涂榮會(huì) 綜述，蒙健軍 審校

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院:1.心血管病研究所；2.老年病學(xué)科,南寧 530021)

再灌注療法是治療急性心肌梗死最有效的方法，但會(huì)引起心臟再灌注損傷，嚴(yán)重影響再灌注的療效及患者的預(yù)后。缺血預(yù)處理和缺血后處理是缺血心肌有效的內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象，具有顯著的抗缺血再灌注損傷作用。

天然免疫系統(tǒng)的激活和炎性反應(yīng)是缺血再灌注損傷的重要特征，其在心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)中的重要作用日益受到關(guān)注[1]。本文就天然免疫系統(tǒng)在MIRI及其保護(hù)作用的研究進(jìn)展予以綜述。

1 心臟缺血再灌注損傷

1960年JENNINGS短暫夾閉犬冠狀動(dòng)脈后再開(kāi)通，發(fā)現(xiàn)犬更易發(fā)生致命性心室顫動(dòng)，顯著增加缺血犬的死亡率，首次提出MIRI理念。隨后大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究進(jìn)一步證實(shí)，再灌注在改善心肌缺血的同時(shí)其本身也會(huì)加重心肌細(xì)胞損傷，出現(xiàn)心肌梗死面積擴(kuò)大、惡性室性心律失常、心臟收縮功能減低等再灌注損傷[2]。近年來(lái)，隨著溶栓療法、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)及冠狀動(dòng)脈旁路搭橋術(shù)等冠狀動(dòng)脈血運(yùn)重建技術(shù)廣泛應(yīng)用于冠心病治療，MIRI越來(lái)越引起學(xué)者的關(guān)注，已經(jīng)成為心血管研究的熱點(diǎn)。MIRI是一種復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚，主要涉及氧化應(yīng)激、免疫炎性反應(yīng)及白細(xì)胞浸潤(rùn)等。其中，天然免疫系統(tǒng)的激活和炎性反應(yīng)是缺血再灌注損傷的重要特征，其在缺血再灌注損傷中的重要作用日益受到關(guān)注。

2 天然免疫系統(tǒng)與心臟

所有多細(xì)胞動(dòng)物均擁有天然免疫系統(tǒng)。天然免疫系統(tǒng)通過(guò)特殊的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識(shí)別入侵的病原體，并通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，啟動(dòng)宿主免疫防御反應(yīng)，是機(jī)體抵抗病原微生物感染的第一道防線。適度的天然免疫反應(yīng)可促進(jìn)機(jī)體組織修復(fù)，但過(guò)度的天然免疫反應(yīng)則會(huì)加重機(jī)體組織損傷。天然免疫系統(tǒng)中能夠識(shí)別病原分子模式的受體包括Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)、補(bǔ)體和天然抗體。

心臟具有完整的先天免疫系統(tǒng)。研究證實(shí)，心肌細(xì)胞不僅具有舒縮功能，而且類似于體內(nèi)的先天性免疫細(xì)胞，也能夠參與機(jī)體的天然免疫應(yīng)答反應(yīng)。心肌細(xì)胞表面存在TLRs、補(bǔ)體等多種PRRs，當(dāng)機(jī)體遭受缺血再灌注損傷及全身炎癥時(shí)，心肌細(xì)胞通過(guò)激活TLRs信號(hào)通路及補(bǔ)體，促進(jìn)一些炎癥因子表達(dá)，啟動(dòng)和介導(dǎo)局部的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致心臟損傷。

3 TLRs與心臟缺血再灌注損傷及保護(hù)作用研究

3.1TLRs結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能 TLRs是最早被人類認(rèn)識(shí)的PRRs，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，主要由富含亮氨酸重復(fù)序列的膜外區(qū)(識(shí)別并結(jié)合病原相關(guān)分子)、跨膜區(qū)和含有Toll/白細(xì)胞介素1受體同源區(qū)(Toll/IL-1 receptor homologous region,TIR)結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)區(qū)(介導(dǎo)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))組成。TLRs廣泛分布于各種免疫及非免疫細(xì)胞之中，主要在心臟、肝臟、胰腺、皮膚、肺及腦等組織中高表達(dá)。除識(shí)別、結(jié)合來(lái)源于病原體的外源性分子以外，TLRs也能識(shí)別、結(jié)合由損傷組織和壞死細(xì)胞釋放的內(nèi)源性損傷相關(guān)分子，如熱休克蛋白，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答，介導(dǎo)炎性反應(yīng)[3]。目前在人類中發(fā)現(xiàn)有11種TLRs(TLR1～10、TLR14)，不同的TLRs識(shí)別不同的病原分子模式和自身組織分子。依據(jù)含TIR結(jié)構(gòu)域接頭蛋白的不同，TLRs信號(hào)通路分為髓樣分化蛋白88(myeloid differential protein-88，MyD88)依賴性和非MyD88依賴性兩條途徑進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。不同TLR，接頭蛋白不同，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也有差異。除TLR3外，其他TLRs均可通過(guò)MyD88依賴性信號(hào)通路活化核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)及p38等信號(hào)通路，促進(jìn)炎性因子生成和釋放；TLR3和TLR4 則介導(dǎo)Toll樣受體轉(zhuǎn)接蛋白通過(guò)非MyD88依賴性信號(hào)通路，激活干擾素β調(diào)節(jié)因子3和NF-κB，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素、各種炎性因子和共刺激分子的產(chǎn)生、釋放[4]。

3.2TLRs與心臟缺血再灌注損傷 心肌缺血缺氧可引起大量損傷相關(guān)分子釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞和組織損傷；盡管再灌注維持了心臟的代謝、結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)也引起了心臟急性炎性反應(yīng)，進(jìn)一步加重心肌損傷，在此過(guò)程中TLRs作為許多損傷相關(guān)分子的靶點(diǎn)，發(fā)揮了重要作用。其中，TLR4和TLR2介導(dǎo)的信號(hào)通路在MIRI中起著關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用。LU等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在心臟缺血再灌注早期，心肌缺血區(qū)及危險(xiǎn)區(qū)的TLR4及NF-κB表達(dá)顯著升高，心肌細(xì)胞凋亡明顯增加；而缺血再灌注TLR4基因缺陷小鼠，其心臟炎性反應(yīng)及心肌梗死面積均顯著減少。此外，研究還發(fā)現(xiàn)抑制TLR4及下游信號(hào)通路MyD88及NF-κB也能減輕MIRI，進(jìn)一步證實(shí)TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路參與了MIRI的發(fā)生、發(fā)展[6-7]。BAGCHI等[8]則發(fā)現(xiàn)，除TLR4外，TLR2在大鼠MIRI過(guò)程中也明顯升高，通過(guò)促進(jìn)左室重構(gòu)引起心臟結(jié)構(gòu)及功能異常。ARSLAN等[9]在小鼠心臟再灌注前5 min應(yīng)用特異性TLR2抗體，小鼠心肌梗死面積顯著減小，心臟功能顯著改善，則進(jìn)一步揭示TLR2信號(hào)通路介導(dǎo)了MIRI。近年來(lái)，TLR9介導(dǎo)的p38 MAPK信號(hào)通路在MIRI中的作用已引起學(xué)者的關(guān)注。XIE等[10]發(fā)現(xiàn)再灌注大鼠心肌TLR9及p38 MAPK蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，心肌細(xì)胞凋亡及心肌梗死面積顯著增加，而應(yīng)用TLR9抑制劑氯喹則取消了上述作用，顯示TLR9介導(dǎo)了MIRI。總之，TLRs是MIRI的重要受體，其信號(hào)通路激活所介導(dǎo)的炎性反應(yīng)及心肌細(xì)胞凋亡是MIRI的重要機(jī)制，積極干預(yù)TLRs信號(hào)通路可能是減輕MIRI新靶點(diǎn)。

3.3TLRs與心臟缺血預(yù)處理 心臟缺血預(yù)處理即心臟經(jīng)過(guò)數(shù)次短暫的缺血再灌注處理可改善其后長(zhǎng)時(shí)間冠狀動(dòng)脈閉塞引起的心肌損傷，是機(jī)體組織自身對(duì)抗缺血再灌注損傷的一種強(qiáng)而有效內(nèi)源性保護(hù)措施，在冠心病防治、心臟保存及心臟移植等方面具有重要意義。TLRs信號(hào)通路在缺血預(yù)處理心臟保護(hù)中的重要作用已得到廣泛研究。ZHOU等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TLR-9配體(CpG-ODN)預(yù)處理通過(guò)抑制心肌細(xì)胞能量代謝、促進(jìn)心肌血管生成，進(jìn)而改善急性心肌梗死小鼠的心功能。DONG等[12]研究顯示缺血預(yù)處理顯著改善再灌注野生型小鼠的心功能，減少損傷性肌酸激酶的釋放，這種保護(hù)作用在LR2及TIR適配蛋白(TIRAP)基因缺陷小鼠消失，提示TLR2-TIRAP信號(hào)通路介導(dǎo)心臟缺血預(yù)處理。同樣，應(yīng)用TLR2配體(Pam3CSK4)預(yù)處理能夠顯著減輕小鼠缺血區(qū)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥因子產(chǎn)生及心肌細(xì)胞凋亡，同時(shí)降低血清肌鈣蛋白T水平,減小心肌梗死面積、改善心臟功能。進(jìn)一步研究顯示，磷脂酰肌醇3激酶一蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B，PI3K/Akt)生存通路介導(dǎo)了缺血預(yù)處理心臟保護(hù)[13]。最近LEE等[14]發(fā)現(xiàn)TLR4信號(hào)通路同樣在缺血預(yù)處理心臟保護(hù)中發(fā)揮重要調(diào)控作用。應(yīng)用TLR-4 拮抗劑eritoran預(yù)處理，小鼠NF-κB的活化、促炎因子的表達(dá)明顯減少，小鼠心肌梗死面積顯著減小。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究顯示缺血預(yù)處理及遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路改善MIRI[15]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)地塞米松預(yù)處理，紫檀芪預(yù)處理也是通過(guò)下調(diào)TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮心臟保護(hù)作用的[16-17]。因此，針對(duì)TLRs及下游信號(hào)通路積極干預(yù)對(duì)缺血預(yù)處理心臟保護(hù)具有重要臨床意義。

3.4TLRs與心臟缺血后處理 由于心肌缺血事件的不可預(yù)料性，缺血預(yù)處理的臨床應(yīng)用有一定的局限性。2003年有研究首次提出了一種新的內(nèi)源性心肌保護(hù)方法——缺血后處理，即心肌發(fā)生缺血后在長(zhǎng)時(shí)間的再灌注前對(duì)缺血心肌反復(fù)實(shí)施短暫的缺血再灌注處理，可以顯著減輕MIRI。大量的基礎(chǔ)研究及臨床試驗(yàn)均證實(shí)缺血后處理可顯著減少再灌注心肌梗死面積及惡性心律失常的發(fā)生，減少心肌壞死與凋亡，顯著改善心臟功能[18]。由于可在缺血后再灌注期間進(jìn)行，缺血后處理具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。TLR信號(hào)通路是否參與心臟缺血后處理目前少有研究報(bào)道。近期，KIM等[19]研究顯示TLR9配體后處理通過(guò)激活TLR9發(fā)揮心臟保護(hù)作用，而應(yīng)用PI3K特異性抑制劑渥曼青霉素，小鼠心肌梗死面積顯著增加，提示這種心臟保護(hù)作用是由TLR9-PI3K信號(hào)通路介導(dǎo)的。ZHANG等[15]報(bào)道七氟烷后處理通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路改善MIRI。而TLR2、TLR3等其他TLRs信號(hào)通路在心臟缺血后處理中的重要作用有待進(jìn)一步研究。

4 補(bǔ)體系統(tǒng)激活與MIRI及保護(hù)作用研究

4.1補(bǔ)體系統(tǒng)激活與MIRI 補(bǔ)體是存在于人和動(dòng)物血清、組織液和細(xì)胞膜表面的一組不耐熱、經(jīng)活化后具有酶活性、可介導(dǎo)免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)的蛋白質(zhì)。補(bǔ)體系統(tǒng)由固有成分(C1～C9、B因子、D因子、甘露聚糖結(jié)合凝集素)、調(diào)控蛋白(血漿可溶性因子及細(xì)胞膜結(jié)合蛋白)和受體等30余種蛋白質(zhì)組成。作為天然免疫系統(tǒng)的一部分，補(bǔ)體系統(tǒng)不僅通過(guò)病原相關(guān)分子模式激活，也可通過(guò)缺血再灌注期間釋放的內(nèi)源性損傷相關(guān)分子所激活，通過(guò)經(jīng)典途徑、甘露糖結(jié)合凝集素途徑和旁路途徑，最終導(dǎo)致C3的降解和C5的激活，形成攻膜復(fù)合體[1]。攻膜復(fù)合體插入細(xì)胞膜形成貫通胞膜的圓形親水離子通道，引起鈉、鈣離子和水分子內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞鈣超載，最終引起細(xì)胞腫脹、裂解死亡；同時(shí)攻膜復(fù)合體可刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)IL、血小板活化因子、P選擇素及單核細(xì)胞趨化蛋白-1，引起中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞募集到損傷心肌介導(dǎo)炎癥損傷；此外，攻膜復(fù)合體和C5a也可通過(guò)誘導(dǎo)p21蛋白(ras基因家族編碼的蛋白質(zhì))的表達(dá)引起細(xì)胞凋亡；更為重要的是在補(bǔ)體激活過(guò)程中產(chǎn)生的補(bǔ)體活性成分及其一系列C3a、C5a等裂解片段，通過(guò)促進(jìn)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞募集到損傷心肌，產(chǎn)生氧自由基、各種蛋白水解酶，促進(jìn)炎癥介質(zhì)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1、IL-6、NF-κB等釋放，引起心肌細(xì)胞的壞死和凋亡，導(dǎo)致心肌損傷。

早在1971年HILL等提出，補(bǔ)體系統(tǒng)在MIRI中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其中C5、C3是引起心肌細(xì)胞凋亡及組織損傷的關(guān)鍵介質(zhì)[20]。研究表明，MIRI后C5aR mRNA 和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。再灌注C5aR基因敲除的小鼠其心肌組織C3沉積和白細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，同時(shí)心肌細(xì)胞凋亡及心肌梗死面積顯著減少，心功能顯著改善[21]。同樣，抑制心肌組織C3沉積及蛋白表達(dá)，亦可改善小鼠MIRI[22]。除C5、C3外，補(bǔ)體B因子在MIRI中的作用日益受到關(guān)注。研究顯示，心肌缺血再灌注過(guò)程中可激活補(bǔ)體B因子，進(jìn)而促進(jìn)心肌C3活化，引起肌鈣蛋白I釋放，心肌梗死面積擴(kuò)大；而缺血再灌注補(bǔ)體B因子基因缺陷的小鼠，其心肌C3活化和肌鈣蛋白I釋放顯著減少，心肌梗死面積顯著縮小[23]。總之，補(bǔ)體與MIRI密不可分，MIRI能夠上調(diào)一些補(bǔ)體成分的表達(dá)并導(dǎo)致補(bǔ)體的激活，而激活的補(bǔ)體成分通過(guò)直接和間接效應(yīng)介導(dǎo)MIRI。

4.2補(bǔ)體系統(tǒng)與心臟缺血預(yù)處理 2000年，TANHEHCO等發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)處理通過(guò)減少兔心臟缺血區(qū)C1、C3、C8、C9及攻膜復(fù)合體的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)減輕MIRI，初步證實(shí)心臟缺血預(yù)處理通過(guò)抑制補(bǔ)體系統(tǒng)激活發(fā)揮再灌注心臟保護(hù)作用。在小鼠缺血前30 min分別應(yīng)用C5的單克隆抗體(BB5．1)和C3a 受體拮抗劑 (C3aRA)，再灌注心肌的炎性反應(yīng)及組織損傷明顯減輕。最近，TANG等[24]應(yīng)用C5 shRNA預(yù)處理大鼠，發(fā)現(xiàn)大鼠損傷性血肌鈣蛋白T顯著減少，心肌組織TNF-α等炎癥因子水平顯著下降，同時(shí)心肌梗死面積明顯減少40%，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該保護(hù)作用是由PI3K/Akt生存通路介導(dǎo)的。

4.3補(bǔ)體系統(tǒng)與心臟缺血后處理 心臟缺血后處理對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)調(diào)控鮮見(jiàn)研究報(bào)道。近期臨床試驗(yàn)顯示，對(duì)行冠脈旁路搭橋術(shù)的急性ST段抬高型心肌梗死患者應(yīng)用C1、C5抑制劑，即C1、C5抑制劑后處理，不僅安全，而且有效減輕MIRI，改善心功能。本課題組近期發(fā)現(xiàn)心臟缺血后處理顯著減少缺血再灌注大鼠全身炎性反應(yīng)及心臟C3、C5的mRNA和蛋白表達(dá)，通過(guò)調(diào)控心臟天然免疫系統(tǒng)，減輕MIRI，具體機(jī)制有待深入研究。

5 結(jié) 語(yǔ)

TLRs一直是免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)，盡管動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外研究已經(jīng)證實(shí)，抑制不同TLRs信號(hào)通路可有效保護(hù)MIRI，然而針對(duì)心肌梗死患者抑制TLRs是否能夠挽救心肌進(jìn)一步損傷目前尚無(wú)研究報(bào)道。在臨床試驗(yàn)進(jìn)行前，進(jìn)一步闡明不同TLRs介導(dǎo)的MIRI機(jī)制是未來(lái)的一個(gè)重要研究方向。補(bǔ)體系統(tǒng)包括一系列蛋白質(zhì)，針對(duì)不同環(huán)節(jié)的補(bǔ)體靶向藥物能在不同水平抑制補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這也提供了許多急性心肌梗死藥物介入靶點(diǎn)。一份納入了4個(gè)臨床研究包含5 916份病例的系統(tǒng)回顧顯示，采用新型的C5抑制劑pexelizumab治療，能夠降低急性心肌梗死患者行冠脈搭橋術(shù)的病死率。然而受補(bǔ)體抑制劑發(fā)揮療效的治療窗較窄、組織穿透性差、患者個(gè)體差異等多重因素的影響，補(bǔ)體靶向藥物保護(hù)性結(jié)果在臨床中可能出現(xiàn)復(fù)雜不一致的現(xiàn)象。針對(duì)心肌梗死患者，如何開(kāi)發(fā)安全有效的補(bǔ)體靶向藥物值得深入研究?？傊?，TLRs信號(hào)通路及補(bǔ)體激活所介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答是導(dǎo)致MIRI的重要機(jī)制。通過(guò)對(duì)缺血預(yù)處理及缺血后處理抗MIRI的免疫機(jī)制深入研究，探討針對(duì)TLRs信號(hào)通路及補(bǔ)體系統(tǒng)可能的作用靶點(diǎn)，對(duì)于缺血預(yù)處理及后處理的臨床應(yīng)用,減輕、預(yù)防MIRI,改善急性心肌梗死患者的心肌存活及長(zhǎng)期預(yù)后,具有十分重要的意義。