孫冬陽(yáng),呼鑫榮,薛文通,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心,食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)北京食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

豌豆(PisumsativumL.)又名荷蘭豆、雪豆、畢豆等,是春播一年生或秋播越年生的攀緣性草本植物[1]。豌豆具有較強(qiáng)的耐寒性和較廣的適應(yīng)性,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,是集糧食生產(chǎn),鮮食蔬菜、食品加工、綠肥、飼料于一體的多用途作物,具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。豌豆中的營(yíng)養(yǎng)較為全面均衡,碳水化合物約占60%,是主要的能量來(lái)源,而豌豆蛋白含量次之,含有8種人體必需氨基酸,其中賴(lài)氨酸含量最高,含硫氨基酸較低,豌豆蛋白的生物價(jià)為48%～64%,功效比為0.6～1.2,高于大豆而低于玉米、水稻、小麥、花生[2]。豌豆中含有豐富的維生素B1、B2、尼克酸、維生素C,同時(shí)又是優(yōu)質(zhì)鉀、鐵、磷等礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)源[3]。豌豆中除了含有這些營(yíng)養(yǎng)成分外,還含有多肽、膳食纖維、胰蛋白酶抑制劑、酚類(lèi)化合物、植物凝集素[4]等功效成分。這些功效成分具有很高的生理活性,但常常被人忽略。本文綜述了近年來(lái)豌豆功效成分的提取及其生物學(xué)功能,以期為豌豆在各種食品中的應(yīng)用及功能性食品的開(kāi)發(fā)與研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 豌豆功效成分提取及生理活性

1.1 豌豆多肽的提取純化及生理活性

豌豆多肽是指以豌豆蛋白為原料,經(jīng)酶水解、分離純化后得到的與豌豆蛋白氨基酸組成基本一致的多肽混合物。豌豆多肽溶解度高、保水性好、有較強(qiáng)的乳化穩(wěn)定性和凝膠形成性。根據(jù)功能特性可以將其分為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽、降膽固醇肽、抗氧化肽、免疫調(diào)節(jié)肽、抗癌活性肽等[5]。目前豌豆多肽的制備方法主要為酶解法,純化方法主要有超濾、層析、色譜分離等技術(shù)。酶解法主要是利用植物中的蛋白酶或動(dòng)物體中的消化酶對(duì)豌豆蛋白進(jìn)行水解,得到豌豆多肽[6],常用的酶主要有木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶等。

每種蛋白酶都有其特定的氨基酸識(shí)別位點(diǎn),因此蛋白質(zhì)在不同蛋白酶的水解下可以得到不同的酶解產(chǎn)物,同時(shí)同種蛋白酶在不同水解條件下,其水解程度不同,亦可得到具有不同功能特性的生物活性肽。Niehues等[7]使用胰蛋白酶水解豌豆蛋白,并將水解液依次通過(guò)超濾、排阻色譜純化,得到分子量<10 kDa的豌豆抗菌肽,該豌豆抗菌肽可通過(guò)降低幽門(mén)螺旋桿菌(Helicobacterpylori)對(duì)胃上皮細(xì)胞的粘附性,來(lái)降低嬰幼兒對(duì)幽門(mén)螺旋桿菌的感染率。田亞平等[8]采用雙酶法,將豌豆蛋白依次使用胰蛋白酶、中性蛋白酶酶解,酶解液經(jīng)凝膠層析、反相層析純化后得到的分子量<2 kDa的、活性較高的豌豆抗氧化肽,其DPPH自由基的清除能力與相同濃度下谷胱甘肽的DPPH自由基清除能力相當(dāng)。朱玲[9]使用堿性蛋白酶水解豌豆蛋白,將水解液超濾后得到分子量在1 kDa以下、活性較高的豌豆ACE抑制肽,經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該活性肽具有降低高血壓患者的血壓的作用。Ndiaye等[10]使用嗜熱菌蛋白酶對(duì)豌豆蛋白進(jìn)行水解,超濾后得到分子量約為3kDa的豌豆多肽,通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可以顯著抑制TNF-α、IL-6和NO的產(chǎn)生,并增加IgA的數(shù)量,從而具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用。

1.2 膳食纖維的提取及生理活性

膳食纖維(dietary fiber,DF)被定義為聚合度≥3、天然存在、通過(guò)不同手段處理或人造的不被小腸中內(nèi)源性水解酶水解的,對(duì)人體健康有益的可食用性碳水化合物[11]。包括木質(zhì)素、纖維素、半纖維素、樹(shù)膠、果膠、果膠類(lèi)似物等成分[12]。按溶解性可分為水溶性膳食纖維和水不溶性膳食纖維。水不溶性纖維包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素;水溶性纖維包括寡糖、果膠、β-葡聚糖和半乳甘露膠[13]。膳食纖維具有獨(dú)特的物化性能,如其結(jié)構(gòu)中存在許多親水性基團(tuán),因而具有良好的持水力和膨脹性[14];膳食纖維結(jié)構(gòu)中含有許多活性基團(tuán),它們依靠氫鍵或疏水鍵之間的相互作用產(chǎn)生吸附作用[15]。水溶性膳食纖維可以被腸道微生物完全發(fā)酵降解,而不溶性膳食纖維幾乎不能被腸道微生物菌群發(fā)酵降解[16]。

豌豆中含有豐富的膳食纖維。近年來(lái),對(duì)于豌豆中膳食纖維的提取大多采用酶解法。使用淀粉酶和蛋白酶對(duì)豌豆原料進(jìn)行水解后即可得到豌豆不溶性膳食纖維(Pea Insoluble Dietary fiber,PIDF)[17]。邵娟娟[18]使用纖維素酶和木聚糖酶分別對(duì)豌豆皮中的水溶性膳食纖維(Pea Soluble Dietary fiber,PSDF)進(jìn)行提取,在pH為4.59時(shí)添加118 U/g PIDF纖維素酶水解4.98 h,水溶性膳食纖維的得率為36.28%,pH為5.10時(shí)添加木聚糖酶水解,水溶性膳食纖維的得率為48.57%。Che等[19]以斷奶仔豬為模型研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期攝入豌豆膳食纖維可以通過(guò)增加粘蛋白和sIgA的蛋白質(zhì)表達(dá),來(lái)改善結(jié)腸的屏障功能,通過(guò)改變與結(jié)腸癌、免疫反應(yīng)和脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因表達(dá)和信號(hào)通路來(lái)改善哺乳動(dòng)物的結(jié)腸功能。Hashemi等[20]研究發(fā)現(xiàn),豌豆膳食纖維可以增加結(jié)腸中編碼粘蛋白的mRNA的表達(dá)、增加血清乙酸鹽和丙酸鹽的濃度,從而降低高脂飲食誘導(dǎo)的葡萄糖不耐受大鼠的血糖濃度。有研究表明,長(zhǎng)期攝入豌豆膳食纖維可以增加單胃動(dòng)物結(jié)腸中產(chǎn)甲烷菌的種群多樣性、數(shù)量及活性,維持腸道中較低的氫氣壓強(qiáng),提高結(jié)腸中微生物發(fā)酵的效率,促進(jìn)有機(jī)物質(zhì)的降解[21]。

1.3 豌豆中胰蛋白酶抑制劑的提取及生理活性

胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor,TI)屬于絲氨酸族抑制劑,是指能夠抑制胰蛋白酶及其類(lèi)似物活性的天然存在的一類(lèi)小分子蛋白質(zhì)或多肽[22]。它可以與胰蛋白酶上的絲氨酸位點(diǎn)結(jié)合,形成穩(wěn)定的復(fù)合物使酶失活,從而起到抑制作用[23]。根據(jù)胰蛋白酶抑制劑中的反應(yīng)位點(diǎn)數(shù)目、相對(duì)分子量及半胱氨酸含量差異,將其分為Bowman-Birk型、Kunitz型、Potato I、Potato II型及Kazal型胰蛋白酶抑制劑,豆類(lèi)種子中主要是Bowman-Birk型(BBI)“雙頭抑制劑”和Kunitz型(KTI)“單頭抑制劑”[24]。胰蛋白酶抑制劑既可防止外源蛋白酶對(duì)動(dòng)植物體的損傷,又可協(xié)同內(nèi)源蛋白酶調(diào)節(jié)動(dòng)植物體各項(xiàng)生命活動(dòng)[25]。

豌豆中含有較多的胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor,TI)[26],俞紅恩等[27]采用非還原Gelatin-PAGE電泳法發(fā)現(xiàn),豌豆中的胰蛋白酶抑制劑有13種亞型,其中以A1、A2兩種亞基為主,且所得豌豆TI具有較強(qiáng)的高鹽穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。有研究表明,采用超聲輔助水浸法提取豌豆胰蛋白酶抑制劑,在料液比為1∶100 (g/mL)、超聲溫度50 ℃、超聲功率500 W的條件下超聲16 min時(shí)所得豌豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)胰蛋白酶的抑制活性最高,為574.54 TIU/g[28]。

作為一種抗?fàn)I養(yǎng)因子,胰蛋白酶抑制劑可以降低胰蛋白酶活性并降低人體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。而作為一種生理活性蛋白,TI可以調(diào)節(jié)人體的許多生理代謝活動(dòng),如抑癌消炎[29]、輻射保護(hù)、降血糖[30]、抗病蟲(chóng)[31]、抗病毒[32]等。XY Ye等[33]使用親和色譜、離子交換色譜、快速蛋白質(zhì)液相色譜從豌豆中分離純化出BBI型蛋白酶抑制劑,同時(shí)發(fā)現(xiàn)該抑制劑能夠抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶活性。Clemente等[34]發(fā)現(xiàn),rTI1B型豌豆胰蛋白酶抑制劑可以以劑量依賴(lài)的方式來(lái)抑制HT29型結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。

1.4 豌豆中酚類(lèi)化合物的提取及其生理活性

酚類(lèi)化合物是指芳香烴中苯環(huán)上的氫原子被羥基取代所生成的化合物。包括黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)、單寧類(lèi)和花色苷類(lèi)化合物及其衍生物。Duenas等[35]使用甲醇-鹽酸水溶液對(duì)Fidelia和ZP-840兩種豌豆的種皮和子葉進(jìn)行浸提,依次使用乙醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取,將得到的提取液進(jìn)行HPLC-PAD和HPLC-MS分析發(fā)現(xiàn),兩種豌豆中含有槲皮素,木犀草素、芹菜素苷、原花青素單體及二聚體、羥基苯甲酸、羥基肉桂酸、黃酮、黃酮醇苷、蘋(píng)果酸及反式白藜蘆醇-3-葡萄糖苷。Timoracká等[36]將黃色豌豆種子用酸水解后經(jīng)HPLC-DAD分析發(fā)現(xiàn)黃色豌豆種子中含有山奈酚、芹菜素、染料木黃酮和大豆黃素四種類(lèi)黃酮。

研究表明,使用丙酮-水(7∶3 v/v)混合物對(duì)豌豆種皮進(jìn)行萃取、柱層析餾分,得到的提取物不但對(duì)黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生的超氧陰離子自由基有較強(qiáng)的清除作用,同時(shí)還具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用[37]。Troszynska等[38]用80%甲醇水溶液對(duì)有色種皮豌豆(Coloured Varieties of Pea,Pisum sativum L.)的種皮進(jìn)行浸提,之后使用乙醚萃取得到酚酸,用70%丙酮水溶液提取縮合單寧。之后使用HPLC進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),在有色種皮豌豆中含有原兒茶酸、龍膽酸、香草酸和縮合單寧。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)有色種皮豌豆中的提取物對(duì)磷脂酰膽堿脂質(zhì)體過(guò)氧化具有較強(qiáng)的抑制作用。Nemanja等[39]使用丙酮-乙酸水溶液對(duì)歐洲深色豌豆品種的種皮進(jìn)行避光浸提,采用HPLC-MS對(duì)提取物中的酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行鑒定及含量測(cè)定,發(fā)現(xiàn)其沒(méi)食子酸、表沒(méi)食子兒茶素、柚皮素和芹菜素形式的總酚含量高達(dá)46.56 mg GAE/g,具有很強(qiáng)的抗氧化活性,同時(shí)對(duì)該提取物進(jìn)行體外抗癌鑒定發(fā)現(xiàn),該品種中的酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)人結(jié)腸腺癌LS174、人乳腺癌MDA-MB-453、人肺癌A594和骨髓性白血病K562四種惡性細(xì)胞系有著濃度依賴(lài)性細(xì)胞毒性作用,可激活除半胱天冬酶-3依賴(lài)性細(xì)胞凋亡以外的其他細(xì)胞死亡形式,從而達(dá)到抗癌作用。

1.5 豌豆中植物凝集素的提取及其生理活性

植物凝集素是指從植物中提取的,能夠凝集細(xì)胞并可以與單糖、寡糖可逆結(jié)合的非免疫來(lái)源的非酶類(lèi)蛋白質(zhì)[40]。根據(jù)植物凝集素的亞基特征可將其分為部分凝集素、全凝集素、超凝集素和嵌合凝集素。按結(jié)合糖的類(lèi)型,植物凝集素可分為D-甘露糖或D-葡萄糖凝集素、D-半乳糖凝集素、L-巖藻糖凝集素、N-乙酰氨基葡萄糖凝集素、N-乙酰氨基半乳糖凝集素和N-乙酰神經(jīng)氨酸凝集素[41]。植物凝集素具有凝集紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、精子、細(xì)菌,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡自噬,抗真菌、病毒、病蟲(chóng)害,儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等功能[42]。

針對(duì)豌豆凝集素的提取,Sitohy等[43]采用Tris-HCl-CaCl2-MgCl2-MnCl2-NaN3混合液對(duì)埃及豌豆種子(Egyptian Pisum sativum seeds)進(jìn)行浸提,依次使用乙酸,NaOH對(duì)提取液進(jìn)行蛋白沉淀,得到豌豆凝集素粗提物,隨后使用DEAE瓊脂糖柱離子交換層析和Sephadex G100柱對(duì)粗提物進(jìn)行純化得到豌豆凝集素,通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該豌豆凝集素富含羥基氨基酸但不含含硫氨基酸,可以抑制黃曲霉、綠色木霉和尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)。Elaassar等[44]采用相同的方法從埃及豌豆種子中純化得到凝集素,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)豌豆凝集素可以通過(guò)上調(diào)P53基因的表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式起到抗肝癌的作用。TB Ng等[45]通過(guò)DEAE纖維素陰離子交換層析、SP-Sepharose陽(yáng)離子交換層析、快速蛋白液相層析(FPLC)凝膠過(guò)濾法從豌豆中分離純化出甘露糖/葡萄糖特異性凝集素,通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該綠色豌豆凝集素可促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞的有絲分裂并可抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的活性。

2 豌豆中功效成分在食品工業(yè)中的應(yīng)用

在面制品中,加入適量的豌豆膳食纖維可以增加面團(tuán)持水力、延緩面包老化[46],減少面食的蒸煮損失率[47],在酥性餅干中加入豌豆膳食纖維既可改善酥性餅干的質(zhì)構(gòu)特性和感官品質(zhì)又可增加餅干的保健功能[48]。

在肉制品中,將適量的豌豆膳食纖維加入到牛肉[49]、雞肉[50]等肉制品中可以取代部分肉和脂肪,從而改善其營(yíng)養(yǎng)特性和烹飪性能,在不影響其感官接受度的同時(shí)降低生產(chǎn)成本。經(jīng)中性蛋白酶和堿性蛋白酶酶解得到的豌豆肽其乳化性和起泡性均有顯著提高,添加到肉糜中可以降低其蒸煮損失率,增加其粘聚性、彈性和咀嚼性,可部分代替肉糜添加到肉制品中[51]。

豌豆中含有的多肽、膳食纖維、蛋白酶抑制劑、酚類(lèi)化合物、植物凝集素等功效成分,具有抗菌、抗糖尿病、抗炎、抗高膽固醇血癥、抗癌和抗氧化活性的生理功能,不僅可用于開(kāi)發(fā)輔助降血糖、降血壓功能食品還可以用來(lái)生產(chǎn)天然抑菌劑、天然抗氧化劑、臨床抗癌藥物、抗炎癥藥物。

3 展望

目前研究表明,豌豆中的豌豆多肽具有較強(qiáng)的抗菌、抗氧化、降血壓和免疫調(diào)節(jié)作用,但對(duì)其氨基酸序列、多肽結(jié)構(gòu)及其與多肽活性功能之間的關(guān)系尚未完全闡明,還需進(jìn)行深入探究。豌豆中的膳食纖維可以預(yù)防結(jié)腸癌并降低血糖濃度,但對(duì)其分子結(jié)構(gòu)及其他功能活性仍需進(jìn)一步研究。豌豆中的蛋白酶抑制劑作為一種生理活性蛋白可以抑制早期結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的增殖及HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶活性,但對(duì)其作用機(jī)理目前仍不明確,需進(jìn)行深入研究。豌豆中的酚類(lèi)化合物具有抗氧化、抗癌的作用,但實(shí)驗(yàn)還僅限于體外抑制作用,而未對(duì)其進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探究,因此對(duì)其活性與功能之間的關(guān)系急待進(jìn)一步研究。豌豆中的植物凝集素可以抑制黃曲霉、綠色木霉和尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng),但其抑菌機(jī)理并不明確,未來(lái)可對(duì)其抑菌機(jī)理進(jìn)行深入探究。

豌豆作為一種重要的糧用作物,在我國(guó)種植廣泛。但目前我國(guó)對(duì)豌豆的深加工仍集中在在蛋白、淀粉的提取及粉絲制做,而忽視了其他功效成分的開(kāi)發(fā)和利用,使得豌豆的經(jīng)濟(jì)價(jià)值無(wú)法充分體現(xiàn)。因此,在未來(lái)的研究中既要對(duì)豌豆中的生物活性成分進(jìn)行深入的基礎(chǔ)性研究,探究其生理活性功能、構(gòu)效關(guān)系及其作用機(jī)理,為豌豆的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供強(qiáng)有力的理論支撐;同時(shí)應(yīng)不斷優(yōu)化豌豆中功效成分提取工藝,使之可以應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn);不斷創(chuàng)新研發(fā)各種新資源豌豆功能性食品、藥品、護(hù)膚品,進(jìn)一步提高豌豆在食品、醫(yī)藥等方面的利用價(jià)值,拓展豌豆的應(yīng)用前景。