵效價(jià)比結(jié)照的高20%以上，占總數(shù)的20%；有52株的發(fā)酵效價(jià)比對(duì)照的高10%以上，占總數(shù)的33.66%。

從上述的結(jié)果可以看出，初篩得到的菌株大部分是正突變。經(jīng)過初篩可以大大減少生物檢測(cè)量。

2.3 WE-2015-1-156、WE-2015-1-899、WE-2015-1-1968菌株在生產(chǎn)應(yīng)用

經(jīng)過多次復(fù)篩，得到的菌株WE-2015-1-156、WE-2015-1-899、WE-2015-1-1968 ，在生產(chǎn)中應(yīng)用WE-2015-1-156共生產(chǎn)120批，平均效價(jià)4560 IU/mL，高于去年平均3920 IU/mL，提高了16.07%；WE-2015-1-899生產(chǎn)99批，平均效價(jià)4490 IU/mL，比去年提高了14.54%，WE-2015-1-1968生產(chǎn)80批，平均效價(jià)4450 IU/mL，比去年提高了13.52%。

3 討論

初篩和復(fù)篩各進(jìn)行兩步，初篩的兩步主要是考慮固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)其伴孢晶體可能不一致，初篩采用凝膠電泳法檢測(cè)毒素蛋白，是因?yàn)榇朔椒焖俸啽?。能在短時(shí)間內(nèi)處理大量的菌株。

復(fù)篩分兩步主是減少生物測(cè)定的工作量，用中試罐進(jìn)行第二次復(fù)篩是因?yàn)閾u瓶與生產(chǎn)的條件存在差異，用小菜蛾進(jìn)行生物毒力效價(jià)測(cè)定是為了保證用于生產(chǎn)的菌種銜定用高產(chǎn)。

綜上所述，以伴孢晶體的形態(tài)和毒素蛋白的含量為指標(biāo)，進(jìn)行固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩次初篩，以搖瓶發(fā)酵液和中試罐發(fā)酵液小菜蛾做生物毒力測(cè)定進(jìn)行復(fù)篩，以提高正突變被選 中概率、提高菌種的選育效率，是Bt生產(chǎn)單位菌種選育的一種較好可行的方法。