戴舒雅， 周陽， 施海峰， 顧杰

(江蘇大學(xué) 生命科學(xué)研究院， 鎮(zhèn)江 212013)

鎘作為環(huán)境中普遍存在的重金屬污染物，可通過多種途徑進(jìn)入人體。長期鎘暴露導(dǎo)致體內(nèi)的鎘含量積累，破壞肝、腎等器官的結(jié)構(gòu)和功能，對機體的生殖、免疫和神經(jīng)等系統(tǒng)造成不同程度的損傷[1]?，F(xiàn)有的研究結(jié)果揭示鎘的生物學(xué)毒性機制主要是由鎘誘導(dǎo)內(nèi)氧化應(yīng)激，增加氧化壓力，損傷DNA，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[2]。目前，自噬也被認(rèn)為是鎘生物學(xué)毒性的重要機制之一。

自噬是真核細(xì)胞內(nèi)一種進(jìn)化保守的自我消化機制，是負(fù)責(zé)將受損的細(xì)胞器、錯誤折疊的蛋白及其他大分子物質(zhì)等運送至溶酶體降解并再利用的過程。在哺乳動物細(xì)胞中，根據(jù)細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)到達(dá)溶酶體的途徑不同，自噬可分為3種類型：微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)及分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy, CMA)。一般情況下自噬是細(xì)胞的一種自我保護機制，是調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的主要途徑之一。自噬效應(yīng)的發(fā)生取決于自噬流過程是否完成。自噬流，即自噬的完整動態(tài)過程，包括自噬體形成、自噬體與溶酶體融合及后續(xù)內(nèi)含物的降解和回收[7]。LC3-II是研究細(xì)胞自噬的一個重要標(biāo)志物，LC3-II的形成與自噬的發(fā)生有關(guān)，但磷脂酰乙醇胺修飾的LC3-II水平升高只是反應(yīng)自噬信號的發(fā)生。而溶酶體與自噬體的融合及降解(p62蛋白降解)是自噬流完成的關(guān)鍵步驟，是最終決定自噬效應(yīng)的標(biāo)志[8]。因此，對自噬的研究有必要結(jié)合LC3-II的形成和P62蛋白變化情況。

研究表明，鎘處理WI38(肺上皮成纖維細(xì)胞)、WLR38可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、抑制細(xì)胞凋亡從而緩解鎘引起的毒性損傷[9]。也有研究認(rèn)為，在MES-13、NEK-52E(大鼠腎小管上皮細(xì)胞)、PC-12(腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞)中，鎘可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性死亡。綜上表明，鎘誘導(dǎo)的自噬在不同遺傳背景的細(xì)胞會產(chǎn)生不同的生理效應(yīng)。Ca2+作為一個多功能的信使分子，它能夠調(diào)控多種細(xì)胞功能，包括增殖、分化、遷移和細(xì)胞死亡，自噬體以Ca2+敏感的方式參與并與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，是細(xì)胞自噬效應(yīng)中一個重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)[14]。但Ca2+在鎘誘導(dǎo)的自噬過程中的作用目前尚不明確。因此，本文概述當(dāng)前鎘與自噬關(guān)系的研究現(xiàn)狀，以及鈣在自噬中的作用，探究鎘誘導(dǎo)不同細(xì)胞的自噬效應(yīng)機制及與鈣離子作用的內(nèi)在聯(lián)系。

1 鎘誘導(dǎo)和抑制自噬調(diào)控細(xì)胞存活

許多關(guān)于鎘誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究中，都表明自噬是細(xì)胞存活和凋亡的關(guān)鍵點。Hitomi研究發(fā)現(xiàn)鎘處理RMC(大鼠腎小球系膜細(xì)胞)可誘導(dǎo)ATG16基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞自噬，并維持了細(xì)胞的生存能力，而沉默該基因后，則增加了鎘引起的細(xì)胞凋亡[15]。在PC-12細(xì)胞中，鎘誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，通過引發(fā)自噬抑制了細(xì)胞的凋亡[16]。在NRK52E腎臟細(xì)胞中，鎘誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時引發(fā)自噬信號及自噬流完成，自噬抑制劑CQ與鎘共處理，則加重了細(xì)胞的凋亡[8]。上述研究認(rèn)為在鎘暴露條件下，自噬是細(xì)胞應(yīng)激適應(yīng)和保護機制。然而，也有研究認(rèn)為鎘激活自噬也是誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的原因。Son認(rèn)為，鎘經(jīng)ROS-LKB1-AMPK信號途徑誘導(dǎo)的自噬是導(dǎo)致小鼠表皮細(xì)胞JB6細(xì)胞毒性的主要原因[17]。Gu發(fā)現(xiàn)，在腎小球系膜細(xì)胞中，鎘通過ROS-GSK-3β和Ca2+-ERK自噬途徑誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性死亡，導(dǎo)致腎毒性[9]。

Meng等人探究鎘誘導(dǎo)WRL-68細(xì)胞自噬的機制中發(fā)現(xiàn)，鎘誘導(dǎo)自噬，激活溶酶體功能依賴于自噬小體與溶酶體的融合。鎘與自噬的抑制劑共處理，自噬流被抑制，溶酶體活性明顯降低。結(jié)果表明鎘不僅可以促進(jìn)WRL-68細(xì)胞的自噬，還能通過激活溶酶體功能刺激自噬的成熟和降解[18]。Lee等人認(rèn)為鎘可干擾自噬的不同階段，破壞腎近端小管細(xì)胞的自噬作用[12]。在Liu等人對鎘誘導(dǎo)細(xì)胞(rPT)凋亡與自噬的研究中發(fā)現(xiàn)，鎘暴露導(dǎo)致原代大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞(rPT)和小鼠腎小管上皮細(xì)胞(mRTEC)中LC3-II和P62蛋白的累積，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放，抑制了自噬體與溶酶體的融合，阻斷自噬流，抑制了自噬，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19-20]。上述結(jié)果表明，在不同遺傳背景細(xì)胞中，鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬抑制或促進(jìn)死亡。而在一些細(xì)胞中鎘抑制自噬體與溶酶體的融合，導(dǎo)致自噬流阻斷,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

2 鎘對溶酶體的影響

溶酶體作為細(xì)胞內(nèi)重要的“消化”器官，其腔內(nèi)是一個酸性環(huán)境，pH約為4.5～5.0，低于細(xì)胞溶質(zhì)(pH 7.2)，這也是溶酶體發(fā)揮功能的重要因素之一。溶酶體內(nèi)腔包含多種離子通道來維持溶酶體內(nèi)部的酸性環(huán)境，如H+對保持溶酶體酸性水解酶活性起重要作用；鈣離子負(fù)責(zé)囊泡轉(zhuǎn)移；K+調(diào)節(jié)溶酶體膜電位和溶酶體內(nèi)Ca2+平衡；Cl-作為陰離子調(diào)節(jié)溶酶體膜電位[21-22]。已有研究發(fā)現(xiàn)，鎘處理WRL-68細(xì)胞，增強了細(xì)胞溶酶體的酸性，促進(jìn)了自噬[18]。鎘處理Neuro-2a細(xì)胞后，Cd抑制該細(xì)胞自噬體-溶酶體融合，降低溶酶體功能及溶酶體相關(guān)膜蛋白，抑制溶酶體蛋白水解，改變?nèi)苊阁wpH，導(dǎo)致自噬清除缺陷并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Cd誘導(dǎo)TFEB核轉(zhuǎn)位及TFEB靶基因的表達(dá)，與溶酶體功能受損、損害自噬流密切相關(guān)。而通過TFEB過表達(dá)，則恢復(fù)了溶酶體相關(guān)膜蛋白的表達(dá)水平和溶酶體pH，抵抗了鎘誘導(dǎo)的毒性[23]。綜上表明，鎘在不同細(xì)胞中引起不同的自噬效應(yīng)，其內(nèi)在的機制可能是鎘對各細(xì)胞內(nèi)溶酶體酸性及與自噬小體融合的影響不同，進(jìn)而影響溶酶體功能的發(fā)揮。

3 鈣離子在鎘影響自噬中的作用

3.1 鈣與自噬

自噬主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的表面觸發(fā)自噬膜的形成，通過細(xì)胞骨架相關(guān)的運動，自噬體以Ca2+敏感的方式參與，并與溶酶體融合，形成自噬溶酶體[24]。參與調(diào)控自噬的mTOR信號通路和Beclin-1/Bcl-2通路都被認(rèn)為與各種Ca2+信號通路相互作用[25]。實驗證實胞質(zhì)Ca2+信號可激活自噬，Ca2+來源途徑以及許多下游效應(yīng)分子被認(rèn)為參與其中[26]，如Ca2+/鈣調(diào)素激酶激酶(CaMKkKβ或CaMKKβ)是AMPK的上游激活劑，它可以通過抑制mTORC1來誘導(dǎo)自噬[27]；AMPK可以繞過對mTORC1的抑制，而通過磷酸化自噬啟動ATG1激酶ULK1來刺激自噬[28]；Ca2+介導(dǎo)的Calpain激活被認(rèn)為是自噬流的一個關(guān)鍵抑制因子[3]。細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度升高會刺激自噬作用，而Ca2+螯合劑BAPTA處理細(xì)胞不僅可抑制自噬作用，還可以激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+信號，同時也能對饑餓、氨基酸降解和mTOR抑制做出反應(yīng)[29]。在脂毒性作用下，肝細(xì)胞內(nèi)鈣離子慢性升高則抑制自噬體與溶酶體之間的融合，從而減弱自噬流，而該現(xiàn)象可被TG(鈣ATP酶抑制劑)逆轉(zhuǎn)[30]。

溶酶體被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)重要的Ca2+庫，細(xì)胞Ca2+庫與溶酶體蛋白降解之間存在依賴關(guān)系。細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞溶酶體酸性的重要途徑之一。Ca2+水平異常會改變?nèi)苊阁w的酸性，影響溶酶體與自噬體、晚期胞內(nèi)體及其他細(xì)胞器之間的膜融合，影響細(xì)胞自噬的發(fā)生[31]。在對溶酶體上陽離子交換通道TRPML1的研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+可經(jīng)TRPML1從溶酶體中釋放。TRPML1的過表達(dá)增加自噬，而沉默TRPLM1則降低了HeLa細(xì)胞的自噬水平[32]。也有研究認(rèn)為溶酶體上CACNA1A鈣離子通道活性是溶酶體融合以及細(xì)胞自噬所必須的，溶酶體腔內(nèi)的鈣離子也可通過其電壓門控通道(VGCC)釋放到胞質(zhì)中，促進(jìn)SNARE蛋白介導(dǎo)溶酶體與內(nèi)涵體和自噬體的融合[33]。

3.2 鎘對鈣離子及自噬的影響

Ca2+和ROS是參與調(diào)控細(xì)胞功能的最具影響力的細(xì)胞內(nèi)信號分子。胞質(zhì)鈣離子過載產(chǎn)生細(xì)胞氧化應(yīng)激，也是損害細(xì)胞功能的重要原因。很多研究者在不同細(xì)胞中證實，鎘的細(xì)胞毒性都涉及了胞質(zhì)Ca2+過載和氧化應(yīng)激，并共同決定細(xì)胞功能和命運。鎘誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣離子升高，產(chǎn)生氧化壓力、阻斷了rPT細(xì)胞中溶酶體的自噬體融合，導(dǎo)致自噬小體的累積。BAPTA處理后顯著逆轉(zhuǎn)了鎘誘導(dǎo)的LC3-II和p62蛋白的積累。ROS清除劑NAC處理則可以顯著緩解鎘對自噬流的抑制[20]。Wang等人研究證實，鎘通過PLC-IP3途徑介導(dǎo)ER-Ca2+釋放的增加，導(dǎo)致mRTEC細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平上升，產(chǎn)生ROS。同時也顯著增加了LC3-II和p62蛋白的積累，抑制自噬流發(fā)生，引起細(xì)胞凋亡。ROS清除劑TCP與鎘共處理，則緩解了鎘對該細(xì)胞的毒性作用。鎘通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上IP3R通道釋放鈣離子,提升胞內(nèi)鈣離子水平，并主要經(jīng)Ca2+-ERK途徑介導(dǎo)MES-13細(xì)胞自噬[34]。綜上表明，鎘可以通過PLC-IP3R通路改變細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，影響細(xì)胞溶酶體與自噬體的融合，并產(chǎn)生ROS，進(jìn)一步影響細(xì)胞自噬的發(fā)生；也說明了鎘誘導(dǎo)細(xì)胞自噬與細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度異常、氧化應(yīng)激之間存在著密切關(guān)系。

4 結(jié)論與展望

鎘作為具有很強生物毒性的重金屬，長期鎘暴露會對人體多個組織和器官造成損傷。鎘對細(xì)胞自噬的干擾結(jié)果取決于細(xì)胞的遺傳背景。鎘可以通過改變細(xì)胞溶酶體的酸性誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞自噬，影響細(xì)胞凋亡；鈣作為調(diào)節(jié)溶酶體功能和細(xì)胞自噬的主要途徑，在細(xì)胞自噬發(fā)生的過程中起著重要作用。鎘引起的細(xì)胞自噬效應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度存在著緊密聯(lián)系，干擾溶酶體生理酸性環(huán)境，從而影響細(xì)胞的自噬過程。因此，進(jìn)一步闡明鎘誘導(dǎo)細(xì)胞自噬效應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度之間的關(guān)系，對研究鎘生物毒性有著重要的意義。