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登革熱是由登革病毒感染引起的、經(jīng)伊蚊傳播的一種急性傳染病，臨床表現(xiàn)為突起發(fā)熱，伴隨頭痛，全身肌肉、骨骼和關(guān)節(jié)痛，皮疹，白細(xì)胞減少，部分病人有出血傾向。重癥病例可發(fā)生嚴(yán)重內(nèi)出血、休克等[1-4]。登革病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，有四種血清型(DENV1-DENV4)，是全球分布最廣的蟲媒病毒之一，目前有100多個(gè)國(guó)家或地區(qū)報(bào)告過登革熱病例，并且在一些熱帶、亞熱帶國(guó)家或地區(qū)呈地方性流行[1-4]。

登革病毒的傳播循環(huán)分為城市循環(huán)和叢林循環(huán)，城市循環(huán)的主要傳播媒介為埃及伊蚊和白紋伊蚊，病毒以蚊-人-蚊途徑通過帶病毒蚊蟲叮咬人傳播[1,4]。我國(guó)自1978年海南出現(xiàn)登革熱疫情以來，南方的廣東、云南、廣西、福建、浙江等省均暴發(fā)過規(guī)模不等的本地登革熱疫情[5]。福建省首次登革熱本地暴發(fā)疫情出現(xiàn)于1999年，隨后每年報(bào)告的登革熱病例以輸入性病例為主，偶爾會(huì)出現(xiàn)輸入病例引起的本地流行[5-6]。近10年來福建省先后出現(xiàn)過幾次規(guī)模較大的本地登革熱疫情，分別是2004年福州臺(tái)江、2007年莆田涵江、2014年南平建甌疫情[5-8]。

2015年9月中旬福建省莆田市涵江區(qū)和福州市鼓樓區(qū)先后報(bào)告了本地聚集性登革熱病例，分別為登革2型(DENV2)和登革1型病毒(DENV1)引起，隨后10月初福州市晉安區(qū)也出現(xiàn)DENV2毒株引發(fā)的聚集性病例。為了追溯這些毒株可能的傳播來源以及調(diào)查毒株之間的遺傳聯(lián)系，本文對(duì)2015年福建省部分本地登革熱病例樣品進(jìn)行了病毒分離及基因組序列測(cè)定，分析分離株全長(zhǎng)編碼區(qū)序列與國(guó)內(nèi)外流行毒株的種系發(fā)生關(guān)系，為福建省今后的登革熱防控提供準(zhǔn)確的病原學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1病例資料及血清標(biāo)本 病例資料來自“中國(guó)疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)”福建省2015年報(bào)告的本地登革熱病例。本地感染病例是指發(fā)病前14 d內(nèi)未離開過所在縣(區(qū))，或未到過登革熱疫情報(bào)告的地區(qū)，其感染地點(diǎn)位于報(bào)告地區(qū)。患者血清標(biāo)本來自福州市內(nèi)部分醫(yī)院送檢的疑似登革熱標(biāo)本，以及各設(shè)區(qū)市送檢的登革熱監(jiān)測(cè)復(fù)核樣品。實(shí)驗(yàn)室初篩結(jié)果顯示，部分樣品血清學(xué)檢測(cè)登革病毒NS1抗原陽(yáng)性或登革病毒特異IgM抗體陽(yáng)性。

1.2登革病毒核酸檢測(cè)及血清型鑒定 按QIAGEN公司試劑盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit)操作手冊(cè)提取患者血清樣品總RNA，采用通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒檢測(cè)登革病毒RNA(上海之江生物科技股份有限公司)，隨后用登革病毒1-4型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行血清型鑒定(上海之江生物科技股份有限公司)。

1.3病毒分離 登革病毒核酸陽(yáng)性血清樣品經(jīng)過適當(dāng)稀釋，接種單層C6/36細(xì)胞，每日觀察細(xì)胞，待出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)，收集培養(yǎng)上清，-80 ℃冰箱保存待檢。

1.4基因組片段擴(kuò)增 采用分段擴(kuò)增的策略分別擴(kuò)增登革病毒的基因組片段，擴(kuò)增引物序列參考文獻(xiàn)略做調(diào)整[9-10]。每個(gè)片段長(zhǎng)度為1.0-1.5 kb，共10個(gè)片段，覆蓋全長(zhǎng)基因組。擴(kuò)增試劑盒為大連TaKaRa公司PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus)，擴(kuò)增產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測(cè)序。

1.5序列分析 對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、組裝，得到毒株的全長(zhǎng)基因組。分別從Virus Pathogen Resource(ViPR)數(shù)據(jù)庫(kù)中選取基因型確定的登革病毒參比毒株、近幾年福建省及國(guó)內(nèi)外流行毒株約40株基因組序列(https://www.viprbrc.org)，特別是近幾年福建省輸入病例來源地國(guó)家的毒株，以BioEdit軟件(V7.0.5)進(jìn)行序列比對(duì)和編輯。利用MEGA6.0軟件，選擇病毒全長(zhǎng)編碼區(qū)序列，以最大似然法(Maximum Likelihood)進(jìn)行種系發(fā)生分析[11]。

2 結(jié) 果

2.1福建省2015年本地登革熱疫情概況 2015年1-8月，福建省累計(jì)報(bào)告輸入性登革熱病例32例。9月中旬，莆田市和福州市先后出現(xiàn)本地登革熱疫情，共報(bào)告41例。其中8例來自莆田市涵江區(qū)，其余33例來自福州市鼓樓區(qū)、晉安區(qū)和倉(cāng)山區(qū)。初步流行病學(xué)調(diào)查顯示，這些病例與當(dāng)年已經(jīng)確診的輸入性病例無關(guān)聯(lián)性，發(fā)病時(shí)間集中在9月中旬至10月中旬(圖1)。根據(jù)報(bào)告病例的流行病學(xué)信息及部分患者病毒血清型分型結(jié)果綜合判斷，大致分為4起聚集性病例(簇1-簇4)，見表1。其中簇1為莆田涵江病例，共8例，由DENV2引起。簇2為福州鼓樓病例，來自同一社區(qū)，先后報(bào)告23例，由DENV1引起。簇3為福州晉安區(qū)病例，由DENV2感染，共報(bào)告病例7例。簇4的3例病例來自福州倉(cāng)山區(qū)和鼓樓區(qū)，患者都供職于同一家公司，感染的病原體為DENV1。從時(shí)間順序來看，簇1和簇2幾乎同時(shí)報(bào)告，而簇3和簇2在時(shí)間和空間存在部分重疊(圖1)。

2.2本地登革熱疫情相關(guān)病毒分離株 患者血清樣品接種C6/36細(xì)胞，部分培養(yǎng)瓶觀察到細(xì)胞病變，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR分型鑒定，共有DENV1毒株9株，DENV2毒株8株，分別來自上述4起聚集性疫情，相關(guān)信息見表2。

表1 福建省2015年本地登革熱病例匯總
Tab.1 Summary of indigenous dengue cases in Fujian province, 2015

ClustersLocationOnset time of the index caseDiagnosis time of the index caseDiagnosis time of the last caseNo. of reported cases1Hanjiang, PutianSept 12Sept 17Sept 1982Gulou, FuzhouSept 14Sept 18Sept 27233Jin’an, FuzhouSept 18Sept 24Oct 1374Cangshan, FuzhouOct 4Oct 7Oct 83

表2 福建省2015年本地登革病毒分離株信息匯總
Tab.2 Summary of indigenous dengue viruses isolated in Fujian province, 2015

Strain IDSerotype-genotypeLocationOnset timeDiagnosis timeClusterFull-length(bp)DF150301D2-CosmopolitanHanjiang, PutianSept 16,2015Sept 17,2015110 668DF150303D2-CosmopolitanHanjiang, PutianSept 15,2015Sept 17,2015110 671DF150305D2-CosmopolitanHanjiang, PutianSept 14,2015Sept 17,2015110 657DF150308D2-CosmopolitanHanjiang, PutianSept 12,2015Sept 19,2015110 666DF150336D2-CosmopolitanJin’an, FuzhouOct 3,2015Oct 7,2015310 641DF150361D2-CosmopolitanJin’an, FuzhouOct 5,2015Oct 8,2015310 650DF150407D2-CosmopolitanJin’an, FuzhouOct 10,2015Oct 13,2015310 641DF150409D2-CosmopolitanJin’an, FuzhouOct 10,2015Oct 13,2015310 667DF150275D1-G1Gulou, FuzhouSept 14,2015Sept 18,2015210 654DF150278D1-G1Gulou, FuzhouSept 16,2015Sept 18,2015210 658DF150328D1-G1Gulou, FuzhouSept 25,2015Sept 30,2015210 659DF150340D1-G1Gulou, FuzhouSept 19,2015Sept 22,2015210 644DF150344D1-G1Gulou, FuzhouSept 21,2015Sept 24,2015210 658DF150348D1-G1Cangshan, FuzhouSept 23,2015Sept 29,2015210 655DF150364D1-G1Cangshan, FuzhouOct 4,2015Oct 7,2015410 658DF150365D1-G1Cangshan, FuzhouOct 6,2015Oct 8,2015410 653DF150366D1-G1Gulou, FuzhouOct 6,2015Oct 8,2015410 663

圖1 福建省2015年本地登革熱病例時(shí)間軸Fig.1 Timeline of indigenous dengue cases in Fujian province, 2015

提取病毒RNA，分別擴(kuò)增病毒基因組節(jié)段，得到的序列數(shù)據(jù)經(jīng)過拼接，獲得病毒全長(zhǎng)基因組序列，長(zhǎng)度在10 641-10 671 bp之間。將病毒基因組序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析，所有新分離DENV1毒株與G1基因型毒株的核苷酸相似度最高，所有DENV2與大都市基因型(D2-Cosmopolitan)毒株核苷酸相似度最高，見表2。

2.3新分離毒株與國(guó)內(nèi)外流行毒株的種系發(fā)生分析 通過對(duì)9株新分離DENV1毒株與41株國(guó)內(nèi)外流行株基因組序列進(jìn)行比對(duì)，用全長(zhǎng)編碼區(qū)10 179 bp構(gòu)建種系發(fā)生樹。圖2顯示，這9株病毒之間具有較高的同源性，聚集在種系發(fā)生樹的頂端，位于G1基因型的分支。遺傳關(guān)系最近的參比毒株為2014年斯里蘭卡分離株DK87(GenBank登錄號(hào)：KP398852)。福建省2004年DENV1分離株FJ231/04(DQ193572)及2012年分離株DF1203(KC759167)，與這9株病毒雖然同屬于G1基因型，但分別位于G1基因型的另外兩個(gè)分支，顯示了它們之間的遺傳差異性。而其它參考毒株，包括國(guó)內(nèi)部分省市1991-2015年分離的DENV1毒株、2009-2015年福建省主要輸入病例來源地的國(guó)外流行株，與這9株病毒則存在明顯的差異，位于種系發(fā)生樹的不同分支，分屬于不同的基因型(圖2)。

圖2 福建省2015年部分本地登革1型病毒分離株與國(guó)內(nèi)外流行株的遺傳聯(lián)系Fig.2 Phylogenetic relationship of global circulating DENV1 strains with indigenous isolates in Fujian province, 2015

新分離的DENV2共8株，將其基因組序列與40株國(guó)內(nèi)外基因組序列比對(duì)之后，選取全長(zhǎng)編碼區(qū)10 176 bp，構(gòu)建種系發(fā)生樹(圖3)。盡管這8株病毒都屬于DENV2的大都市基因型，其中4株莆田毒株之間相似度高，聚集成簇，位于該基因型的頂端分支。而4株福州毒株也表現(xiàn)出高度相似性，聚集成另外一簇，但位于該基因型的底端分支。以上結(jié)果顯示，莆田毒株與福州毒株之間存在明顯的遺傳異質(zhì)性。從種系發(fā)生樹上看，與莆田毒株遺傳關(guān)系最近的參比毒株是2014年馬來西亞毒株TM39 (KX452018)及2015年8月由菲律賓輸入福建的毒株P(guān)H-CN77-15(KU517847)。而與福州毒株遺傳關(guān)系最接近的參比毒株則是2011年印度分離株RGCB921/2011(KY427085)。唯一的福建省DENV2既往毒株，1999年福州本地分離株FJ11/99(AF359579)與這兩簇病毒存在不同程度的差異。其它參比毒株，分屬不同的基因型，位于種系發(fā)生樹的不同分支，與這8株病毒存在不同程度的遺傳差異(圖3)。

圖3 福建省2015年部分本地登革2型病毒分離株與國(guó)內(nèi)外流行株的遺傳聯(lián)系Fig.3 Phylogenetic relationship of global circulating DENV2 strains with indigenous isolates in Fujian province, 2015

3 討 論

過去數(shù)十年里，登革熱在全球發(fā)病率增長(zhǎng)超過30倍，成為分布最廣的蟲媒病毒病之一。隨著主要傳播媒介伊蚊孳生地的地理范圍不斷擴(kuò)大，日益增長(zhǎng)的國(guó)際貿(mào)易、跨境旅游、森林破壞、城市化以及氣候變化等因素，也促進(jìn)了登革病毒的傳播[1-4]。登革熱主要發(fā)生在熱帶和亞熱帶國(guó)家和地區(qū)，近幾年里，法國(guó)、葡萄牙及日本等溫帶國(guó)家也出現(xiàn)了本地登革熱疫情，顯示登革熱流行地區(qū)正在由地方性區(qū)域逐漸向非地方性區(qū)域擴(kuò)散[12-15]。我國(guó)屬于登革熱非地方性流行國(guó)家，全國(guó)報(bào)告病例以輸入性病例為主，在蚊媒活躍季節(jié)也出現(xiàn)因輸入病例引起的本地暴發(fā)流行[5]。在這樣的國(guó)際環(huán)境和流行趨勢(shì)下，福建省近10年來不僅存在來自登革熱地方性流行地區(qū)的輸入性登革熱病例，同時(shí)由于地處亞熱帶區(qū)域，全省大部分地區(qū)都具備適合白紋伊蚊生長(zhǎng)的溫度和濕度，因此自1999年以來，還陸續(xù)出現(xiàn)了幾起本地登革熱暴發(fā)疫情，其中也包括2015年出現(xiàn)聚集性本地病例的莆田市和福州市[6-8]。

不同于以前的幾次本地登革熱疫情，福建省2015年的疫情表現(xiàn)為多疫點(diǎn)發(fā)病、多種血清型同時(shí)流行的特點(diǎn)[6-8]。在前后1 d之內(nèi)，相隔近100 km的莆田涵江區(qū)和福州鼓樓區(qū)同時(shí)報(bào)告本地登革熱病例，且分別為DENV2和DENV1感染。簇1中大部分病例來自同一個(gè)行政村，簇2中病例集中在一個(gè)社區(qū)，根據(jù)時(shí)間、空間和血清型綜合判斷，簇1和簇2病例應(yīng)該是互相獨(dú)立的事件。簇3病例感染的是DENV2，簇4的病原體為DENV1，如何揭示它們與簇1、簇2病例之間的聯(lián)系，必須通過解析病原體基因組序列，獲得病原學(xué)證據(jù)。因此，本研究測(cè)定了相關(guān)毒株的全長(zhǎng)基因組序列，并進(jìn)行種系發(fā)生分析。根據(jù)DENV1構(gòu)建的種系發(fā)生樹(圖2)，簇2和簇4病例中分離毒株的基因組序列顯示出較高的同源性。雖然簇4的病例居住地不屬于簇2病例所在社區(qū)，但幾例病例就職于同一家公司，其工作場(chǎng)所距離簇2病例的社區(qū)不到3公里，因此盡管二者發(fā)病時(shí)間無交集，從基因組序列分析推測(cè)，簇4病例可能為簇2疫情的延續(xù)。而根據(jù)DENV2構(gòu)建的種系發(fā)生樹(圖3)，簇1和簇3病例的分離株各自聚集成簇，雖然同屬于大都市基因型，仍然顯示了兩組基因組序列具有明顯的差異，表明兩起疫情的病原體之間無遺傳關(guān)聯(lián)性。

我國(guó)屬于登革熱非地方性流行地區(qū)，近10多年來，福建省輸入性登革熱病例來源地包括東南亞、南亞、非洲、大洋洲、南美洲等國(guó)外疫區(qū)，也出現(xiàn)過從國(guó)內(nèi)流行區(qū)返回的輸入性病例[5-8]。在出現(xiàn)本地登革熱病例之后，由于流行病學(xué)調(diào)查結(jié)論不支持當(dāng)年輸入性病例與本地病例之間的關(guān)聯(lián)性，為了追溯本地病例的可能來源，闡明新分離株與國(guó)內(nèi)外流行毒株之間的遺傳聯(lián)系，我們測(cè)定了這些本地分離株的基因組序列，并分別選取了約40株參比毒株進(jìn)行種系發(fā)生分析。在種系發(fā)生樹上，新分離的9株DENV1毒株與2014年斯里蘭卡分離株DK87(KP398852)同源性最高，顯示引起簇2和簇4病例的DENV1毒株可能的共同輸入來源為斯里蘭卡。而簇1的4株DENV2毒株，與2014年馬來西亞毒株TM39 (KX452018)同源性最高，簇3的4株DENV2毒株，則與2011年印度分離株RGCB921/2011(KY427085)最接近，因此它們的輸入地可能分別為馬來西亞和印度。福建省近幾年登革熱輸入病例來源地名單中，也包括以上這些國(guó)家。

在登革病毒傳播過程中，病毒要經(jīng)歷兩個(gè)階段，即在人體中擴(kuò)增的內(nèi)潛伏期和在蚊媒中復(fù)制的外潛伏期，分別為3～14 d和5～12 d，而患者發(fā)病之后還有5～6 d的病毒血癥期[1,4]。處于病毒血癥期的患者容易被蚊媒叮咬將病毒擴(kuò)散，經(jīng)過外潛伏期以后的蚊媒終生具有感染性，可以感染多人[1,4]。因此，一旦在登革熱地方性流行區(qū)域之外，出現(xiàn)了本地登革熱疫情，往往由于人群普遍無免疫力而導(dǎo)致短時(shí)間內(nèi)涌現(xiàn)大量病例。例如，始于2012年10月的葡萄牙馬德拉群島本地登革熱疫情，前后歷時(shí)7個(gè)月，病例超過2 000例，有13個(gè)歐洲國(guó)家報(bào)告輸入病例[12-13]。2014年日本東京的本地登革熱疫情，歷時(shí)兩個(gè)月，報(bào)告病例160例，新卡里多利、英國(guó)、澳大利亞報(bào)告輸入病例[14]。相對(duì)來說，2015年福建省的本地登革熱疫情，經(jīng)歷的時(shí)間短、涉及病例少，可能原因是莆田和福州曾經(jīng)發(fā)生過登革熱疫情，相關(guān)部門具有處理類似疫情的經(jīng)驗(yàn)，能夠密切配合進(jìn)行病例管理，積極開展蚊媒控制，從而有效防止了病毒的進(jìn)一步擴(kuò)散。

綜上所述，福建省2015年本地登革熱疫情涉及4起聚集性病例，分別為DENV2和DENV1感染引起。根據(jù)部分病毒分離株全長(zhǎng)基因組序列分析，簇2和簇4的DENV1毒株高度同源，可能輸入來源為斯里蘭卡。簇1和簇3的DENV2毒株存在明顯差異，可能輸入來源分別為馬來西亞和印度。因此，通過對(duì)2015年本地登革熱毒株的病原學(xué)特征分析，提示福建省今后登革熱防控的重點(diǎn)依然是加強(qiáng)對(duì)境內(nèi)外輸入病例的監(jiān)測(cè)及管理，同時(shí)在蚊媒活躍季節(jié)積極開展本地蚊媒控制，提前切斷登革病毒在本地的傳播鏈，才能避免輸入登革病毒的擴(kuò)散蔓延。

利益沖突：無