朱誕旦 祝宇

嗜鉻細(xì)胞瘤(pheochromocytoma， PCC)和副神經(jīng)節(jié)瘤(paraganglioma， PGL)是一類罕見的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，分別起源于腎上腺髓質(zhì)和腎上腺外交感、副交感神經(jīng)節(jié)中的嗜鉻細(xì)胞。大部分PCC/PGL被認(rèn)為是良性的，但有約10%～15%為惡性，可出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移部位包括骨、肝、肺、淋巴結(jié)等[1]，目前尚無統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)可應(yīng)用于PCC良惡性的病理學(xué)診斷。PCC/PGL的遺傳相關(guān)性在所有內(nèi)分泌腫瘤中最高，已知有至少12種遺傳綜合征與PCC/PGL相關(guān)，已明確的驅(qū)動基因至少有15種[2-4]，約40%的PCC/PGL存在12種基因之一的胚系突變[2，4]，且有愈來愈多相關(guān)基因正在被發(fā)現(xiàn)。既往基于分子生物學(xué)機(jī)制的不同，將與PCC/PGL發(fā)病相關(guān)的基因歸為兩種類型：以VHL或SDHx(SDHB、SDHD等)的胚系突變?yōu)榇淼膫稳毖躜?qū)動型，以RET、NF1等基因的體細(xì)胞或胚系突變?yōu)榇淼募っ感盘柾犯淖冃蚚2]。2017年Fishbein等[5]基于癌癥和腫瘤基因圖譜(the Cancer Genome Atlas， TCGA)的生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，尚應(yīng)增加以Wnt通路激活為特點(diǎn)，侵襲性較激酶信號通路改變型更強(qiáng)的Wnt通路改變型這一分類，目前發(fā)現(xiàn)其由CSDE1基因或MAML3融合基因體細(xì)胞突變驅(qū)動。由此我們可以將PCC/PGL分為3型，同一分型的PCC/PGL具有相似的信號通路異常和生物行為特點(diǎn)。以下首先對各個(gè)分型的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行闡述。

一、PCC/PGL分子分型及分子生物學(xué)機(jī)制

1.偽缺氧驅(qū)動型：此型共同特征為腫瘤細(xì)胞中的缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor， HIF)在非低氧情況下不被正常降解。HIF為一類轉(zhuǎn)錄因子，生理情況下，非缺氧條件下細(xì)胞中產(chǎn)生的HIF會快速通過泛素-蛋白酶體途徑被降解；缺氧條件下HIF的降解受到抑制而達(dá)到高水平，誘導(dǎo)細(xì)胞對低氧環(huán)境產(chǎn)生反應(yīng)。而在非低氧情況下，由病理性因素引起HIF升高，進(jìn)而激活HIF相關(guān)基因，則稱為偽缺氧。HIF分為HIF-1、HIF-2和HIF-3，均為由α和β亞基構(gòu)成的二聚體。其中β亞基為芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator， ARNT)；α亞基與β亞基結(jié)構(gòu)相似，同屬堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix， bHLH)家族轉(zhuǎn)錄因子，在其氨基酸序列中兩個(gè)特定位點(diǎn)的脯胺酸殘基被羥化后，可被E3泛素連接酶復(fù)合體識別、經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑降解。不被降解的HIF作為轉(zhuǎn)錄因子與DNA增強(qiáng)子中的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng)。已發(fā)現(xiàn)HIF的升高在不同腫瘤組織中產(chǎn)生不同效應(yīng)，其在一些腫瘤如肺癌中表現(xiàn)為腫瘤抑制作用，而在另一些腫瘤如腎細(xì)胞癌及PCC中則表現(xiàn)為致瘤作用[6]，可能與腫瘤微環(huán)境相關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)HIF-2的升高相較于HIF-1和HIF-3在腫瘤發(fā)生中起更主要的作用，HIF-2α可通過激活MYC原癌基因的方式引起細(xì)胞增殖和遷移能力提升[7-8]。

偽缺氧驅(qū)動型PCC/PGL又可根據(jù)突變在通路中的位置分為VHL相關(guān)亞型和三羧酸循環(huán)相關(guān)亞型。

VHL相關(guān)偽缺氧亞型：此亞型主要由VHL基因的體細(xì)胞或胚系突變，或EPAS1基因的體細(xì)胞或合子后突變驅(qū)動，此外還與EGLN1和ARNT基因的突變相關(guān)，占PCC/PGL總體的15%～20%，其中約25%為遺傳相關(guān)[5，9-10]。

VHL基因的功能缺失性胚系突變見于von Hippel-Lindau(VHL)綜合征，其臨床表現(xiàn)包括PCC/PGL、腎透明細(xì)胞癌和小腦、脊髓及視網(wǎng)膜血管母細(xì)胞瘤等。VHL基因編碼E3泛素連接酶復(fù)合體的底物識別組件，HIF-2α和HIF-1α在經(jīng)脯氨酰羥化酶2(prolyl hydroxylase 2， PHD2)羥化后，可經(jīng)此復(fù)合體識別并通過泛素-蛋白酶體途徑降解。因此VHL基因突變導(dǎo)致HIF-2α及HIF-1α因無法被正常識別、降解而蓄積，進(jìn)而激活HIF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起下游MYC等原癌基因的激活，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

EPAS1基因，又名HIF2A，編碼上述HIF-2α，其功能獲得性突變導(dǎo)致HIF-2α無法被VHL正常識別、降解，同理可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。其胚系突變見于以PCC/PGL、生長抑素瘤、紅細(xì)胞增多癥為主要臨床表現(xiàn)的Pacak-Zhuang綜合征[11-12]。

與VHL功能直接相關(guān)的還有EGLN1基因，其編碼的PHD2可使HIFα兩個(gè)特定位點(diǎn)的脯胺酸殘基羥化，反應(yīng)同時(shí)將一分子α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid， α-KG)轉(zhuǎn)化為琥珀酸。如前述，HIFα這兩個(gè)位點(diǎn)的羥化是其被VHL識別、降解所必須的，因此EGLN1基因突變同樣可導(dǎo)致HIFα的蓄積，激活HIF通路。下文將闡述的TCA相關(guān)亞型亦主要是因影響PHD2的功能而引起腫瘤發(fā)生?；赥CGA的研究中發(fā)現(xiàn)有部分PCC/PGL與EGLN1基因胚系突變相關(guān)[13]，但目前相關(guān)研究較少，尚不能確認(rèn)EGLN1是否為驅(qū)動基因。此外，TCGA證據(jù)還表明編碼HIF-1β的ARNT基因亦與PCC相關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

三羧酸循環(huán)相關(guān)的偽缺氧亞型：此亞型主要由三羧酸循環(huán)所涉及的SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、SDHF2以及FH基因的胚系突變驅(qū)動，與MDH2或IDH1的突變亦相關(guān)，占PCC/PGL的 10%～15%，幾乎全部為遺傳相關(guān)[5，9-10]。

三羧酸循環(huán)中，琥珀酸脫氫酶復(fù)合體(succinate dehydrogenase complex， SDHx)將琥珀酸轉(zhuǎn)化為延胡索酸，因此SDHx的功能障礙會引起底物琥珀酸的水平升高。SDHx是由SDHA、SDHB、SDHC、SDHD 4種亞基組成的異多聚體，其中SDHA、SDHB為催化亞基，SDHC、SDHD為錨定亞基，此外SDHF2通過使SDHA黃素化使得4種亞基得以結(jié)合，故這五者任一發(fā)生突變都會影響SDHx行使功能。由此引起的琥珀酸水平升高會通過抑制PHD2的功能激活前述的HIF信號通路，其具體機(jī)制：PHD2使得HIFα的脯胺酸殘基羥化的同時(shí)需要將α-KG轉(zhuǎn)化為琥珀酸，而由于琥珀酸與α-KG存在結(jié)構(gòu)相似性，故琥珀酸的蓄積會競爭性抑制PHD2的功能，使HIFα的脯胺酸殘基無法被羥化，不能被VHL識別、降解而蓄積。

延胡索酸水合酶(fuamarate hydratase， FH)在三羧酸循環(huán)中將延胡索酸水合為蘋果酸，因此FH基因的功能缺失性突變引起延胡索酸蓄積。由于延胡索酸同樣與α-KG存在結(jié)構(gòu)相似性[14]，可以競爭性抑制PHD2活性，同理引起HIFα升高，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。既往已知此基因的胚系突變見于以遺傳性平滑肌瘤病和腎細(xì)胞癌為表現(xiàn)的遺傳性肌瘤病及腎細(xì)胞癌(hereditary leiomyomatosis and renal cell carcinoma， HLRCC)綜合征[15]，而TCGA研究表明其與PCC亦相關(guān)[13]。

蘋果酸脫氫酶2(malate dehydrogenase 2， MDH2)將蘋果酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，其突變引起蘋果酸蓄積，同樣可因蘋果酸與α-KG的結(jié)構(gòu)相似性而競爭性抑制PHD2的活性[13]。

異檸檬酸脫氫酶1(isocitrate dehydrogenase 1， IDH1)將異檸檬酸轉(zhuǎn)化為α-KG，其突變直接引起產(chǎn)物α-KG減少，抑制PHD2活性，在TCGA研究中發(fā)現(xiàn)1例此基因的體細(xì)胞突變[13]。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)SDHx或FH、MDH2功能異常還會因使得與α-KG結(jié)構(gòu)相似的琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸水平升高而競爭性抑制具有α-KG依賴性的JMJDs和TETs作用[16]。因JMJDs和TETs分別使組蛋白和DNA去甲基化，因而抑制后DNA和組蛋白的甲基化水平升高，進(jìn)而影響細(xì)胞功能。IDH1突變因直接使產(chǎn)物α-KG減少，對于DNA和組蛋白的甲基化水平也有同樣影響。而基于TCGA的研究發(fā)現(xiàn)，PCC/PGL中DNA和組蛋白的高甲基化水平與更短的腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移時(shí)間相關(guān)[13]。綜上，三羧酸循環(huán)相關(guān)亞型的機(jī)制同時(shí)包括減少HIFα的降解和升高DNA、組蛋白的甲基化水平。

2.激酶信號通路改變型：此型主要與RET、NF1、TMEM127、MAX以及HRAS基因的體細(xì)胞或胚系突變相關(guān)，約占PCC/PGL的50%～60%，其中約25%具有遺傳相關(guān)性[5，9-10]。所涉及通路均由單跨膜激酶受體啟動。TCGA研究表明此型尚具有PNMT基因高表達(dá)的共同特點(diǎn)，其編碼使去甲腎上腺素轉(zhuǎn)化為腎上腺素的苯乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶[13]。

此型中最為常見的遺傳綜合征是由RET基因功能獲得性突變引起的多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤2型(multiple endocrine neoplasia type 2， MEN2)[17]。RET基因編碼的RET受體為酪氨酸激酶受體，其配體屬于膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell-derived neurotrophic factor， GDNF)家族。RET對人類神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育是必須的，但同時(shí)也是原癌基因，在MEN2A病例中，RET的胞外段突變使得RET無需與配體結(jié)合即可發(fā)生同源二聚化而活化，進(jìn)而過度激活下游RAS-RAF-MEK-MAPK、PI3K-AKT-mTOR等通路[18-19]，刺激細(xì)胞增殖、分化，臨床表現(xiàn)為甲狀腺髓樣癌、PCC等。

其次為NF1基因的功能缺失性突變引起的多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤1型(neurofibromatosis type 1， NF1)[20]。NF1基因編碼的神經(jīng)纖維瘤蛋白屬GTP酶激活蛋白，具有腫瘤抑制作用，具體機(jī)制為使得與GTP結(jié)合而活化的RAS-GTP轉(zhuǎn)化為非活化的RAS-GDP形式，從而抑制RAS-RAF-MEK-MAPK通路[21]。故NF1基因的功能缺失性突變可以引起RAS-MAPK通路的異常激活。

此外尚存在由TMEM127[22]或MAX[23]基因的胚系突變引起的家族性PCC/PGL。

TMEM127編碼一種具有3個(gè)跨膜區(qū)域的跨膜蛋白，有研究表明其對PI3K-AKT-mTOR通路具有負(fù)調(diào)控作用[22，24]，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。故其功能缺失性突變引起PI3K-AKT-mTOR通路的異常激活，促進(jìn)細(xì)胞增殖。另有研究表明其胚系突變與頭、頸及其他PGL有相關(guān)性[25]。

MAX基因編碼的MAX蛋白屬bHLH家族蛋白，其可以與原癌基因MYC編碼的轉(zhuǎn)錄因子MYC形成MAX-MYC異二聚體，也可與自身形成同源二聚體，或與MXD1、MNT、MGA家族的轉(zhuǎn)錄因子形成異二聚體，這些二聚體都可與DNA增強(qiáng)子E-box結(jié)合，形成競爭。其中只有MYC-MAX二聚體與E-box結(jié)合后能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，其余二聚體結(jié)合后不產(chǎn)生效應(yīng)，起負(fù)調(diào)控作用[26]。研究表明MAX過表達(dá)產(chǎn)生腫瘤抑制作用[23]，但因MAX同時(shí)參與上述兩類二聚體的構(gòu)成，故MAX的失活最終引起腫瘤促進(jìn)作用的具體機(jī)制仍不清楚。MYC可由Wnt、MAPK、mTOR等多途徑激活，激活后可促進(jìn)千余種基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

現(xiàn)已證實(shí)HRAS也可以是PCC/PGL的驅(qū)動基因[5，27]，但僅見于體細(xì)胞突變的散發(fā)病例。HRAS是一種屬于RAS家族的小分子G蛋白，與GTP結(jié)合后激活下游Raf激酶如c-Raf，故其功能獲得性突變可激活MAPK通路。

另有少數(shù)病例顯示FGFR1、MET基因的體細(xì)胞突變，以及KIF1B 基因的體細(xì)胞及胚系突變也可能是驅(qū)動基因，且BRAF、FGFR、NGFR及編碼PKA多種亞基的激酶信號通路相關(guān)基因與PCC/PGL的腫瘤發(fā)生亦相關(guān)[5，29]，因缺少進(jìn)一步研究，目前不作為驅(qū)動基因討論。

3.Wnt通路改變型：不同于前述激酶信號通路中單次跨膜受體，Wnt通路起始的膜受體屬于7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體。Wnt為Wingless/Integrated的縮寫，初發(fā)現(xiàn)于果蠅，在不同物種間高度保守，與細(xì)胞增殖、分化密切相關(guān)，其對生物體的胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生均有明顯影響?？煞譃榻?jīng)典Wnt通路、非經(jīng)典平面細(xì)胞極性通路和非經(jīng)典Wnt鈣離子通路，其中以經(jīng)典通路研究較為清楚。通路起始于細(xì)胞外信號分子Wnt對膜受體的激活，膜受體為Frizzled家族G蛋白偶聯(lián)受體，在經(jīng)典通路中受體激活后會結(jié)合β連環(huán)蛋白破壞復(fù)合物的組分之一Axin，使得β連環(huán)蛋白從該破壞復(fù)合物中解離，進(jìn)而調(diào)控下游相關(guān)基因的表達(dá)，引起細(xì)胞增殖、分化等改變[28]?，F(xiàn)已有研究證明Wnt通路的異常激活與乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)病相關(guān)[29-33]。目前認(rèn)為此類PCC/PGL主要由MAML3融合基因或CSDE1基因的體細(xì)胞突變驅(qū)動，兩者激活Wnt通路的路徑可能不同。總體約占PCC/PGL的5%～10%，均為體細(xì)胞突變，無家系[5]。

此類PCC/PGL共同特點(diǎn)包括WNT4、DVL3等Wnt通路相關(guān)基因的過表達(dá)，以及嗜鉻粒蛋白A(chromogranin A， CHGA)表達(dá)水平明顯升高。CHGA與PCC功能相關(guān)，是神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的重要臨床標(biāo)志物，另有研究發(fā)現(xiàn)其水平與腫瘤轉(zhuǎn)移性亦相關(guān)[34]。TCGA研究發(fā)現(xiàn)此分型的PCC/PGL具有較強(qiáng)的侵襲性[13]。

含RNA結(jié)合冷休克域蛋白E1(cold shock domain containing protein E1， CSDE1)又名UNR，屬RNA結(jié)合蛋白，通過與不同RNA結(jié)合進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，對翻譯的起始、RNA穩(wěn)定性、細(xì)胞凋亡、分化起重要作用[35]，在不同組織細(xì)胞中可發(fā)揮不同的生物功能。有研究發(fā)現(xiàn)其在黑色素瘤中提高腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[36]，另有研究發(fā)現(xiàn)其可通過與MYC的mRNA結(jié)合對細(xì)胞增殖進(jìn)行調(diào)節(jié)[37]。TCGA研究發(fā)現(xiàn)在4例存在CSDE1功能缺失性突變的PCC/PGL中，3例同時(shí)存在Wnt通路相關(guān)基因的過表達(dá)[5]，但對于CSDE1激活Wnt通路的機(jī)制目前尚無研究結(jié)果。

MAML3傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為其與NOTCH通路的激活相關(guān)，但TCGA研究顯示在MAML3融合基因陽性的PCC/PGL樣本中并未發(fā)現(xiàn)NOTCH通路相關(guān)基因的表達(dá)升高，而是均伴隨Wnt通路中WNT4、DVL3等相關(guān)基因的過表達(dá)、β連環(huán)蛋白水平升高，部分同時(shí)存在低甲基化改變。研究中發(fā)現(xiàn)的MAML3融合基因主要包括其與UBTF或TCF4基因的融合，可以認(rèn)為是一種功能獲得性突變，因?yàn)槿诤匣蜿栃缘腜CC/PGL中MAML3水平顯著高于融合陰性者，機(jī)制可能為融合后UBTF或TCF4基因的啟動子驅(qū)動MAML3基因過表達(dá)[5]。這種MAML3與Wnt通路的非經(jīng)典聯(lián)系還可見于一項(xiàng)結(jié)腸癌相關(guān)研究[38]，其具體機(jī)制尚不清楚。

此外，TCGA研究主張尚有第4分類，為皮質(zhì)混合型，其具有CYP11B1、CYP21A2、STAR這些腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的高表達(dá)，但因?yàn)檫@可能由采集的腫瘤組織樣本不純引起，故目前這一分類是否成立尚有爭議[5]。還有研究根據(jù)在兩個(gè)不同隊(duì)列中的發(fā)現(xiàn)提出存在MAX相似型PCC/PGL這一分類[39]，但其與Wnt通路改變型同樣具有中等水平的PNMT表達(dá)，兩者的區(qū)別尚未充分闡明。

前述3型PCC/PGL中除存在驅(qū)動基因的突變，還可伴隨ATRX、TP53、SETD2等染色質(zhì)修復(fù)相關(guān)基因的體細(xì)胞突變[5，40-41]，可能在腫瘤發(fā)生中起到協(xié)同作用；且TCGA研究表明伴有ATRX或SETD2胚系突變的PCC/PGL病例無侵襲性疾病生存(aggressive disease free survival， ADFS)時(shí)間縮短[5]。以上研究提示，對ATRX、SETD2等染色質(zhì)修復(fù)相關(guān)基因突變的檢測，具有用以評估PCC/PGL預(yù)后的價(jià)值。

二、PCC/PGL分子分型與臨床特點(diǎn)的關(guān)系

首先，不同類型的PCC/PGL在總體發(fā)病中所占比例不同，且遺傳相關(guān)性差異很大，見表1。

其次，不同分子分型的腫瘤原發(fā)部位存在顯著差異，三羧酸循環(huán)相關(guān)型在頭、頸、縱隔、腹腔(腎上腺外)及腎上腺的腫瘤發(fā)生均常見；VHL相關(guān)型在腎上腺及腹腔的腫瘤發(fā)生常見，在頭、頸及縱隔罕見；Wnt通路改變和激酶信號通路改變型在腎上腺的腫瘤發(fā)生常見，在腹腔不常見，在頭、頸及縱隔罕見[42-43]。

基于TCGA的研究還通過ADFS時(shí)間，即治療后直到再次出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)或區(qū)域淋巴結(jié)陽性的生存時(shí)間，對不同分子類型的PCC/PGL的生物學(xué)行為進(jìn)行了相關(guān)因素分析。結(jié)果表明，與更短的ADFS時(shí)間相關(guān)的因素有MAML3融合基因突變、SDHB胚系突變、SETD2或ATRX的體細(xì)胞突變、總體高體細(xì)胞突變數(shù)、偽缺氧驅(qū)動型、Wnt通路改變型和DNA高甲基化；而更長的ADFS時(shí)間則與激酶信號通路改變型、血/尿中變腎上腺素及腎上腺素陽性、DNA低甲基化有關(guān)。另顯示反應(yīng)細(xì)胞增殖的蛋白Ki-67在MAML3融合基因型中表達(dá)最高，同時(shí)伴較短的ADFS時(shí)間。雖不能直接根據(jù)分子分型確定PCC/PGL的良惡性，但根據(jù)ADFS時(shí)間可知總體上三羧酸循環(huán)相關(guān)偽缺氧亞型和存在MAML3融合基因突變的Wnt通路改變型侵襲性更強(qiáng)，更易復(fù)發(fā)，而激酶信號通路改變型轉(zhuǎn)移能力最低，預(yù)后較好[5]。

三、小結(jié)

PCC/PGL具有高度的遺傳異質(zhì)性和通路復(fù)雜性，雖總體呈高度遺傳相關(guān)，但已證實(shí)也可僅由體細(xì)胞突變驅(qū)動。目前更多文獻(xiàn)認(rèn)為，根據(jù)分子生物學(xué)機(jī)制和腫瘤生物學(xué)行為的不同，可將PCC/PGL分為上述3型，這種新的分型方式對臨床PCC/PGF診斷、治療及預(yù)后評估方案的改進(jìn)，以及對新靶向藥物的研發(fā)均具有指導(dǎo)作用。生物信息學(xué)研究的興起為PCC/PGL的研究提供了有力的數(shù)據(jù)支持，揭示了更多潛在治療靶點(diǎn)，并提示了新的研究方向，PCC/PGL的分子分型有望在將來得到不斷完善，進(jìn)一步為臨床精準(zhǔn)治療提供支持。

注：TS-抑癌基因；OG-原癌基因；G-胚系突變；S-體細(xì)胞突變；P-合子后突變