熊 穎， 張 瓊， 袁 琨

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是一種發(fā)生在鼻黏膜的過敏性、炎癥性疾病，在亞洲的患病率達(dá)到27%～32%[1-3]。同時(shí)，AR患者的鼻黏膜癥狀嚴(yán)重降低了患者的學(xué)習(xí)、工作和生活質(zhì)量，更增加了患者患其他黏膜組織過敏性和炎癥性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，如哮喘和結(jié)膜炎[4]。由于環(huán)境惡化等其他因素的加重，AR的發(fā)病率仍在上升，且目前的藥物治療不能緩解約20%患者的癥狀。因此，尋找一個(gè)可靠的可用于輔助診斷和疾病監(jiān)測的生物標(biāo)志物十分緊迫[5-8]。近年來，微小RNA(microRNA，miR)被報(bào)道可以作為輔助AR診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[9-11]。miR-103和miR-107是位于10號染色體上的屬于同一基因家族的miRNA，被發(fā)現(xiàn)在許多炎癥疾病中發(fā)揮著抑制炎癥并阻止疾病進(jìn)展的作用，可以作為一些炎癥疾病的風(fēng)險(xiǎn)和疾病監(jiān)控標(biāo)記物[12-13]。本研究旨在評估鼻黏膜組織miR-103和miR-107表達(dá)量與AR患病風(fēng)險(xiǎn)、疾病嚴(yán)重程度和炎癥因子水平的關(guān)聯(lián)。

1 對象與方法

1.1對象 選取2017年5月—2018年4月收治的80例AR患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病史、臨床癥狀、鼻腔檢查、皮膚點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)及血清變應(yīng)原特異性IgE檢測，根據(jù)文獻(xiàn)[14]確診的AR；(2)同意獲取鼻黏膜組織；(3)4周內(nèi)未接受抗組胺藥物和糖皮質(zhì)激素治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)AR合并哮喘發(fā)作；(2)解剖學(xué)因素或其他因素造成鼻腔堵塞，包括嚴(yán)重的鼻中隔偏曲、鼻息肉和鼻竇炎等；(3)呼吸系統(tǒng)疾病，包括支氣管哮喘、分泌性中耳炎等；(4)上呼吸道感染或其他嚴(yán)重感染；(5)合并惡性腫瘤；(6)孕婦或哺乳期婦女。入組的AR患者的年齡為(24.2±7.4)歲(10～41歲)，男性35例(43.8%)，女性45例(56.3%)，單個(gè)鼻癥狀評分(individual nasal symptom score，INSS)包括流涕、鼻癢、噴嚏、鼻塞評分分別為(1.9±0.7)分(1.0～3.0分)，(1.9±0.6)分(1.0～3.0分)，(2.3±0.7)分(1.0～3.0分)，(1.9±0.7)分(1.0～3.0分)，總鼻癥狀評分(totalnasalsymptomscore，TNSS)為(7.9±1.6)分(4.0～11.0分)；血清IgE水平中位值為270.7 IU/mL(四分位值：163.7～479.5)(30.6～1 318.1 IU/mL)。同期收集80例行鼻中隔偏曲手術(shù)矯正患者的鼻黏膜組織作為對照，所有對照組均無AR、哮喘史、呼吸道感染或其他嚴(yán)重感染、惡性腫瘤史。對照組年齡為(25.8±8.8)歲(5～48歲)(P>0.05)，其中男性40例(50.0%)、女性40例(50.0%)(P>0.05)，血清IgE水平中位值為22.4 IU/mL(四分位值：15.3～32.7)(5.8～59.0 IU/mL)(P<0.001)。本研究經(jīng)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有受試者或其監(jiān)護(hù)人均已簽署知情同意書。

1.2AR嚴(yán)重程度評估 采用INSS和TNSS評估AR嚴(yán)重程度。INSS為患者自評，包括4種鼻癥狀評分，分別為流涕、鼻癢、噴嚏、鼻塞。每一種癥狀由患者根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分：0分為無癥狀；1分為輕度癥狀；2分為中度癥狀；3分為重度癥狀。4種INSS之和即為TNSS[15]。

1.3組織標(biāo)本收集 局部麻醉下取受試者下鼻甲前端黏膜組織，用無菌生理鹽水漂洗、干燥后，置于凍存管中，放入液氮速凍，置于-80℃保存，待后續(xù)檢測。

1.4miR-103，miR-107及炎癥因子mRNA檢測 采用RNeasy Protect Mini Kit(德國QiagenInc公司)試劑盒提取患者和對照組鼻黏膜組織中的總RNA，將總RNA采用ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix(日本Toyobo公司)逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(complementary DNA, cDNA)。采用THUNDERBIRD?SYBR?qPCR Mix(日本Toyobo公司)試劑盒進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(poly merase chain reaction，PCR)。采用U6作為miR-103和miR-107的內(nèi)參，采用NAPDH作為炎性因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，IL-1β，IL-4，IL-6，IL-13，IL-8，IL-10，IL-17mRNA的內(nèi)參，最后通過2-△△ct公式計(jì)算miRNA和mRNA的相對表達(dá)量。定量PCR(quantitive PCR，qPCR)中采用的引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Sequences of the primers

miR:微小RNA； TNF-α：腫瘤壞死因子-α； IL：白細(xì)胞介素.

1.5樣本量計(jì)算 本研究前期進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。預(yù)試驗(yàn)中隨機(jī)選取6例AR患者的鼻黏膜組織，并采集6例年齡和性別與患者相匹配、行鼻中隔偏曲手術(shù)矯正患者的鼻黏膜組織作為對照，采用qPCR檢測miR-103及miR-107的相對表達(dá)量：miR-103在患者和對照組中的相對表達(dá)量分別為(0.525±0.370)，(1.809±1.020)；miR-107在患者和對照組中的相對表達(dá)量分別為(0.570±0.477)，(1.671±0.873)。取I類錯(cuò)誤α=0.05，Ⅱ類錯(cuò)誤β=0.1(把握度為90%)，以預(yù)試驗(yàn)中miR-103在患者和對照組中的相對表達(dá)量為估計(jì)值，進(jìn)行差異性檢驗(yàn)所需最小樣本量為每組10例；以預(yù)試驗(yàn)中miR-107在患者和對照組中的相對表達(dá)量為估計(jì)值，進(jìn)行差異性檢驗(yàn)所需最小樣本量為每組11例。為盡可能減少預(yù)試驗(yàn)中抽樣誤差對于樣本量估計(jì)帶來的偏倚，將研究樣本量擴(kuò)大到每組80例。

2 結(jié) 果

2.1miR-103/miR-107與AR患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián) miR-103在AR和對照組鼻黏膜組織的表達(dá)量中位值(1/4分位值～3/4分位值)分別為0.512(0.273～0.894)和0.990(0.554～2.438)；miR-107為0.462(0.265～0.726)和1.710(1.089～2.786)。AR患者的鼻黏膜組織miR-103和miR-107的表達(dá)量顯著低于對照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖1A,B)。ROC曲線分析顯示，鼻黏膜組織miR-103表達(dá)量可以在一定程度上預(yù)測AR的患病風(fēng)險(xiǎn)，其AUC為0.752(95%CI：0.678～0.826)(圖1C)；鼻黏膜組織miR-107表達(dá)水平對AR患病風(fēng)險(xiǎn)具有較好的預(yù)測作用，其AUC為0.886(95%CI：0.834～0.939)(圖1D)。通過計(jì)算特異性和敏感性的和，找到和最大處(最佳切割點(diǎn))miR-103/miR-107的表達(dá)量，即為miR-103/miR-107的截?cái)嘀担渲衜iR-103的截?cái)嘀禐?.797，其對于預(yù)測AR患病風(fēng)險(xiǎn)的敏感性為73.8%，特異性為65.0%；miR-107的截?cái)嘀禐?.007，其對于預(yù)測AR患病風(fēng)險(xiǎn)的敏感性為86.3%，特異性為81.3%。另外，AR患者和對照組鼻黏膜miR-103表達(dá)量和miR-107表達(dá)量均正相關(guān)(P<0.001，圖1E，F(xiàn))。

AR：變應(yīng)性鼻炎. A：鼻黏膜miR-103在AR患者與對照組中的相對表達(dá)量； B：鼻黏膜miR-107在AR患者與對照組中的相對表達(dá)量； C：鼻黏膜miR-103相對表達(dá)水平對AR患病風(fēng)險(xiǎn)的ROC曲線； D：鼻黏膜miR-107相對表達(dá)水平對AR患病風(fēng)險(xiǎn)的ROC曲線； E：AR患者中鼻黏膜miR-103表達(dá)水平與miR-107表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)； F：對照組中鼻黏膜miR-103表達(dá)水平與miR-107表達(dá)水平的關(guān)聯(lián).圖1 miR-103和miR-107與AR患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)Fig 1 The correlations of miR-103 and miR-107 with AR risk

2.2miR-103/miR-107與AR患者疾病嚴(yán)重程度的關(guān)聯(lián) AR患者鼻黏膜的miR-103表達(dá)量與鼻癢評分、鼻塞評分和TNSS均呈負(fù)相關(guān)(表2)，與鼻癢評分、鼻塞評分(P=0.001)和TNSS均呈負(fù)相關(guān)。將AR患者根據(jù)鼻黏膜的miR-103/miR-107表達(dá)水平截?cái)嘀捣譃閙iR-103/miR-107高表達(dá)患者和miR-103/miR-107低表達(dá)患者，比較INSS和TNSS在兩組間的差別，結(jié)果顯示，miR-103低表達(dá)患者的鼻癢評分、鼻塞評分和TNSS顯著高于miR-103高表達(dá)患者(P<0.05)，而流涕評分和噴嚏評分在miR-103低表達(dá)患者和miR-103高表達(dá)患者的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)。miR-107低表達(dá)患者和miR-107高表達(dá)患者間的流涕評分、鼻癢評分、噴嚏評分、鼻塞評分和TNSS比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2AR患者中miR-103/miR-107相對表達(dá)量與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)聯(lián)
Tab 2The correlations of miR-103/miR-107 expression with disease severity in AR patients

項(xiàng) 目miR-103P值相關(guān)系數(shù)(r)miR-107P值相關(guān)系數(shù)(r)流涕評分0.9060.0130.179-0.152鼻癢評分<0.001-0.3990.022-0.256噴嚏評分0.152-0.1620.133-0.170鼻塞評分<0.001-0.4090.001-0.371TNSS<0.001-0.410<0.001-0.390

AR:變應(yīng)性鼻炎； TNSS：總鼻癥狀評分.

表3疾病嚴(yán)重程度在miR-103/miR-107高表達(dá)和低表達(dá)患者中的差異
Tab 3The difference in disease severity between patients with miR-103/miR-107 high expression and patients with miR-103/miR-107 low expression

項(xiàng) 目miR-103高表達(dá)低表達(dá)miR-107高表達(dá)低表達(dá)流涕評分1.8±0.61.9±0.71.7±0.61.9±0.7鼻癢評分△1.6±0.72.0±0.51.6±0.71.9±0.5噴嚏評分2.1±0.92.3±0.62.1±0.92.3±0.7鼻塞評分△1.5±0.72.1±0.71.6±0.82.0±0.7TNSS△7.0±1.58.3±1.57.1±1.98.0±1.5

2.3miR-103/miR-107與AR患者炎癥因子的關(guān)系 AR患者鼻黏膜的miR-103表達(dá)量與鼻黏膜TNF-α，IL-4，IL-6，IL-13，IL-17 mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，與IL-10表達(dá)水平呈正相關(guān)；miR-107表達(dá)量與TNF-α，IL-6，IL-8，IL-13，IL-17 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與IL-10表達(dá)量呈正相關(guān)(表4)。對照組的miR-103表達(dá)水平與TNF-α，IL-4，IL-6，IL-8，IL-13，IL-17 mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，與TNF-α，IL-1β，IL-4，IL-8 mRNA呈負(fù)相關(guān)(表5)。

表4AR患者中miR-103/miR-107相對表達(dá)量與炎癥因子mRNA的關(guān)聯(lián)
Tab 4The correlations of miR-103/miR-107 expression with inflammatory cytokines mRNA levels in AR patients

項(xiàng) 目miR-103P值相關(guān)系數(shù)(r)miR-107P值相關(guān)系數(shù)(r)TNF-αmRNA<0.001-0.3970.003-0.331IL-1βmRNA0.123-0.1740.117-0.177IL-4mRNA0.025-0.2500.059-0.212IL-6mRNA0.001-0.3540.014-0.273IL-8mRNA0.064-0.2080.008-0.297IL-10mRNA0.0020.3400.0420.228IL-13mRNA0.005-0.3080.038-0.233IL-17mRNA<0.001-0.4070.005-0.312

AR：變應(yīng)性鼻炎； TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細(xì)胞介素.

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)：(1)鼻黏膜miR-103和miR-107表達(dá)量在AR患者中低于對照組，且miR-103可在一定程度上預(yù)測AR的患病風(fēng)險(xiǎn)，miR-107對AR患病風(fēng)險(xiǎn)有較好的預(yù)測作用；miR-103和miR-107表達(dá)水平在AR患者中和對照組中均呈正相關(guān)；(2)AR患者miR-103和miR-107表達(dá)水平與AR疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)；(3)AR患者miR-103和miR-107表達(dá)量與促炎因子水平呈負(fù)相關(guān)，與抑炎因子水平呈正相關(guān)。

表5對照組中miR-103/miR-107相對表達(dá)量與炎癥因子mRNA的關(guān)聯(lián)
Tab 5The correlations of miR-103/miR-107 expressions with inflammatory cytokines mRNA levels in controls

項(xiàng) 目miR-103P值相關(guān)系數(shù)(r)miR-107P值相關(guān)系數(shù)(r)TNF-αmRNA0.012-0.2790.014-0.275IL-1βmRNA0.124-0.1730.049-0.221IL-4mRNA0.025-0.2510.012-0.278IL-6mRNA0.040-0.2300.064-0.208IL-8mRNA0.015-0.2710.034-0.237IL-10mRNA0.1330.1700.3290.111IL-13mRNA0.012-0.2810.058-0.213IL-17mRNA0.076-0.2000.056-0.214

TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細(xì)胞介素.

miR-103被報(bào)道在與炎癥相關(guān)的疾病中發(fā)揮促進(jìn)疾病進(jìn)展的作用。研究表明，miR-103可以通過調(diào)控Bcl2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3(Bcl2/adenovirusE1B19 kDainteractingprotein，3BNIP3)減少人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)中的氧化應(yīng)激損傷，從而在心血管疾病中起到保護(hù)作用[13]。另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)小鼠下丘腦miR-103表達(dá)水平顯著升高了PI3K-Akt-mTOR通路的表達(dá)水平，導(dǎo)致小鼠發(fā)生食欲過盛型肥胖，增加了2型糖尿病的患病風(fēng)險(xiǎn)[16]。一項(xiàng)關(guān)于阿茲海默癥(Alzheimer′s disease，AD)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)報(bào)道，miR-103在AD細(xì)胞模型中通過調(diào)控前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxidesynthase2，PTGS2)促進(jìn)了神經(jīng)細(xì)胞的生長，且抑制了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和炎癥，表明其在AD中發(fā)揮了保護(hù)作用[17]。這些研究表明，miR-103在與炎癥相關(guān)的疾病中發(fā)揮抑制疾病進(jìn)展的作用，包括通過調(diào)控多種蛋白以及信號通路減少氧化應(yīng)激損傷、促進(jìn)細(xì)胞生長、抑制細(xì)胞凋亡和細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)等。本研究發(fā)現(xiàn)，鼻黏膜miR-103表達(dá)水平在AR患者中顯著低于對照組，ROC曲線顯示其可以在一定程度上預(yù)測AR的患病風(fēng)險(xiǎn)，且與疾病嚴(yán)重程度和炎癥水平呈負(fù)相關(guān)，可能與miR-103在炎癥相關(guān)疾病中的保護(hù)作用有關(guān)，如通過調(diào)控3BNIP3蛋白減少HUVEC中的氧化應(yīng)激損傷等[13,16-17]。

miR-107與miR-103屬于同一基因簇，且同樣被發(fā)現(xiàn)在多種炎癥相關(guān)的疾病中發(fā)揮著抑制炎癥反應(yīng)等保護(hù)作用[18]。研究表明，高壓氧抑制了髓核細(xì)胞中HMGB1/RAGE信號相關(guān)通路并升高miR-107表達(dá)水平，從而減輕了炎癥反應(yīng)，在腰椎間盤退行性病變中發(fā)揮了治療作用[19]。近期的體外實(shí)驗(yàn)表明，miR-107可以通過KRT1依賴的Notch信號通路減少在冠狀動(dòng)脈硬化小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[12]。另一項(xiàng)研究表明，丙型肝炎病毒(hepatitis cvirus,HCV)可通過降低miR-107和miR-449的表達(dá)水平，靶向調(diào)控白介素6復(fù)合受體從而調(diào)控炎性因子CCL2，促進(jìn)HCV患者肝臟組織中的炎癥反應(yīng)[20]。另外，有大鼠實(shí)驗(yàn)表明，丹參乙酸鎂可通過調(diào)控miR-107/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1信號通路緩解缺血再灌注損傷，且體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，注射丹參乙酸鎂可顯著升高miR-107的表達(dá)水平[21]。以往的這些實(shí)驗(yàn)表明，miR-107是一個(gè)抑炎基因。本研究中，鼻黏膜miR-107在AR患者中顯著低表達(dá)，且與疾病嚴(yán)重程度和炎癥水平呈負(fù)相關(guān)，說明其在AR中或許發(fā)揮抑制疾病進(jìn)展的作用，這個(gè)結(jié)果可能和以往研究發(fā)現(xiàn)的miR-107在多種疾病中通過調(diào)控多種通路或蛋白減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)，包括：(1)通過調(diào)控多種信號通路減少細(xì)胞中的炎性反應(yīng)；(2)通過調(diào)控相關(guān)通路減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)；(3)通過調(diào)控炎性因子表達(dá)水平減輕炎癥等[12,19-21]。另外，筆者還發(fā)現(xiàn)，在AR和對照組患者中，鼻黏膜miR-103和miR-107表達(dá)水平均呈顯著正相關(guān)，或許表明miR-103/miR-107在AR中共同發(fā)揮著抑制疾病進(jìn)展的作用。

本研究還存在一些缺陷：本研究納入樣本量較小，可能導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)效能不足；作為一項(xiàng)單中心研究，大部分患者來自同一地區(qū)，造成了選擇偏移；miR-103和miR-107在AR中的具體分子作用機(jī)制尚未研究。