李然，湯承，岳華

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

本試驗(yàn)對(duì)2018年遼寧省某奶牛場(chǎng)送檢的18份犢牛腹瀉樣本進(jìn)行牛輪狀病毒（BRV）、牛冠狀病毒（BCoV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）、沙門氏菌（Salmonella）和安氏隱孢子蟲(chóng)（C.andersoni）的PCR檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 被檢樣本 2018年遼寧省某奶牛場(chǎng)送檢的10～30日齡犢牛腹瀉樣本18份。病牛臨床表現(xiàn)為體溫升高，食欲減退，體重減輕，水樣腹瀉，部分糞便顏色為灰白色或淡黃色，部分病牛便中帶血，混有氣泡和腸黏膜。

1.2 主要試劑及儀器 TrizolTMReagent、Prime ScriptTM、2×Taq PCR Master Mix 等購(gòu)于 TaKaRa公司；DNA MarkerⅡ購(gòu)于寶生物工程（大連）股份有限公司；高速離心機(jī)5804購(gòu)自Eppendorf公司；普通PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)VersaDov2000、核酸蛋白電泳儀購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.3 參考毒株 BRV、BCoV、BVDV、Salmonella、ETEC及C.andersoni陽(yáng)性樣本均由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4 核酸提取 將18份犢牛腹瀉樣本與PBS緩沖液按照1∶3的比例渦旋混合，反復(fù)凍融3次，置于4℃離心機(jī)中10000r/min離心10min，取上清，分別進(jìn)行RNA和DNA的提取。RNA的提取按照Trizol試劑盒（RNAiso Plus）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并利用Prime ScriptTMRT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20℃待用。DNA的提取采用酚-氯仿法，置于-20℃待用。

1.5 PCR檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[1-6]中有關(guān)BRV、BCoV、BVDV、Salmonella、ETEC 及 C.andersoni的檢測(cè)方法，對(duì)18份犢牛腹瀉樣本的cDNA和DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)引物見(jiàn)表1，由生物工程（上海）股份有限公司合成。25 μL反應(yīng)體系如下：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1.5μL，擴(kuò)增樣本cDNA或DNA 2μL，ddH2O 7.5μL。PCR擴(kuò)增條件為：94℃ 4min，94℃30 s，52～55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72℃ 5 min，30 個(gè)循環(huán)。取擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠核酸電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送至生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)。

表1 RT-PCR引物信息

2 結(jié)果

電泳結(jié)果顯示：在18份犢牛腹瀉樣本中，有15份樣本擴(kuò)增得到BRV檢測(cè)引物的特異性條帶，大小約為231bp，檢出率為83.3%（見(jiàn)圖1），與GenBank中BRV序列的相似性為98%～100%；有16份樣本擴(kuò)增得到BCoV檢測(cè)引物的特異性條帶，大小約為230bp，檢出率為88.8%（見(jiàn)圖2），與GenBank中BCoV序列的相似性為94%～97%；有11份樣本擴(kuò)增得到BVDV檢測(cè)引物的特異性條帶，大小約為230 bp，檢出率為61.1%（見(jiàn)圖3），與GenBank中BVDV序列的相似性為97%～100%；這些樣本中 BRV、BCoV、BVDV的混合感染率為50%（見(jiàn)表2）；而Salmonella、ETEC和C.andersoni檢測(cè)引物均未檢出。

圖1 BRV電泳檢測(cè)結(jié)果

圖2 BCoV電泳檢測(cè)結(jié)果

圖3 BVDV電泳檢測(cè)結(jié)果

從表2可見(jiàn)，BRV、BCoV和BVDV的檢出率分別為83.3%、88.8%和61.1%，3種病原的混合感染率為50%。結(jié)合臨床癥狀分析，可以確診該奶牛場(chǎng)的犢牛腹瀉是由BRV、BCoV和BVDV混合感染引起的，且混合感染情況較嚴(yán)重。

表2 BRV、BCoV和BVDV的混合感染情況

3 討論

BRV是引起犢牛腹瀉的最常見(jiàn)病原，可感染各個(gè)年齡段的牛，且多發(fā)于1月齡以內(nèi)的犢牛，臨床表現(xiàn)為水樣腹瀉，有時(shí)混有黏液或血液，嚴(yán)重時(shí)發(fā)生脫水甚至死亡，當(dāng)發(fā)生繼發(fā)感染時(shí)，死亡率會(huì)大大提升[7]。BCoV在世界范圍內(nèi)流行，是引起犢牛腹瀉的重要病原，還可引起成年牛的冬痢和呼吸道疾病，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8]。BVDV感染可引起廣泛的臨床癥狀，包括發(fā)熱、腹瀉、母畜流產(chǎn)、免疫抑制，并時(shí)常伴有繼發(fā)感染，對(duì)奶牛的生產(chǎn)性能和繁殖性能影響較大[9]。

在我國(guó)，牛群中BRV、BCoV和BVDV的感染率較高，尤其是混合感染嚴(yán)重，提示我們?cè)诜揽毓ぷ髦袘?yīng)加強(qiáng)對(duì)BRV、BCoV和BVDV的監(jiān)測(cè)。