鄭曉茂，茹 琴，陳 琳 綜述，李超英 審校

(江漢大學(xué)武漢生物醫(yī)學(xué)研究院，武漢 430056)

晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)由法國(guó)生物化學(xué)家美拉德于1912年將甘氨酸和葡萄糖混合一起加熱時(shí)發(fā)現(xiàn)，故此反應(yīng)又稱為Maillard反應(yīng)[1]。AGEs是指果糖、葡萄糖等還原糖的醛基和蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸等大分子物質(zhì)的氨基，在非酶促條件下經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的反應(yīng)后形成穩(wěn)定的不可逆的終末產(chǎn)物。AGEs在體內(nèi)多種細(xì)胞和組織器官中蓄積，進(jìn)而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，是參與糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的主要機(jī)制。研究證明，AGEs對(duì)胰島β細(xì)胞具有比高糖更強(qiáng)、作用時(shí)間更久的毒性作用，是糖尿病及其并發(fā)癥持續(xù)惡化的重要因素[2]。本文就AGEs形成、檢測(cè)、致病機(jī)制和干預(yù)物質(zhì)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 AGEs的形成與檢測(cè)

AGEs的生成可分為三步[3]：(1)氨基酸、蛋白質(zhì)類大分子物質(zhì)末端的還原氨基和葡萄糖上的醛基在非酶條件下反應(yīng)形成席夫堿，反應(yīng)迅速且可逆程度高；(2)希夫堿不穩(wěn)定，經(jīng)過(guò)一段短暫的時(shí)間后，自發(fā)重排形成相對(duì)穩(wěn)定的酮胺類化合物(Amadori產(chǎn)物)，反應(yīng)相對(duì)緩慢并可逆，上述反應(yīng)生成的產(chǎn)物統(tǒng)稱為早期糖基化終末產(chǎn)物；(3)Amadori產(chǎn)物進(jìn)一步降解、重排形成羰基化合物，接著羰基化合物與蛋白質(zhì)上的自由氨基反應(yīng)生成AGEs，此步反應(yīng)生成的產(chǎn)物非常穩(wěn)定且不可逆。人體內(nèi)AGEs的來(lái)源主要有兩個(gè)方面：(1)體內(nèi)發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)，即個(gè)體在新陳代謝過(guò)程中發(fā)生糖基化反應(yīng)生成一定量的AGEs，而持續(xù)高血糖條件下極大的加速了AGEs的生成；(2)除了在體內(nèi)形成，AGEs也可以通過(guò)飲食在人體內(nèi)蓄積，尤其是燒烤、油炸等方式加工的食品，AGEs含量很高，外源性AGEs已經(jīng)成為人體內(nèi)AGEs沉積的重要來(lái)源。

AGEs結(jié)構(gòu)復(fù)雜且呈異質(zhì)性，檢測(cè)AGEs的主要方法有[4]：(1)AGEs具有熒光特性，因此可以通過(guò)測(cè)定熒光值來(lái)間接反映AGEs水平，熒光光譜法迅速簡(jiǎn)便且靈敏度高，是目前檢測(cè)AGEs較為常用的方法；(2)高效液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)是效率高、靈敏度高、分辨率高，缺點(diǎn)是操作過(guò)程繁瑣、成本高，不利于普及；(3)酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法也是檢測(cè)AGEs常用的方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，但該法對(duì)操作的要求較為嚴(yán)格，有時(shí)需要多次重復(fù)，比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

在臨床檢測(cè)指標(biāo)與方法的研究探索中，目前一致認(rèn)為測(cè)定早期糖基化終末產(chǎn)物例如糖化血紅蛋白水平，是評(píng)估糖尿病患者8～12周血糖控制情況的金標(biāo)準(zhǔn)。鑒于糖化血紅蛋白的壽命在120 d左右，有研究表明與糖化血紅蛋白相比，測(cè)定AGEs水平可反映更長(zhǎng)時(shí)間的血糖水平控制情況[5]。通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)糖尿病患者血清和晶狀體蛋白中的AGEs，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者體內(nèi)的AGEs顯著高于非糖尿病受試者[6]。還有研究發(fā)現(xiàn)，利用AGEs具有熒光的特性，通過(guò)無(wú)創(chuàng)熒光光譜法檢測(cè)皮膚中AGEs水平可以反映人體內(nèi)AGEs總體水平[4]，此方法具有快速無(wú)創(chuàng)的優(yōu)點(diǎn)，且具有更高的靈敏度，可用于糖尿病的篩查，且優(yōu)于檢測(cè)空腹血糖和糖化血紅蛋白，具有一定的應(yīng)用前景。

2 AGEs的致病機(jī)制

研究表明，AGEs參與的疾病包括糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、視網(wǎng)膜病變、阿爾茨海默病、尿毒癥、白內(nèi)障等[7]。已有研究證明，AGEs對(duì)胰島β細(xì)胞的毒性作用比高糖更強(qiáng)、作用時(shí)間更久，是參與糖尿病發(fā)生、發(fā)展和持續(xù)惡化的主要因素之一[2]。AGEs作為糖尿病的致病因子是導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的重要因素[8]，AGEs參與糖尿病及其并發(fā)癥主要通過(guò)以下幾個(gè)方面。

2.1AGEs和蛋白質(zhì)交聯(lián) AGEs修飾蛋白質(zhì)影響其結(jié)構(gòu)和功能特性。AGEs通過(guò)分子間的共價(jià)鍵與機(jī)體內(nèi)的蛋白質(zhì)交聯(lián)或結(jié)合，改變蛋白質(zhì)的生物特性，從而引起生理生化性質(zhì)的變化[9-10]。如AGEs與Ⅰ型膠原蛋白及彈性蛋白發(fā)生交聯(lián)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)面積增大，造成血管硬度增加[11]。膠原蛋白和層粘連蛋白是基底膜中的關(guān)鍵蛋白，當(dāng)AGEs在腎臟中蓄積后，胞外基質(zhì)Ⅳ型膠原分子之間的結(jié)合能力降低，破壞空間支架結(jié)構(gòu)，同時(shí)層粘連蛋白本身的多聚性降低，與Ⅳ型膠原分子連接性減少，腎小球基底膜支架結(jié)構(gòu)孔徑增大，通透性增加，從而導(dǎo)致蛋白尿和糖尿病腎病[12]。SINGH等[13]發(fā)現(xiàn)，AGEs在作用于基質(zhì)蛋白后可以改變其結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性，導(dǎo)致機(jī)體功能性損傷，如血管增厚、彈性降低和血管內(nèi)皮功能障礙等。

2.2AGEs與其特異受體(receptor of advanced glycation end products，RAGE)結(jié)合 RAGE在多種類型的細(xì)胞上均有表達(dá)，如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等[14]。AGEs與RAGE相互作用后激活一系列復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括ERK1/2MAPK、JAK/STAT、SAPK/JNK、MAPK、AKT、caspase-3/7和TGF-β-Smad，誘導(dǎo)許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路產(chǎn)生活性氧和活性氮，從而進(jìn)一步導(dǎo)致不同的病理反應(yīng)[15]。免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)RAGE在糖尿病腎病患者腎小球中的水平，結(jié)果在腎小球系膜細(xì)胞及上皮細(xì)胞中均有明顯的陽(yáng)性染色，而對(duì)照樣品中未檢測(cè)到RAGE的表達(dá)[12]。RAMASAMY等[16]發(fā)現(xiàn)高糖血癥中RAGE的上調(diào)導(dǎo)致體內(nèi)AGEs的加速積累，并且AGE-RAGE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與糖尿病血管并發(fā)癥的進(jìn)展密切相關(guān)。ZHU等[2]發(fā)現(xiàn)，AGEs通過(guò)和RAGE相互作用，引發(fā)一系列氧化應(yīng)激、炎癥等級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生。AGEs可以調(diào)節(jié)和增加RAGE的表達(dá)，健康人群的RAGE表達(dá)水平很低，當(dāng)AGEs與RAGE結(jié)合后，誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)增多，導(dǎo)致RAGE的表達(dá)增加。

2.3AGEs對(duì)胰島β細(xì)胞的直接損傷作用 近年的研究發(fā)現(xiàn)，AGEs對(duì)胰島β細(xì)胞具有直接損傷作用。CAI等[17]通過(guò)給予小鼠長(zhǎng)期攝入AGEs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠表現(xiàn)出明顯的肥胖和胰島素抵抗。腺苷三磷酸(ATP)在胰島素分泌中發(fā)揮重要作用，當(dāng)體內(nèi)ATP含量降低時(shí)，胰島素分泌將會(huì)受到抑制。ZHAO等[18]在分離的小鼠原代胰島β細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，AGEs通過(guò)阻斷細(xì)胞色素C的氧化，降低ATP的合成，從而影響胰島β細(xì)胞分泌胰島素。LIM等[19]報(bào)道，AGEs通過(guò)誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生和增加RAGE的表達(dá)，促進(jìn)胰島β細(xì)胞凋亡，而通過(guò)減少活性氧的產(chǎn)生和抑制RAGE能夠明顯減少細(xì)胞凋亡。此外還有研究報(bào)道，AGEs通過(guò)激活caspase-9和抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)引起線粒體腫脹，促進(jìn)胰島β細(xì)胞凋亡[20-21]。這些報(bào)道都證明了AGEs可以直接作用于胰島β細(xì)胞，誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致胰島素合成與分泌功能障礙，促使胰島β細(xì)胞凋亡。

3 AGEs的干預(yù)

AGEs在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用，通過(guò)抑制或裂解AGEs，阻斷AGEs與RAGE的結(jié)合，以減輕其進(jìn)一步誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激等級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是目前保護(hù)胰島β細(xì)胞及降低糖尿病患者并發(fā)癥發(fā)生的重要手段。

3.1抑制AGEs的生成 氨基胍作為親核肼化物被廣泛地應(yīng)用于抑制AGEs的形成，其主要是通過(guò)阻斷Amadori產(chǎn)物進(jìn)一步形成羰基化合物，從而抑制AGEs的形成[22-24]。在體外非酶糖基化反應(yīng)體系中加入200 mmol/L氨基胍后，AGEs生成明顯受到抑制，并且隨著時(shí)間的推移，抑制率最高達(dá)到84.26%[25]。但是臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氨基胍具有明顯的不良反應(yīng)，目前無(wú)法繼續(xù)應(yīng)用于臨床。另一個(gè)研究較多的是吡哆胺，吡哆胺是一種親核試劑，能夠清除非酶糖基化和脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中產(chǎn)生的活性羰基化合物，抑制糖基化中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)锳GEs，同時(shí)減少氧化應(yīng)激反應(yīng)[26-27]。給予糖尿病大鼠吡哆胺灌胃12周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠視皮質(zhì)中AGEs水平明顯降低，RAGE的表達(dá)明顯受到抑制[28]。吡多胺對(duì)人體無(wú)明顯的不良反應(yīng)，具有良好的應(yīng)用前景，但是吡哆胺抑制AGEs的相關(guān)研究還相對(duì)較少，且對(duì)AGEs的最佳抑制濃度還需進(jìn)一步探討。此外，二甲雙胍、阿卡波糖和維生素C等臨床藥物也被發(fā)現(xiàn)對(duì)AGEs具有一定的抑制作用。

3.2AGEs裂解劑 另外一種AGEs的干預(yù)手段是加入裂解劑裂解或斷裂AGEs，其優(yōu)勢(shì)在于可以逆轉(zhuǎn)已生成的AGEs及其交聯(lián)結(jié)構(gòu)。如N-苯乙酰噻唑(PTB)，已被證實(shí)可以有效地裂解體外已形成的AGEs，但是PTB化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，容易發(fā)生水解而失去藥理作用[29]。4，5-二甲基-3-苯乙酰噻唑氯(ALT711)是由美國(guó)Alteon公司開發(fā)的一種AGEs及其交聯(lián)結(jié)構(gòu)裂解劑，在Ⅰ、Ⅱ的期臨床試驗(yàn)中，ALT711均表現(xiàn)出了對(duì)糖尿病及其慢性并發(fā)癥有良好的治療效果，但是由于經(jīng)濟(jì)問題Alteon公司已停止了ALT711的臨床試驗(yàn)。

3.3阻斷AGEs與RAGE的結(jié)合 RAGE是AGEs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的主要受體，AGEs-RAGE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活后，誘導(dǎo)炎癥因子的釋放及氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，從而導(dǎo)致了糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。因此阻斷AGEs和RAGE的結(jié)合是一個(gè)新型治療靶點(diǎn)。目前研究較多的是可溶性sRAGE及抗RAGE抗體。sRAGE由RAGE的胞外域直接脫落而成，能夠競(jìng)爭(zhēng)性的與體內(nèi)AGEs結(jié)合，阻斷了AGEs與RAGE結(jié)合引起的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路。糖尿病小鼠經(jīng)sRAGE治療后，蛋白尿明顯降低，動(dòng)脈粥樣硬化及腎小球硬化明顯改善[30]。抗RAGE抗體是通過(guò)與RAGE胞外區(qū)域相互作用，阻斷AGEs-RAGE信號(hào)通路誘導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)[31]。給予抗RAGE抗體治療糖尿病小鼠，超聲測(cè)量小鼠后肢血流情況，發(fā)現(xiàn)抗RAGE抗體治療組小鼠血管成像信號(hào)明顯高于對(duì)照組，證明抗RAGE抗體對(duì)糖尿病足病具有良好的治療效果[32]。

3.4通過(guò)阻斷氧化應(yīng)激間接抑制AGEs的作用 通過(guò)降低氧化應(yīng)激來(lái)保持體內(nèi)自由基的穩(wěn)態(tài)是治療AGEs誘導(dǎo)的糖尿病及其并發(fā)癥的另一個(gè)治療方向[33]。用二甲雙胍干預(yù)AGEs損傷的大鼠成骨細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明二甲雙胍呈劑量依賴性的減少成骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)及凋亡，對(duì)大鼠成骨細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用[34]。替莫普利和奧美沙坦干預(yù)AGE-BSA處理的兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，與模型組相比，二者均能夠明顯降低細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用[35]。吡哆胺已被證明能有效抑制AGEs的產(chǎn)生，其作用機(jī)制就是通過(guò)清除非酶糖基化和脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中產(chǎn)生的活性羰基化合物，抑制AGEs生成的同時(shí)減少了氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，從而對(duì)機(jī)體具有良好的保護(hù)作用[27]。

除上述藥物外，目前開發(fā)的針對(duì)AGEs的藥物還有Glycadia公司的GLY-230和同和藥業(yè)有限公司的DW-1029M，這兩種藥物均處于臨床Ⅱ期試驗(yàn)階段，未來(lái)有望用于治療以AGEs為靶點(diǎn)的相關(guān)疾病。然而，現(xiàn)在進(jìn)入臨床的AGEs靶點(diǎn)藥物仍比較有限，因此需要深入研究其作用機(jī)制以利于開發(fā)新藥物。

4 天然產(chǎn)物對(duì)AGEs的干預(yù)

已有研究表明，某些天然產(chǎn)物或其活性成分對(duì)AGEs的生成具有明顯的抑制作用，如具有抗氧化抗炎作用的黃酮類化合物，對(duì)AGEs的生成也展現(xiàn)出了明顯的抑制效果[25]。如槲皮素，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均證明能夠有效地減少AGEs的生成及蓄積，尤其是在體外非酶糖基化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)槲皮素對(duì)AGEs的抑制作用明顯強(qiáng)于氨基胍[36]。此外，還有實(shí)驗(yàn)證明多種植物提取物的多糖對(duì)AGEs的生成也有抑制作用，如綠茶和蘆薈多糖提取物已被證明能夠明顯抑制對(duì)AGEs的生成，且二者對(duì)AGEs的作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制率越高[37]。

另一類研究較多的是多酚類化合物，如白藜蘆醇，體外非酶糖基化體系研究發(fā)現(xiàn)600 μg/mL白藜蘆醇幾乎完全抑制了AGEs的生成[38]。采用體外制備的AGEs建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型給予白藜蘆醇干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠明顯抑制細(xì)胞色素C的釋放和細(xì)胞caspase-3的活性，明顯降低了AGEs介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷[39]。ZHANG等[40]用100 mg/L的AGEs和10 μmol/L白藜蘆醇同時(shí)干預(yù)巨噬細(xì)胞24 h，與模型組比發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能夠明顯抑制細(xì)胞內(nèi)RAGE的表達(dá)，降低了AGEs-RAGE信號(hào)通路激活引起的細(xì)胞損傷。在2型糖尿病大鼠動(dòng)物模型中給予白藜蘆醇灌胃30 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 mg·kg-1·d-1劑量的白藜蘆醇能夠明顯降低糖尿病大鼠體內(nèi)丙二醛、血糖、RAGE水平，明顯提高總抗氧化能力和胰島素水平[41]，表明白藜蘆醇通過(guò)降低氧化應(yīng)激和下調(diào)RAGE的表達(dá)對(duì)糖尿病大鼠具有保護(hù)作用。

5 小 結(jié)

目前，關(guān)于AGEs的干預(yù)主要包括AGEs生成抑制劑、AGEs裂解劑、RAGE阻斷劑和抗氧化劑。然而，還沒有以AGEs為靶點(diǎn)的臨床治療藥物，因此深入研究AGEs在糖尿病及其并發(fā)癥中的作用機(jī)制具有重要意義，可能為防治糖尿病及其并發(fā)癥提供新的靶點(diǎn)。