王 琦，李桂玲，王金水

(河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001)

鉻(Chomium，Cr)是重金屬污染源中工業(yè)五毒(鉻、鉛、汞、鎘和砷)之一，但低濃度Cr對植物生長發(fā)育有一定促進(jìn)作用，而高濃度Cr將導(dǎo)致作物生長受抑制[1]。近年來，隨著印染、電鍍、化工等行業(yè)的發(fā)展，過量Cr隨被污染的灌溉水進(jìn)入農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，對作物種子萌發(fā)和幼苗生長造成危害，導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)，甚至死亡[2-3]，直接或間接危害人類健康[4]。由于Cr對農(nóng)作物的毒害及其在陸地及水體生態(tài)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化[5-6]，使得Cr的毒害作用逐漸受到重視。六價鉻〔Cr (VI)〕對作物的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過三價鉻〔Cr (III)〕[7-8]，有研究表明，Cr (VI)在小麥幼苗中的累積能力大于Cd2+和Pb2+ [9-10]。植物體內(nèi)的活性氧 (Reactive oxygen species,ROS) 代謝與抗逆性有著密切關(guān)系，ROS包括H2O2、超氧陰離子自由基 (O2·-)和OH-等，逆境脅迫下植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的H2O2、O2·-、OH-等活性氧自由基，導(dǎo)致膜脂過氧化，進(jìn)而造成膜系統(tǒng)的氧化損傷[11-12]。植物體內(nèi)也存在著一系列酶促和非酶促抗氧化劑來消除活性氧自由基，保護(hù)植物細(xì)胞免受活性氧傷害，維持膜系統(tǒng)穩(wěn)定性，以增強植株抗逆性[13-14]。在小麥抗氧化脅迫中，超氧化物歧化酶(SOD)響應(yīng)多種脅迫，能夠?qū)Ｒ坏厍宄蹶庪x子自由基 (O2·-)，是一種廣泛的保護(hù)性抗氧化酶[15]；過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)主要作用是引起H2O2分解成H2O和O2，減少H2O2對植物造成的傷害[16-17]。小麥種子萌發(fā)和幼苗生長對于小麥產(chǎn)量至關(guān)重要，萌發(fā)關(guān)鍵酶α-淀粉酶和抗氧化關(guān)鍵酶SOD、POD和CAT的活性變化則直接影響小麥種子萌發(fā)和幼苗正常生長[18]。筆者所在實驗室前期研究Cr (VI) 脅迫下小麥種子萌發(fā)和萌發(fā)關(guān)鍵酶α-淀粉酶的生理響應(yīng)表明，Cr (VI) 脅迫下，淀粉酶的活性在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)，Cr (VI) 臨界值濃度為18 mg/L，小麥種子萌發(fā)關(guān)鍵形態(tài)學(xué)指標(biāo)(胚芽和胚根生長)變化可能是通過淀粉酶對鉻脅迫響應(yīng)實現(xiàn)[8，19]。為了進(jìn)一步揭示小麥種子萌發(fā)和幼苗生長過程中抗氧化關(guān)鍵酶SOD、POD和CAT對Cr (VI) 脅迫的生理響應(yīng)機(jī)制，以溫麥6號為材料，采用水培法培養(yǎng)，研究不同濃度梯度Cr (VI) 脅迫培養(yǎng)后小麥種子萌發(fā)情況以及SOD、POD和CAT酶活性，旨在從抗氧化酶活性角度解釋重金屬Cr (VI) 脅迫對小麥種子萌發(fā)和幼苗生長的影響機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小麥品種溫麥6號，種子購于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。分析純重鉻酸鉀〔K2Cr2O7，Cr (VI)〕，購于華美生物工程公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥種子培養(yǎng) 挑選大小均一、籽粒飽滿的小麥種子，先用5%的H2O2處理5 min，用蒸餾水沖洗3～5遍，再加蒸餾水超過種子最上層2 cm左右，浸種12 h。將小麥種子腹溝向下排列在鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿40粒，每粒種子間距均勻，以防止發(fā)霉種子對健康種子的感染。

1.2.2 試驗設(shè)計 以K2Cr2O7不同培養(yǎng)濃度為試驗對象，設(shè)置13個濃度梯度處理(3 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、17 mg/L、18 mg/L、19 mg/L、20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L、35 mg/L、40 mg/L和45 mg/L)對小麥種子進(jìn)行培養(yǎng)，每個濃度梯度均設(shè)6個重復(fù)，對照為蒸餾水培養(yǎng)。在培養(yǎng)皿中加入不同梯度濃度K2Cr2O7溶液各5 mL，置25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中，3個重復(fù)培養(yǎng)時間為3 d，用于根長和芽長測量；另外3個重復(fù)培養(yǎng)6 d，用于根長和芽長及抗氧化酶活性測定。

1.3 抗氧化酶液的制備和活性測定

1.3.1 超氧化物歧化酶(SOD) 小麥種子培養(yǎng)6 d后，取幼苗葉片0.500±0.005 g，放入預(yù)冷研缽，先加PBS緩沖液2.5 mL (pH 7.8，50 mmol/L)研磨勻漿，再加入PBS2.5 mL 混勻。4℃ 10 000 rpm離心30 min，上清液即為粗提取液，低溫貯藏備用。采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法測定SOD酶活性[20]。

1.3.2 過氧化氫酶(CAT) 稱取培養(yǎng)6 d的小麥相同部位的葉片或根，用蒸餾水洗凈，吸干水分，稱鮮重。稱取1 g，置預(yù)冷研缽中，加入2～3 mL 4℃下預(yù)冷的pH7.8的磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中，并用緩沖液沖洗研缽體數(shù)次，合并沖洗液，定容至10 mL，4 000 rpm離心15 min，上清液即為CAT酶粗提液，4℃下保存?zhèn)溆?。采用紫外吸收法?40 nm處測定CAT酶活性[21]。

1.3.3 過氧化物酶(POD) 稱取培養(yǎng)6 d的小麥相同部位的葉片0.5 g，加入0.2 mol/L(pH 6.0)磷酸緩沖液2.5 mL，于研缽中研磨成勻漿，用磷酸緩沖液定容到10 mL，4 000 rpm離心15 min，上清液即為粗酶提取液，低溫保存?zhèn)溆谩２捎糜鷦?chuàng)木酚法測定POD酶活性[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

利用Excel 2016軟件將所測得的數(shù)據(jù)進(jìn)行成組數(shù)據(jù)T檢驗統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cr(VI)處理對小麥種子芽長和根長的影響

2.1.1 小麥胚芽 從圖1看出，不同濃度Cr (Ⅵ)處理小麥種子3 d后，低濃度處理的小麥胚芽長度略高于對照，高濃度處理比對照低。與對照相比，Cr (Ⅵ) 濃度為3～15 mg/L促進(jìn)小麥胚芽生長，其中以濃度10 mg/L的處理極顯著高于對照；當(dāng)Cr (Ⅵ) 濃度18 mg/L時，小麥胚芽與對照基本相同；Cr (Ⅵ)濃度為 20 mg/L時，小麥種子胚芽生長受到極顯著抑制；隨 Cr (Ⅵ) 濃度繼續(xù)升高，受抑制程度更為嚴(yán)重，當(dāng)處理濃度在30 mg/L時，小麥種子芽長僅為對照的85%左右。處理6 d與處理3 d的小麥胚芽生長總體趨勢一致(圖2)。因此，推測18 mg/L的Cr (Ⅵ) 處理濃度為影響小麥種子萌發(fā)和幼苗生長的閾值。

2.1.2 小麥胚根 從圖1看出，萌發(fā)3 d和6 d的小麥胚根生長均受Cr (Ⅵ)抑制，且抑制效果均達(dá)極顯著水平。說明，不同濃度 Cr (Ⅵ) 處理后，小麥胚根的生長狀況與胚芽不同，Cr (Ⅵ) 對小麥種子胚根生長的抑制作用明顯大于胚芽。高濃度(18 mg/L以上)Cr (Ⅵ) 處理時，濃度越高，抑制效應(yīng)越強，Cr (Ⅵ) 濃度在25～30 mg/L時，處理組根長較對照組低60%以上。

圖1 不同濃度Cr(VI)處理小麥種子3 d和6 d小麥胚芽和胚根變化Fig.1 Variation in germ and radicle of wheat seeds treated with different concentration of Cr (Ⅵ) after 3 d and 6 d

2.2 Cr(VI)脅迫培養(yǎng)對小麥幼苗SOD、CAT 和POD 酶活性的影響

從圖2可看出，SOD、CAT和POD酶活性隨著Cr (VI) 濃度變化而變化。

2.2.1 SOD酶活性 Cr (VI) 濃度為3 mg/L時，小麥葉片SOD活性處理組與對照組無顯著變化；15 mg/L時酶活性最高，較對照升高66.91%；隨著Cr (VI) 濃度進(jìn)一步提高，SOD酶活性開始下降，當(dāng)Cr (VI) 濃度在20 mg/L時，處理組與對照組酶活性幾乎相同或略有降低；當(dāng)Cr (VI) 濃度在25 mg/L以上，SOD酶活性顯著下降。Cr (VI) 濃度達(dá)45 mg/L時，SOD酶活性僅為對照的68.67%，此時表明植物受到Cr (VI) 脅迫后傷害嚴(yán)重。

2.2.2 CAT酶活性 Cr (VI) 濃度在3～5 mg/L時，小麥葉片CAT酶活性較對照組略有增加，但差異不顯著；Cr (VI) 濃度為15 mg/L時，酶活性達(dá)最大，比對照增加6.7%；Cr (VI) 濃度為18 mg/L時，酶活性與對照組幾乎相同，當(dāng)Cr (VI) 濃度增加至19 mg/L以上時，CAT酶活性逐漸降低。

2.2.3 POD酶活性 Cr (VI) 濃度3 mg/L時小麥葉片POD酶活性略微下降，隨后逐漸上升，在Cr (VI) 濃度15 mg/L時出現(xiàn)峰值，較對照提高52.6%。隨著Cr (VI) 濃度繼續(xù)增大，酶活力逐漸降低，Cr (VI) 濃度在18 mg/L時，POD酶活性與對照組幾乎相同，Cr (VI) 濃度在19～45 mg/L時，POD酶活性逐漸降低，此時POD活性受Cr (VI) 脅迫影響最大。

圖2 不同濃度 Cr(VI)處理小麥種子6 d小麥葉片的 SOD、CAT和 POD酶活性Fig.2 Leaf SOD,CAT and POD activity of wheat seeds treated with different concentration of Cr (Ⅵ) after 6 d

3 結(jié)論與討論

植物生長過程中不斷遭受環(huán)境脅迫，在長期的進(jìn)化過程中，植物通過與環(huán)境相互作用，形成相應(yīng)的防御系統(tǒng)，一方面通過形態(tài)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行防御，另一方面，從生理生化上進(jìn)行改變以提高防御能力?？寡趸赶到y(tǒng)是研究逆境脅迫下植物抗逆機(jī)理的重要內(nèi)容。本研究以溫麥6號為材料，采用水培法研究小麥幼苗生長過程中抗氧化酶(SOD、CAT和POD)對重金屬Cr (VI) 脅迫的響應(yīng)，結(jié)果表明，對小麥種子萌發(fā)和幼苗生長影響的Cr (VI) 濃度閾值是18 mg/L，即Cr (VI)濃度低于18 mg/L 時促進(jìn)小麥種子萌發(fā)和幼苗生長，高于18 mg/L則起抑制作用；Cr (VI) 對小麥根生長的抑制作用大于對芽生長的抑制。小麥SOD、CAT和 POD酶活性對Cr (VI) 脅迫響應(yīng)低濃度范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)，臨界值濃度均在18～20 mg/L，即低濃度Cr (VI)促進(jìn)抗氧化酶活性，高濃度則抑制酶活性。

不同重金屬離子對植物的抗氧化酶活性的影響存在差異，這可能與植物對不同重金屬離子響應(yīng)和耐受性程度不同有關(guān)。當(dāng)植物受到重金屬脅迫時，通過抗氧化酶系統(tǒng)清除體內(nèi)過多的活性氧是植物對抗重金屬脅迫的重要機(jī)制之一[22]。田保華等[2]研究表明，隨著Cr6+/Cd2+濃度升高，谷子根和葉片中NADPH氧化酶活性顯著增強，高濃度Cd2+、Cr6+可導(dǎo)致POD、CAT和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性顯著升高，編碼NADPH氧化酶基因SirbohD-F表達(dá)升高；而SOD酶活性則表現(xiàn)出低濃度增加高濃度下降趨勢，SOD酶活性變化趨勢與本研究結(jié)果相似。劉鳳等[23]研究發(fā)現(xiàn)，Cd2+對于小麥根的毒性較強，根對重金屬污染脅迫響應(yīng)較敏感，小麥的根長顯著受抑制，Cd2+脅迫時小麥抗氧化酶活性顯著升高，這是Cd2+脅迫下小麥的一種防御機(jī)制。馮旭等[24]研究表明，Cr3+脅迫顯著影響葎草雌雄幼苗的SOD、POD、CAT酶活性，總體上呈低濃度促進(jìn)、高濃度抑制趨勢，與本研究抗氧化酶活性響應(yīng)重金屬Cr (Ⅵ) 變化的趨勢一致。趙慶芳等[25]研究認(rèn)為，Zn2+脅迫下小麥SOD酶活性呈先降低后升高，POD活性則明顯受到抑制，CAT活性在Cu2+或Zn2+脅迫下均表現(xiàn)出下降趨勢，Cu2+脅迫下小麥SOD活性呈升高的趨勢，而POD活性呈先升高后下降的趨勢。萬永吉等[26]研究表明，秋茄POD活性隨著Cr (Ⅵ) 離子濃度提高而逐漸降低。何俊瑜等[27]研究表明，小麥SOD酶活性隨著Cd2+濃度升高而升高，CAT和APX酶活性則呈下降趨勢。

筆者所在的實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，低濃度Cr (Ⅲ) 離子和Cr (VI)促進(jìn)小麥種子萌發(fā)和淀粉酶活性提高，高濃度則抑制[8,28]。本研究進(jìn)一步分析重金屬Cr (VI)脅迫對小麥幼苗生長過程中抗氧化酶活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重金屬Cr (VI) 在低濃度范圍內(nèi)，促進(jìn)抗氧化酶活性，使植物免受重金屬Cr (VI)的傷害。高濃度重金屬Cr (VI) 脅迫時，清除重金屬Cr (VI) 脅迫產(chǎn)生ROS的酶活力較低，造成植物受重金屬傷害。由此可見，低濃度的Cr (VI) 可提高SOD活性來消除ROS，使其處于相對較低水平，而脅迫后期積累的ROS則由POD和CAT酶分解，這種協(xié)調(diào)作用在一定程度上可減輕重金屬對小麥幼苗造成的傷害。因此，重金屬Cr (VI) 對小麥幼苗生長的影響是通過抗氧化酶對重金屬的響應(yīng)實現(xiàn)的。