黃 鑫，劉子欣，胡利明

北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京市環(huán)境與病毒腫瘤學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100124

熒光探針在生物、食品安全、環(huán)境、醫(yī)學(xué)檢測(cè)與成像等方面越來(lái)越受到人們的重視。近年來(lái)，納米材料的引入，具有特異性識(shí)別功能的熒光探針在生物醫(yī)學(xué)、臨床診斷以及癌癥治療等方面展現(xiàn)出了巨大的潛力［1-3］。分子熒光探針具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、時(shí)空分辨能力強(qiáng)、膜穿透性好等特點(diǎn)，可進(jìn)行細(xì)胞、活體組織熒光檢測(cè)研究。與熒光成像技術(shù)結(jié)合，分子熒光探針適用于生物體系中目標(biāo)分子的實(shí)時(shí)原位無(wú)損檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞與活體中生物分子及其生物過(guò)程的監(jiān)測(cè)。目前，分子熒光探針已成為生命科學(xué)及疾病診斷等領(lǐng)域不可或缺的研究手段，在細(xì)胞信號(hào)通路研究、疾病早期診斷、成像引導(dǎo)手術(shù)治療等領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。分子熒光探針的設(shè)計(jì)、合成及其生物成像的應(yīng)用已經(jīng)成為當(dāng)前跨學(xué)科的前沿交叉研究領(lǐng)域［4-5］。

細(xì)胞內(nèi)各種活性生物小分子和酶參與各種生物化學(xué)反應(yīng)，影響細(xì)胞的多種生理過(guò)程?；钚陨镄》肿又饕ㄟ€原性物質(zhì)，如谷胱甘肽、半胱氨酸、硫化物等；活性氧類物質(zhì)如過(guò)氧化氫、超氧陰離子、羥基自由基等；活性氮類物質(zhì)如一氧化氮、亞硝酰等；金屬陽(yáng)離子如 K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+等；陰離子如等；酶如硝基還原酶、細(xì)胞色素P450、酪氨酸酶等。這些活性小分子或酶參與基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡調(diào)控、神經(jīng)信號(hào)傳遞、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子通道調(diào)節(jié)等過(guò)程。

按識(shí)別基團(tuán)與被測(cè)物的響應(yīng)類型可將探針?lè)譃槿悾悍磻?yīng)型熒光探針、配位型（或稱鰲合型）熒光探針和專用熒光探針，如線粒體標(biāo)記探針、離子通道熒光探針、受體熒光探針等［6-8］。

反應(yīng)型的熒光探針主要通過(guò)探針與目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生不可逆的化學(xué)反應(yīng)，從而導(dǎo)致其熒光性質(zhì)發(fā)生變化，實(shí)現(xiàn)疾病相關(guān)標(biāo)志物的檢測(cè)［9］。相較于其他類型，這類探針的主要優(yōu)勢(shì)在于：可以與很多特異性的化學(xué)反應(yīng)原理結(jié)合來(lái)設(shè)計(jì)探針結(jié)構(gòu)。所以這類熒光探針在應(yīng)用時(shí)，不僅選擇性優(yōu)異，還具有更高的靈敏度。反應(yīng)型熒光探針按作用機(jī)理主要分為三類：“Turn-on”型，“Turn-off”型和比率型，如圖1所示。

本文主要介紹近年來(lái)基于反應(yīng)的小分子熒光探針在疾病檢測(cè)研究中的進(jìn)展。根據(jù)其應(yīng)用的對(duì)象不同進(jìn)行分類介紹，并分析各種探針的反應(yīng)類型、作用機(jī)理以及設(shè)計(jì)思路。根據(jù)發(fā)展現(xiàn)狀和各類探針的優(yōu)缺點(diǎn)，提出在發(fā)展過(guò)程中存在的問(wèn)題以及對(duì)今后趨勢(shì)進(jìn)行展望。

1 反應(yīng)型陰離子熒光探針

氟離子在牙齒保護(hù)方面有很重要的作用，然而氟化物一旦過(guò)多對(duì)人體危害也很大，氟離子可以滲透到人體內(nèi)，導(dǎo)致氟中毒、尿石癥或癌癥。因此，監(jiān)測(cè)氟離子在生物或環(huán)境樣品中含量十分重要。Hu等［10］設(shè)計(jì)、合成了一種用于氟離子的檢測(cè)的羥基喹啉類熒光探針，如圖2所示。

圖1 反應(yīng)型熒光探針的一般作用機(jī)制示意圖：（a）“Turn-on”型探針的機(jī)制，（b）“Turn-off”型和比率型熒光探針的機(jī)制Fig.1 Schematic diagram of general mechanisms of reaction-based fluorescent probes：（a）“Turn-on”type ，（b）“Turn-off”and ratio types

該探針QF基于6-羥基-喹啉-2-苯并噻唑（b-hydroxyl-quinoline-z-benzothiazole，HQB）作為熒光團(tuán)，叔丁基二苯基甲硅烷基團(tuán)用于特異性識(shí)別氟。QF作為比率型熒光探針，特點(diǎn)在于熒光團(tuán)HQB在連接硅烷基后，分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)（intra?molecular charge transfer，ICT）被抑制，熒光減弱。氟離子可以特異性使“硅醚鍵”發(fā)生斷裂，出現(xiàn)ICT效應(yīng)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。這種熒光探針可應(yīng)用于體外水樣品的檢測(cè)，也可在HeLa細(xì)胞和斑馬魚(yú)中實(shí)現(xiàn)氟離子的雙光子顯微成像，間接測(cè)定其含量。

圖2 檢測(cè)氟離子的熒光探針Fig.2 Fluorescent probe for detecting fluoride ions

基于無(wú)機(jī)氰化物的劇毒屬性，極低濃度可造成魚(yú)類或哺乳動(dòng)物等死亡。Xu等［11］設(shè)計(jì)、合成了一種高選擇性的比率型氰化物熒光探針N2。探針以萘二甲酰亞胺作為熒光母核，甲基化三氟乙酰胺基團(tuán)作為識(shí)別CN-的受體。甲基巧妙地取代三氟乙酰胺基中的“活性”H原子，提高了識(shí)別基團(tuán)的選擇性。當(dāng)氰基陰離子進(jìn)攻探針中三氟乙酰胺基的羰基而發(fā)生“親核加成”反應(yīng)時(shí)，探針的ICT效應(yīng)增強(qiáng)伴隨光譜紅移并發(fā)射黃光。熒光探針N2應(yīng)用于痕量氰化物檢測(cè)，能夠發(fā)生裸眼可見(jiàn)的變化。該探針不足是：探針的吸收和發(fā)射波長(zhǎng)均在短波長(zhǎng)區(qū)域，可能會(huì)限制其在成像領(lǐng)域應(yīng)用，且該研究未涉及細(xì)胞水平和活體內(nèi)檢測(cè)。

圖3 檢測(cè)氰離子的熒光探針Fig.3 Fluorescent probe for detecting cyanide ions

2 反應(yīng)型金屬陽(yáng)離子熒光探針

許多金屬陽(yáng)離子與生理或病理發(fā)生過(guò)程相關(guān)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)這些離子的濃度對(duì)疾病診斷和預(yù)防十分重要。過(guò)去幾年，該領(lǐng)域取得了許多進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)一些高靈敏度和選擇性的探針并用于活體金屬離子的監(jiān)測(cè)。

威爾遜病是一種銅離子在組織中積聚相關(guān)的疾病。Liu等［12］設(shè)計(jì)、合成了一種針對(duì)銅離子的近紅外羅丹明類探針，如圖4所示。目前，多數(shù)基于銅的熒光探針波長(zhǎng)檢測(cè)范圍都在紫外和可見(jiàn)光范圍內(nèi)［13-18］，這就導(dǎo)致此類探針穿透深度有限且難以與背景熒光區(qū)分，在模型動(dòng)物中使用受到很大限制。Liu等選擇近紅外羅丹明衍生物作為熒光母核，利用肼對(duì)其羧基進(jìn)行修飾，設(shè)計(jì)合成出分子內(nèi)螺環(huán)探針NRh，在激發(fā)光作用下無(wú)熒光發(fā)射。銅離子與探針作用后，酰肼鍵發(fā)生水解斷裂，螺環(huán)開(kāi)環(huán)使得熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（約600倍）。該探針不僅用于細(xì)胞水平的銅離子含量測(cè)定，還可以應(yīng)用于組織、動(dòng)物及人的體液，為威爾遜病的診斷提供了有效手段。

圖4 檢測(cè)銅離子的熒光探針Fig.4 Fluorescent probe for detecting copper ions

重金屬離子是環(huán)境污染、急性中毒等疾病的重要源頭，對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控十分必要。汞或汞離子是典型的污染物，不論汞蒸氣還是可溶性汞鹽，即使在低濃度下也會(huì)對(duì)人體和其他生命體產(chǎn)生極大的毒性，因此環(huán)境和生物樣品中痕量Hg2+離子的檢測(cè)十分重要。Huang等［19］設(shè)計(jì)、合成了一種氨基萘類探針（SAN）用于汞離子的檢測(cè)。氨基萘類熒光物質(zhì)主要依賴分子內(nèi)ICT效應(yīng)發(fā)光，而經(jīng)過(guò)1，2-乙二硫醇修飾后ICT效應(yīng)被抑制，熒光大大減弱。當(dāng)探針（SAN）與汞離子作用，縮酮鍵水解，ICT效應(yīng)不再被抑制，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。憑借雙光子熒光探針的優(yōu)點(diǎn)，SAN可以檢測(cè)活組織中痕量的Hg2+，如圖5所示。該探針的不足是對(duì)銀離子和鉛離子的抗干擾能力略差于其它離子。

圖5 檢測(cè)汞離子的熒光探針Fig.5 Fluorescent probe for detecting mercury ions

在過(guò)渡金屬中，鐵在氧攝取、代謝、電子轉(zhuǎn)移等生化反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。另一方面，過(guò)量的Fe3+與各種疾病如癌癥、肝炎、肝臟或心臟和胰腺功能障礙等有關(guān)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外利用熒光探針對(duì)Fe3+的定性定量檢測(cè)開(kāi)展了大量研究，難點(diǎn)在于避免 Cr3+和 Hg2+的干擾。Belfield 等［20］設(shè)計(jì)并合成了一種用于檢測(cè)Fe3+的新型硼二吡咯甲烷（bipyrrome theneboron difluorids，BODIPY）熒光開(kāi)啟型傳感器，如圖6所示。探針選擇BODIPY熒光母核連接新型Fe3+識(shí)別基團(tuán)，該識(shí)別部位由雙環(huán)穴狀配體組合而成，具有高選擇性和可逆性。探針可應(yīng)用于水體系中并能夠檢測(cè)活細(xì)胞中的Fe3+。

圖6 用于檢測(cè)鐵離子的熒光探針Fig.6 Fluorescent probe for detecting ferric iron ions

3 反應(yīng)型活性氧熒光探針

人體內(nèi)發(fā)生各種生化反應(yīng)，其中活性氧（reac?tive oxygen species，ROS）發(fā)揮著十分重要的作用。在正常生理濃度范圍內(nèi)，活性氧不僅參與細(xì)胞的氧化還原反應(yīng)，還與細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡密切相關(guān)［21］。當(dāng)ROS水平超過(guò)機(jī)體抗氧化防御能力時(shí)，會(huì)引起氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生，如神經(jīng)退行性疾病、代謝類疾病、心血管疾病以及癌癥等。近年來(lái)，針對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)檢測(cè)的熒光探針不斷被報(bào)道。ROS有很多種類且能相互間轉(zhuǎn)化，如次氯酸根、單線態(tài)氧、羥基自由基、過(guò)氧化氫、超氧根自由基等，這些自由基反應(yīng)活性高、壽命短，一般的分析方法難免選擇性差、副反應(yīng)較多等缺點(diǎn)，而新型熒光探針能克服這些缺點(diǎn)。

圖7 檢測(cè)次氯酸根離子的熒光探針Fig.7 Fluorescent probe for detecting hypochlorite ions

Hu等［21］設(shè)計(jì)、合成了一種基于亞甲藍(lán)的近紅外熒光探針，用于選擇性檢測(cè)次氯酸根離子。通過(guò)將乙?；雭喖姿{(lán)框架中合成乙酰化亞甲藍(lán)，可以特異性識(shí)別外源性和內(nèi)源性ClO-。該探針的檢測(cè)限為0.1 μmol/L，與次氯酸根離子作用后的熒光強(qiáng)度增加約200倍，其優(yōu)點(diǎn)在于原料廉價(jià)且安全、合成簡(jiǎn)單、檢測(cè)迅速而且在近紅外發(fā)射避免了背景干擾。該探針不足在于這類熒光母核的量子產(chǎn)率較低，導(dǎo)致響應(yīng)時(shí)熒光增強(qiáng)倍數(shù)不高。

細(xì)胞中的H2O2是通過(guò)超氧岐化酶催化或者自發(fā)歧化形成的，而體內(nèi)的抗氧化性酶，如過(guò)氧化物酶（peroxiredoxin，Prx）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx），則將體內(nèi)的 H2O2濃度保持在比較穩(wěn)定的范圍［22］。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)過(guò)氧化氫的濃度在化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)等多領(lǐng)域都十分重要。Lin等［23］利用H2O2對(duì)氧鎓的親核性，設(shè)計(jì)了近紅外熒光探針，如圖8所示。探針BC與H2O2作用，水解得到香豆素羧酸，從而實(shí)現(xiàn)了H2O2的熒光識(shí)別。并且成功應(yīng)用于斑馬魚(yú)中H2O2熒光成像。

Stains等［24］通過(guò)對(duì)羅丹明進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，將母核中的氧原子換成硅酸得到探針SiOH2R，如圖9所示。該探針可對(duì)H2O2高效識(shí)別且具有較強(qiáng)的細(xì)胞膜滲透能力，與過(guò)氧化氫作用后的斯托克位移（Stoke's Shift）很大，使其在細(xì)胞內(nèi)具有良好的成像能力。

圖8 檢測(cè)過(guò)氧化氫的熒光探針Fig.8 Fluorescent probe for detecting H2O2

圖9 熒光探針SiOH2R被過(guò)氧化氫氧化后的顏色和熒光變化Fig.9 Changes of color and fluorescence of probe-SiOH2R with the oxidation by H2O2

另一重要的活性氧物質(zhì)是羥基自由基（hydrox?yl radical，?OH），它在人體內(nèi)參與DNA和蛋白質(zhì)等生物大分子的降解過(guò)程，并在癌癥放射治療中發(fā)揮著重要作用。Xu等［25］報(bào)道了一種新型熒光探針MPT-Cy2顯示出活細(xì)胞和細(xì)菌中內(nèi)源性?OH成像能力，探針MPT-Cy2與羥基自由基作用后熒光增強(qiáng)顯著，如圖10所示。該探針可用于產(chǎn)生內(nèi)源性?OH的斑馬魚(yú)體內(nèi)成像，還可用于定性檢測(cè)各種細(xì)菌受到藥物刺激后的?OH升高水平。

圖10 探針MPT-Cy2的結(jié)構(gòu)和與·OH的反應(yīng)式Fig.10 Structure of probe MPT-Cy2 and reaction with·OH

Cai等［26］研究用于清除細(xì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的新型靶向材料，如圖11所示。該工作設(shè)計(jì)、合成了由葉綠素-多肽-甘露糖三部分組成的綴合物，并以該綴合物與銅離子自組裝形成的配合物二聚體作為治療劑。進(jìn)入免疫細(xì)胞的二聚體光敏劑在650 nm激光照射下能高效地產(chǎn)生活性氧，進(jìn)而將免疫細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)菌予以清除。

隨后，Cai等［27］報(bào)道了一種自組裝增強(qiáng)光聲信號(hào)多肽分子用于細(xì)菌感染生物成像檢測(cè)。這種光聲劑可以通過(guò)主動(dòng)靶向、分子剪裁和順序自組裝的“動(dòng)態(tài)過(guò)程”特異性地積聚在活化的巨噬細(xì)胞內(nèi)。該光聲劑的光聲信號(hào)對(duì)細(xì)胞內(nèi)感染的巨噬細(xì)胞具有很高的特異性，比主動(dòng)靶向控制劑的信號(hào)增加超過(guò)2倍。該方法可通過(guò)體內(nèi)光聲信號(hào)檢測(cè)來(lái)早期預(yù)警細(xì)菌感染，為頑固性感染疾病的檢測(cè)和治療提供了方法。

4 反應(yīng)型酶類熒光探針

酶在維持生物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)與生命活動(dòng)的正常運(yùn)行方面發(fā)揮著重要作用。某些特定酶含量及活性的異常與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，生物體內(nèi)特定酶的實(shí)時(shí)原位檢測(cè)具有重要的意義。反應(yīng)型小分子熒光探針因具有選擇性好、靈敏度高及合成方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)研究者設(shè)計(jì)合成了大量的可用于生物體系內(nèi)酶識(shí)別熒光探針，如酸性鞘磷脂酶、堿性磷酸酶和酪氨酸酶等的熒光檢測(cè)探針。

圖11 光動(dòng)力二聚體靶向清除細(xì)胞內(nèi)的金黃色葡萄球菌Fig.11 Intracellular staphylococcus aureus killed by targeting photodynamic dimers

酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase，ASM）存在于所有真核細(xì)胞中，相關(guān)研究表明，ASM與急性肺損傷、癌癥、腫瘤轉(zhuǎn)移及重度抑郁癥等疾病的發(fā)生密切相關(guān)［28-31］。因此，ASM已被看作為多種疾病的生物標(biāo)志物。

Pinkert等［32］報(bào)道了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）的新型小分子熒光探針，如圖12所示。該探針?lè)肿右?-甲氧基-3-羧基香豆素衍生物（7-methoxy?coumarin-3-carboxylic acid，MCC）作為 FRET供體熒光基團(tuán)，以硝基苯并噁二唑（nitrobenzoxadiazole，NBD）作為FRET受體熒光基團(tuán)，該探針可被鞘磷脂衍生物識(shí)別并發(fā)生酶切反應(yīng)，隨著供、受體熒光基團(tuán)距離的增大，F(xiàn)RET轉(zhuǎn)移的效率顯著下降，導(dǎo)致在550 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸降低，400 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增加。因此，該探針能夠在活細(xì)胞中特異性檢測(cè)ASM。

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）能夠催化堿性介質(zhì)中磷酸基團(tuán)的水解，是一種必需的酶。ALP水平的異常與多種疾病如乳腺癌、前列腺癌、糖尿病、骨質(zhì)疏松、骨癌和肝功能異常等的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［33-36］。因此，建立一種可靠、簡(jiǎn)便且靈敏的ALP分析方法，對(duì)于進(jìn)一步理解ALP在相關(guān)生物過(guò)程和臨床實(shí)踐中的作用具有重要意義。

Li等［37］設(shè)計(jì)了一種用于檢測(cè)ALP活性的近紅外熒光探針，如圖13所示。這種探針以半花菁染料為熒光團(tuán)，以磷酸基團(tuán)為識(shí)別基團(tuán)。由于磷酸基團(tuán)的淬滅作用，探針本身是無(wú)熒光的。體系中存在的ALP能夠除去磷酸基團(tuán)，使得探針在738 nm處產(chǎn)生熒光發(fā)射峰。該探針對(duì)ALP高度靈敏，能夠被應(yīng)用于生物樣品中內(nèi)源性ALP活性的檢測(cè)。

圖12 基于FRET熒光探針的酸性鞘磷脂酶活性檢測(cè)：（a）由ASM催化的脂-水界面處的鞘磷脂水解，（b）合成的探針NBD和MCC紅色箭頭表示ASM水解位點(diǎn)Fig.12 Detection of ASM activity by FRET-based fluorescence probe ：（a）Sphingomyelin hydrolysis at the lipid-water interface catalyzed by ASM，（b）Synthesized NBD and MCC probes.The red arrow indicates the ASM hydrolysis site

圖13 體內(nèi)ALP活性檢測(cè)的熒光探針Fig.13 Fluorescence probe for detection of ALP activity in vivo

近年來(lái)，Li等［38］針對(duì)酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）設(shè)計(jì)合成了幾種反應(yīng)型熒光探針。由于酪氨酸酶在黑色素瘤細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)，并且其與腫瘤的惡性侵襲能力正相關(guān)，因此酪氨酸酶被認(rèn)為是黑色素瘤的生物標(biāo)志物。在發(fā)現(xiàn)、診斷黑色素瘤進(jìn)程中，設(shè)計(jì)、合成選擇性較高的酪氨酸酶熒光探針具有十分重要的意義。首先，設(shè)計(jì)合成了香豆素類TYR熒光探針，并對(duì)其生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行研究。熒光母核選用7-氨基-4-三氟甲基香豆素基團(tuán)，如圖14所示，連接4種不同的酶識(shí)別基團(tuán)合成出四種TYR熒光探針（F1-F4），經(jīng)過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)探針F2性質(zhì)具有優(yōu)良的熒光性質(zhì)［39］。由于7-氨基-4-三氟甲基香豆素基團(tuán)的斯托克位移較長(zhǎng)，能夠有效地避免光學(xué)成像過(guò)程中的自淬滅和增益誤差［40］，該探針得以在細(xì)胞水平上高選擇性、高靈敏度地檢測(cè)TYR。這類探針的不足是在分子水平和細(xì)胞水平檢測(cè)TYR活力的時(shí)間較長(zhǎng)，增加了檢測(cè)的難度和準(zhǔn)確度。

圖14 在酪氨酸酶存在下探針F2的降解Fig.14 Degradation of probe F2 in the presence of TYR

Li等［41］還通過(guò)計(jì)算該類探針?biāo)膺^(guò)程中吉布斯自由能的變化，優(yōu)選釋放最大自由能的“脲”結(jié)構(gòu)，如圖15所示。以“試鹵靈”為熒光基團(tuán)設(shè)計(jì)了一種新型TYR熒光探針Res1。在水溶液中，Res1有更好的靈敏度、選擇性以及更快的反應(yīng)速率。但是在細(xì)胞水平進(jìn)行測(cè)定時(shí)，其響應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，所以考慮對(duì)探針Res1的熒光母核結(jié)構(gòu)進(jìn)行改變。該探針的不足在于其分子內(nèi)含有3個(gè)酚羥基，極性較大，容易在堿性環(huán)境中電離生成酚羥基負(fù)離子。而酚羥基的理化性質(zhì)會(huì)影響探針的細(xì)胞膜穿透能力，進(jìn)而影響探針發(fā)揮作用的時(shí)效性。

圖15 新型TYR熒光探針Res1的設(shè)計(jì)Fig.15 Design of a novel fluorescent probe Res1 for TYR

采用吩噻嗪類熒光母核合成了近紅外TYR探針MB1。該探針不但可以用于診斷，還可以殺傷黑色素瘤細(xì)胞，如圖16所示。探針MB1可以選擇性地對(duì)黑色素瘤細(xì)胞快速響應(yīng)［42］，解決了前期研究中的不足。另外，在近紅外區(qū)域激光照射下，探針還可通過(guò)生成單線態(tài)氧達(dá)到殺傷黑色素瘤細(xì)胞目的。

圖16 在酪氨酸酶存在下探針MB1的降解Fig.16 Degradation of probe MB1 in the presence of TYR

5 反應(yīng)型谷胱甘肽熒光探針

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是真核細(xì)胞中含量最多的硫醇類化合物，其在生物體的許多生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。GSH水平的異常改變與兒童發(fā)育遲緩、肝功能損傷、皮膚病、艾滋病、阿爾茨海默病、癌癥、糖尿病、心血管疾病等直接相關(guān)［43-44］，所以細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量的檢測(cè)對(duì)細(xì)胞功能研究和病理分析都具有重要的意義。以熒光探針為基礎(chǔ)的熒光分析法因其操作簡(jiǎn)便、靈敏度高和專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而備受大家關(guān)注，并且有機(jī)小分子熒光探針還可以應(yīng)用于活體細(xì)胞和生物體的成像技術(shù)。

Wu等［45］近期設(shè)計(jì)并合成了一種GSH觸發(fā)的新型“診療合一”的生物探針，如圖17所示。該探針主要由抗癌藥物喜樹(shù)堿、雙光子近紅外熒光團(tuán)和對(duì)硫醇類化合物特異性響應(yīng)的二硝基苯磺?；鶊F(tuán)，通過(guò)一個(gè)間隔基團(tuán)相互連接所組成。由于二硝基苯磺?；娮犹匦裕梢酝ㄟ^(guò)光致電子轉(zhuǎn)移（photoincluced electron transfer，PET）/ICT 效 應(yīng)使近紅外熒光團(tuán)發(fā)生淬滅。體系中存在的GSH能夠觸發(fā)一系列反應(yīng)并將喜樹(shù)堿和近紅外熒光團(tuán)共同釋放出來(lái)，由于光致電子轉(zhuǎn)移作用的消失，熒光團(tuán)的熒光逐漸恢復(fù)。因此該探針能夠?qū)崿F(xiàn)基于GSH響應(yīng)的腫瘤診斷及治療，將其應(yīng)用在細(xì)胞與小鼠模型上，效果十分明顯。

Jiang等［46］報(bào)道了一種能夠?qū)罴?xì)胞中GSH動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行實(shí)時(shí)定量監(jiān)測(cè)的熒光探針，該探針與GSH之間的反應(yīng)基于可逆的Michael加成反應(yīng)，如圖18所示。該探針引入了吸電子基團(tuán)氰基，使解離平衡常數(shù)在合適的范圍內(nèi)。與此同時(shí)，借鑒前人的研究工作［47］，用四元氮雜環(huán)丁烷基取代二乙基氨基，顯著提高了探針的量子產(chǎn)率。探針結(jié)構(gòu)中羧基的引入使其具備了較好的水溶性，確保了探針在細(xì)胞中的均勻分布。憑借對(duì)GSH寬動(dòng)態(tài)范圍的比率熒光響應(yīng)，該探針能夠用于單個(gè)細(xì)胞中GSH水平的共聚焦成像和基于流式細(xì)胞術(shù)的高通量定量分析。這項(xiàng)研究的不足之處在于：羧基的引入雖然提升了探針的水溶性，但也在一定程度上減緩了探針與GSH的反應(yīng)速率。未來(lái)還應(yīng)尋找更為合適的具有水溶性的陽(yáng)離子基團(tuán)以替代羧基。

圖17 谷胱甘肽激活的生物探針Fig.17 GSH-activated biological probe

圖18 基于Michael加成反應(yīng)的GSH可逆熒光探針Fig.18 Reversible fluorescence probe for GSH based on Michael addition reaction

Guo等［48］首次報(bào)道了一種用于GSH檢測(cè)的二級(jí)比率熒光響應(yīng)探針，如圖19所示。利用表面活性劑 CTAB（cetyltrimethylammonium bromide）增強(qiáng)GSH與熒光探針的親核取代反應(yīng)，探針的3位和5位氯得以被GSH的巰基所取代。由于硫醚取代基能夠促進(jìn)BODIPY類染料的光譜發(fā)生紅移，故單、雙取代產(chǎn)物具有不同的熒光發(fā)射波長(zhǎng)。憑借良好的特異性，該探針能夠?qū)崿F(xiàn)GSH的快速檢測(cè)，且具有較高的靈敏度。

圖19 用于GSH檢測(cè)的二級(jí)比率熒光響應(yīng)探針Fig.19 Two stages ratio metric fluorescent responsive probe for GSH detection

圖20 GSH-PF3探針的結(jié)構(gòu)與同時(shí)檢測(cè)GSH和ONOO-的機(jī)理Fig.20 Structure of GSH-PF3 probe and its mechanism for simultaneous detection of GSH and ONOO-

近年來(lái)，用于雙重或多重分析物檢測(cè)的熒光探針被廣泛報(bào)道。這類探針能夠?qū)崿F(xiàn)分子邏輯門(mén)的構(gòu)建以及更為精準(zhǔn)的醫(yī)學(xué)診斷。James等報(bào)道了一種同時(shí)檢測(cè)過(guò)氧亞硝酸根（peroxynitrite，ONOO-）與 GSH的新型“AND”邏輯熒光探針GSH-PF3［49］，如圖 20所示。該探針單獨(dú)與 GSH 或ONOO-作用時(shí)，熒光響應(yīng)均十分微弱，當(dāng)體系中同時(shí)存在GSH與ONOO-兩種分析物時(shí)，其熒光強(qiáng)度有了顯著的增強(qiáng)。該探針具有良好的選擇性，能夠監(jiān)測(cè)代謝產(chǎn)物GSH與ONOO-的共存。這一工作為開(kāi)發(fā)其它的用于醫(yī)學(xué)診斷的“AND”邏輯熒光探針提供了基礎(chǔ)。

6 結(jié) 語(yǔ)

近年來(lái)，反應(yīng)型小分子熒光探針這一領(lǐng)域迅速發(fā)展，研究者們可以根據(jù)不同的化學(xué)反應(yīng)機(jī)理來(lái)設(shè)計(jì)各種不同結(jié)構(gòu)的選擇性探針。但是，一些問(wèn)題也是普遍存在的，比如探針的水溶性、穿膜性能、細(xì)胞毒性、在細(xì)胞或器官中的保留和清除能力以及大動(dòng)物熒光成像等。為了解決這些問(wèn)題，設(shè)計(jì)出應(yīng)用前景好的熒光探針，科研工作者需要不斷地嘗試，并將計(jì)算機(jī)模擬、化學(xué)反應(yīng)機(jī)理與生物醫(yī)學(xué)進(jìn)行緊密的結(jié)合。同時(shí)，隨著熒光分析儀器的不斷發(fā)展進(jìn)步，熒光成像已經(jīng)可以達(dá)到細(xì)胞器級(jí)別。利用熒光探針對(duì)未知的生理變化進(jìn)行實(shí)時(shí)成像，能夠更加清晰地揭示疾病的變化過(guò)程。

反應(yīng)型熒光探針的不足之處：1）大部分這類探針受限于反應(yīng)機(jī)制，難以實(shí)現(xiàn)可逆檢測(cè)；2）這類探針的安全性研究多是關(guān)于探針在某細(xì)胞中的細(xì)胞毒性，極少研究其在活體動(dòng)物內(nèi)的代謝過(guò)程和其他影響；3）這類探針雖然普遍體外穩(wěn)定性良好，但許多探針的生物穩(wěn)定性仍有待研究，如：探針是否會(huì)與特定蛋白發(fā)生特異性結(jié)合而失去檢測(cè)效力；4）部分探針受限于反應(yīng)機(jī)制，靈敏度不高；5）目前所報(bào)道的反應(yīng)型探針大部分都需要紫外或可見(jiàn)光激發(fā)，這有可能導(dǎo)致較高的背景熒光干擾，同時(shí)容易造成光損傷，從而限制其在生物系統(tǒng)中的進(jìn)一步應(yīng)用。

開(kāi)發(fā)性能優(yōu)良的反應(yīng)型小分子熒光探針一定會(huì)成為新的研究熱點(diǎn)，致力于研究各類標(biāo)志物的實(shí)時(shí)含量及其對(duì)生理、病理的影響、作用機(jī)制和分布等。這對(duì)疾病診療、藥效評(píng)價(jià)、環(huán)境治理等領(lǐng)域的發(fā)展都具有重要的意義。未來(lái)，相關(guān)研究趨勢(shì)可能涉及以下幾個(gè)方面：

1）在疾病監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，設(shè)計(jì)診療、預(yù)防結(jié)合的新型探針。治療型探針可通過(guò)釋放藥物或刺激局部產(chǎn)生殺傷腫瘤細(xì)胞的活性氧實(shí)現(xiàn)治療；

2）與納米材料結(jié)合，實(shí)現(xiàn)靶向遞送；該類探針也可應(yīng)用到活體蛋白質(zhì)標(biāo)記成像中。

今后探針研究發(fā)展的主要方向應(yīng)該兼具以下特點(diǎn)：發(fā)射在（近）紅外區(qū)域、水溶性好、高靈敏度、高選擇性、高穩(wěn)定性、響應(yīng)迅速、低毒性并且活體內(nèi)可降解?？傊?，在現(xiàn)有發(fā)展基礎(chǔ)上，研究者還應(yīng)探索新型熒光母核和識(shí)別基團(tuán)，探索性質(zhì)更優(yōu)異的反應(yīng)型小分子熒光探針。