李文靜，趙新穎，紀(jì)萌琦，郭 鑫，郭 紅，鄧志英，田紀(jì)春

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點實驗室/小麥品質(zhì)育種研究室/山東小麥玉米周年高產(chǎn)高效生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，山東泰安 271018)

小麥?zhǔn)鞘澜缰饕募Z食作物之一，全世界有30%以上的人口以小麥為主糧[1]。抽穗期是與小麥適應(yīng)性直接相關(guān)的一個性狀，對小麥適應(yīng)環(huán)境具有至關(guān)重要的作用[2-3]。小麥穗分化期根據(jù)其在分化過程中所出現(xiàn)的形態(tài)特征，可以分為9個時期，依次為莖葉原基分化期、生長錐伸長期、單棱期、二棱期、穎片原基分化期、小花原基分化期、雌雄蕊原基分化期、藥隔形成期和四分體形成期，其發(fā)育進(jìn)程直接影響小麥抽穗開花時間[4-5]，其中，二棱期與小麥抽穗期的關(guān)系最密切[6-8]。研究抽穗期不同材料間二棱期差異表達(dá)基因，對挖掘和解析開花期相關(guān)基因、推進(jìn)小麥育種進(jìn)程具有重要價值。

轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)技術(shù)可以在沒有完整基因組序列的前提下，對轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)物mRNA進(jìn)行高通量測序，全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的完整表達(dá)信息。作為一種宏觀的整體論方法，轉(zhuǎn)錄組學(xué)改變了以往選定單個基因或少數(shù)幾個基因的研究模式，將植物功能基因組學(xué)研究帶入了一個全新的高速發(fā)展時代。利用該技術(shù)，Zhang等[9]以荔枝休眠芽和圓錐花序形成期的花芽為材料，發(fā)現(xiàn)大量差異表達(dá)基因富集在激素代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上；Kumar等[10]以小麥HD2329為材料，檢測到1 525個顯著差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本與高溫脅迫相關(guān)，其中27個在高溫脅迫下顯著上調(diào)；高溫明顯影響細(xì)胞代謝、蛋白質(zhì)磷酸化和氧化還原過程；Wei等[11]對小麥品種農(nóng)大211的籽粒和莖葉轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測序分析，檢測到61 393個基因參與籽粒發(fā)育過程，其中，7 355個差異表達(dá)基因在籽粒中上調(diào)表達(dá)，許多與糖類和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本和轉(zhuǎn)錄因子在籽粒中大量富集。

小麥基因組比較復(fù)雜，其穗發(fā)育分子機(jī)制的研究進(jìn)展比較緩慢[12-15]。近期，F(xiàn)eng等[16]利用中國春進(jìn)行了小麥花發(fā)育不同階段的轉(zhuǎn)錄組分析，試圖找到特定發(fā)育階段的調(diào)控基因；Wang等[17]測定了90個冬小麥品種二棱期轉(zhuǎn)錄組，并進(jìn)行差異表達(dá)基因與性狀的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)了控制小麥穗結(jié)構(gòu)的調(diào)控因子。小麥近等基因系的遺傳背景高度相似，有利于排除背景差異造成的干擾，是解析遺傳機(jī)制的良好材料。因此，本研究擬選取抽穗期明顯不同的兩個近等基因系二棱期幼穗為材料，利用RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序方法篩選差異表達(dá)基因，通過功能注釋與通路分析，建立小麥穗發(fā)育早期的分子學(xué)研究平臺，為解析小麥抽穗期調(diào)控機(jī)制、挖掘小麥抽穗期相關(guān)基因奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與處理方法

從BC5的F3群體(由DH60和Y57構(gòu)建，Y57為輪回親本)通過前景和背景標(biāo)記選擇，篩選到背景回復(fù)率接近100%的近等基因系96-2，抽穗期與Y57相差10 d；96-2在四葉期時已達(dá)到二棱期，而Y57則在五葉期時達(dá)到二棱期。以近等基因系Y57(抽穗期196 d)和96-2(抽穗期184 d)為材料，挑選其飽滿無病害的種子在室溫下發(fā)芽后，轉(zhuǎn)移至人工智能氣候箱(浙江寧波江南儀器廠)中4 ℃春化4周。春化完成后，挑選長勢一致的植株種植在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室(16 h光/8 h暗，18～25 ℃)，單株種植，每個材料種植100 株，3個重復(fù)。白天采取自然光，夜晚用白熾燈補(bǔ)光，使光照時間達(dá)到16 h。植株達(dá)到三葉期時開始觀察幼穗發(fā)育階段。兩天取樣一次，每個材料選取5 株健壯、生長均勻的植株，用解剖針除去葉片，在體視顯微鏡(PS24C)下進(jìn)行觀察，并記錄每個時期幼穗的表型發(fā)育情況。到達(dá)二棱期時，每個材料取25～30個幼穗，立即投放到液氮中，然后保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 RNA文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序

采用Trizol提取法分別提取Y57和96-2幼穗總RNA，并用NanoDrop 2000檢測RNA濃度和OD260/OD280、OD260/OD230比值。用Agilent 2000進(jìn)一步檢測RNA濃度和28S/18S比值。每個樣取1 μg總RNA，利用Oligo(dT)的磁珠富集純化mRNA；在富集得到的mRNA中加入fragmentation buffer，將mRNA進(jìn)行隨機(jī)打斷；以打斷的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈；利用AMPure XP beads純化cDNA；對純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭；用AMPure XP beads選取合適大小的目的片段(300～400 bp)，通過PCR得到cDNA文庫。

文庫檢測合格之后，由北京百邁客生物科技有限公司使用HiSeq2500進(jìn)行高通量測序，測序讀長為PE125。將測序得到的Raw data進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾(去除測序接頭序列、重復(fù)冗余序列、低質(zhì)量序列)，獲得高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)clean data。采用TopHat2[18]將各樣品測序得到的clean data與中國春參考基因組進(jìn)行序列比對以獲得mapped data。

1.3 qRT-PCR分析

從差異表達(dá)基因中挑選2個表達(dá)趨勢不同的基因，利用Primer-NCBI 在線設(shè)計軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計引物，對ID為Traes_5DL_9CC4EC839(F:5′ -TGAAGGCCAAGGTTGAGACA，R:5′-CGCT GGATGAATGCTGGTAGTTG)和Traes_6DL_7892214C8(F:5′-TGCGGGTCAAATGCGTC GTC，R:5′-CCAGAAGTTGCCGTCGTCCAT C)的基因進(jìn)行實時熒光定量PCR 分析。將各樣品的RNA 采用第1 鏈cDNA 合成試劑盒(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,以Actin(F:5′-ACCTTCAGTTGCCCAGC AAT-3′; R:5′-CAGAGTCGAGCACAATACC AGTTG-3′)為內(nèi)參,采用QIAGEN 公司的SYBR Green RT-PCR 試劑盒,利用ABI 7500熒光定量PCR儀(ABI )進(jìn)行檢測。反應(yīng)體系20 μL：2×Mix 10 μL，引物各(10 μmol·L-1) 0.4 μL，cDNA 2 μL，ROX校準(zhǔn)液 0.4 μL，6.8 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s ，40個循環(huán)。熔解曲線分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。 每對引物均設(shè)置空白對照；3次重復(fù)。采用相對定量2-ΔΔCt法進(jìn)行結(jié)果分析。

1.4 基因表達(dá)差異分析

利用FPKM[19]值反映對應(yīng)基因的表達(dá)量，使用EBSeq[20]進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，獲得兩個樣品間的差異表達(dá)基因集。在差異表達(dá)基因檢測過程中，將Fold Change≥2且FDR<0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。差異倍數(shù)(fold change)表示兩樣品(組)間表達(dá)量的比值。采用Benjamini-Hochberg法校正差異顯著性P值，得到錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)。

1.5 差異表達(dá)基因功能注釋分析

使用BLAST軟件將差異表達(dá)基因與Nr(non-redundant protein sequence database in GenBank)、Swiss-Prot(Swiss-Prot protein sequence database) KEGG數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)行比對，獲得注釋信息。利用比對軟件BLASTX，將差異表達(dá)基因與COG(clusters of orthologous groups of proteins)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，獲得差異表達(dá)基因的COG功能注釋及其分類；利用Blast2GO[21]軟件將差異表達(dá)基因序列與GO(gene ontology)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，進(jìn)行功能注釋，然后利用WEGO軟件[22]對GO功能分類統(tǒng)計。將差異表達(dá)基因與KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTX比對，獲得差異表達(dá)基因相對應(yīng)的Pathway注釋信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 近等基因系幼穗發(fā)育形態(tài)及表型分析

Y57與96-2幼穗分化起始時間一致(圖1)，均在三葉期開始分化，但Y57的伸長期至單棱期和單棱期至二棱期持續(xù)時間均比96-2相應(yīng)時期長。四葉期時，Y57剛進(jìn)入單棱期，而96-2已處于二棱期；五葉期時，Y57到達(dá)二棱期，96-2已處于雌雄蕊分化期；七葉期時，Y57到達(dá)雌雄蕊分化期，96-2處于藥隔形成期。除了抽穗期以外，其他性狀二者均沒有顯著差異(表1)。

A～D依次為Y57伸長期、單棱期、二棱期、雌雄蕊分化期；E～H依次為96-2伸長期、二棱期、雌雄蕊分化期、藥隔形成期。

A-D indicate elongation stage,single ridge stage,double ridge stage,and pistil and stamen differential stage of Y57,resepectively; E-H indicate elongation stage,double ridge stage,pistil and stamen differential stage,and anther separation stage of 96-2,respectively.

圖1近等基因系幼穗發(fā)育動態(tài)

Fig.1Developmentofyoungspikeofnearisogeniclines

表1 近等基因系(NIL)96-2和Y57表型分析Table 1 Phenotypic data of near-isogenic lines(NIL) 96-2 and Y57

同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Different letters following data at same column indicate significant differences between NILs at 0.05 level.

2.2 RNA轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)量分析

通過高通量測序，Y57和96-2分別獲得25 123 097和30 481 790條pair-end read，每個樣品均獲得6.3 G以上的堿基，各樣品Q30堿基百分比均大于85.5%(表2)，表明轉(zhuǎn)錄組測序得到的結(jié)果可靠。Y57和96-2與中國春基因組比對成功的read數(shù)量分別為38 021 371和42 375 610，占總read數(shù)的63.11%和69.51%，比對到參考基因組唯一位置的read數(shù)在clean read 中所占的比率分別為56.07%和61.59%(表2)，表明兩個樣品的read數(shù)與參考基因組的比對效率較高，可以進(jìn)行下一步分析。

表2 測序數(shù)據(jù)評估及比對分析Table 2 Statistical results of sequencing data

2.3 差異表達(dá)基因分析

采用FPKM值作為衡量基因表達(dá)水平的指標(biāo)，在差異表達(dá)基因檢測過程中，以Y57為對照組，將Fold Change≥2且FDR<0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。共篩選出395個差異表達(dá)基因(圖2)，其中，上調(diào)和下調(diào)基因分別為138個和257個，與Nr數(shù)據(jù)庫對比得到382個注釋基因。對篩選出的差異表達(dá)基因根據(jù)其相同或相似表達(dá)模式進(jìn)行了聚類分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)有6種模式，其中，基因在2個材料中的差異表達(dá)主要在前5種模式上。在上調(diào)表達(dá)基因中，表達(dá)量差異最大的2個基因均編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A，log2(Y57 FPKM/96-2 FPKM)值分別為7.36和5.74。

2.4 差異表達(dá)基因COG分類分析

對已注釋的382個差異表達(dá)基因進(jìn)行比對和功能注釋，結(jié)果表明，在COG功能分類體系中，共有103個差異表達(dá)基因獲得了功能注釋，涉及20個COG功能類別(圖4)。其中，一般功能基因(general function prediction only)所占比例最大，有25個基因；其次為信號傳導(dǎo)(signal transduction mechanism)和轉(zhuǎn)錄(transcription)相關(guān)基因，分別有15和13個。

火山圖中每個點表示一個基因，紅色點表示基因表達(dá)沒有達(dá)到顯著性差異，藍(lán)色點表示基因表達(dá)達(dá)到顯著性差異。

Each dot indicates one gene. The red dot shows no significant difference of gene expression, and the blue dot is the gene expression with significant difference.

圖2差異表達(dá)基因統(tǒng)計及其火山圖

Fig.2Statisticsofdifferentiallyexpressedgenesanditsvalcanochart

2.5 差異表達(dá)基因GO分類分析

對已注釋的382個差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和分類統(tǒng)計。共有298個基因獲得GO功能注釋，主要為細(xì)胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物學(xué)過程(biological process) 3大類別，分別包含17、17和20個功能分類(圖5)。在細(xì)胞組分分類中，涉及細(xì)胞組分(cell part)的差異表達(dá)基因(DEG)所占比例最多，占85.23%，其次是涉及細(xì)胞(cell)和細(xì)胞器(organelle)的DEG，分別占80.53%、73.83%；而涉及到細(xì)胞外基質(zhì)部分(extracellular matrix part)、膠原三聚體(collagen trimer)、病毒體(virion)及其組分(virion part)的DEG所占比例最低。在分子功能分類中，與結(jié)合相關(guān)的DEG所占比例最多，占64.42%，其次是與催化活性(catalytic activity)和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(nucleic acid binding transcription factor activity)相關(guān)DEG，分別占45.97%和12.08%。在生物學(xué)過程中，與細(xì)胞進(jìn)程(cellular process)相關(guān)的DEG所占比例最多，占75.50%，其次為與代謝過程(metabolic process)相關(guān)的DEG，占74.16%；而與生物附著(biological adhesion)和運(yùn)動力(locomotion)相關(guān)DEG所占比例不到0.1%。

2.6 差異表達(dá)基因KEGG通路分析

將382個已注釋的差異表達(dá)基因與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，共有63個基因富集到35個KEGG通路中，其中，在光合作用-天線蛋白(photosynthesis-antenna protein,ko00196)和甘油磷脂代謝(glycerophospholipid metabolism,ko00564)通路上的富集基因顯著高于其他通路(P<0.05)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，富集在光合作用-天線蛋白通路上的差異表達(dá)基因均上調(diào)表達(dá)(表3)，涉及穗發(fā)育的代謝途徑主要有植物生理節(jié)律(ko04712)、淀粉與糖代謝(ko00500)、光合作用(Photosynthesis)和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(ko04075)途徑。

2.7 功能注釋為轉(zhuǎn)錄因子的分類分析

對在nr數(shù)據(jù)庫中得到功能注釋的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)功能注釋為轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)基因有19個(表4)。6 個差異表達(dá)基因?qū)儆赪RKY轉(zhuǎn)錄因子家族，它們在Y57中的表達(dá)量均顯著小于96-2。屬于Myb家族(4 個)、AP2/ERF家族(4 個)和C3H家族(2 個)的差異表達(dá)基因均下調(diào)。兩個MADS-box 基因表達(dá)趨勢相反，一個上調(diào)一個下調(diào)。這些家族轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物多個生長發(fā)育過程，部分基因影響植物抽穗開花時間和花器官的形成。

不同的顏色表示每個基因表達(dá)水平的高低。

Different colours mean different gene expression levels.

圖3近等基因系間差異表達(dá)基因的熱點圖

Fig.3Heatmapofthedifferentexpressiongenesofthetwonearisogeniclines

A:RNA加工與修飾; B:染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與變化; C:能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化; D:細(xì)胞周期調(diào)控與分類，染色體重排; E:氨基酸運(yùn)輸與代謝; F:核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)輸與代謝; G:碳水化合物運(yùn)輸與代謝; H:輔酶運(yùn)輸與代謝; I:脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝; J:翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成; K:轉(zhuǎn)錄; L:復(fù)制、重組與修復(fù); M:細(xì)胞壁、膜生物發(fā)生; N:細(xì)胞運(yùn)動; O:蛋白質(zhì)翻譯后修飾與轉(zhuǎn)運(yùn)，分子伴侶; P:無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝; Q:次生代謝物合成、運(yùn)輸與代謝; R:一般功能; S:功能未知; T:信號轉(zhuǎn)導(dǎo); U:細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，分泌和囊泡運(yùn)輸; V:防御機(jī)制; W:細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu); Y:核結(jié)構(gòu); Z:細(xì)胞骨架。

A:RNA processing and modification; B:Chromatin structure and dynamics; C:Energy production and conversion; D:Cell cycle control,cell division,chromosome partitioning; E:Amino acid transport and metabolism; F:Nucleotide transport and metabolism; G:Carbohydrate transport and metabolism; H:Coenzyme transport and metabolism; I:Lipid transport and metabolism; J:Translation,ribosomal structure and biogenesis; K:Transcription; L:Replication,recombination and repair; M:Cell wall/membrane/envelope biogenesis; N:Cell motility; O:Posttranslational modification,protein turnover,chaperones; P:Inorganic ion transport and metabolism; Q:Secondary metabolites biosynthesis,transport and catabolism; R:General function prediction only; S:Function unknown; T:Signal transduction mechanisms; U:Intracellular trafficking,secretion,and vesicular transport; V:Defense mechanisms; W:Extracellular structures; Y:Nuclear structure; Z:Cytoskeleton.

圖4差異表達(dá)基因COG功能分類

Fig.4COGfunctionclassificationofdifferentiallyexpressedgenes

C1:細(xì)胞組分; C2:細(xì)胞; C3:細(xì)胞器; C4:膜; C5:細(xì)胞器部分; C6:細(xì)胞膜部分; C7:大分子復(fù)合物; C8:胞外區(qū); C9:細(xì)胞連接; C10:膜封閉腔; C11:胞外區(qū)要素; C12:核仁; C13:細(xì)胞外基質(zhì); C14:細(xì)胞外基質(zhì)部分; C15:病毒體; C16:病毒體組分; C17:膠原三聚體; M1:結(jié)合; M2:催化活性; M3:轉(zhuǎn)運(yùn)活性; M4:核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性; M5:電子載體活性; M6:結(jié)構(gòu)分子活性; M7:分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性; M8:受體活性; M9:酶調(diào)節(jié)活性; M10:抗氧化活性; M11:蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性; M12:營養(yǎng)庫活性; M13:鳥苷酸交換因子活性; M14:金屬伴侶活性; M15:翻譯調(diào)節(jié)活性; M16:蛋白標(biāo)簽; M17:通道調(diào)節(jié)活性; B1:細(xì)胞反應(yīng)過程; B2:代謝過程; B3:單生物體過程; B4:刺激應(yīng)答; B5:生物學(xué)調(diào)控; B6:組織或生物起源細(xì)胞組件; B7:發(fā)育過程; B8:定位; B9:多細(xì)胞生物體過程; B10:生殖生長過程; B11:多生物體過程; B12:信號; B13:生長; B14:免疫系統(tǒng)過程; B15:生殖; B16:節(jié)律過程; B17:生物附著; B18:生物階段; B19:運(yùn)動; B20:細(xì)胞致死。

C1:Cell part; C2:Cell; C3:Organelle; C4:Membrane; C5:Organelle part; C6:Membrane part; C7:Macromolecular complex; C8:Extracellular region; C9:Cell junction; C10:Membrane-enclosed lumen; C11:Extracellular region part; C12:Nucleoid; C13:Extracellular matrix; C14:Extracellular matrix part; C15:Virion; C16:Virion part; C17:Collagen trimer; M1:Binding; M2:Catalytic activity; M3:Transporter activity; M4:Nucleic acid binding transcription factor activity; M5:Electron carrier activity; M6:Structural molecule activity; M7:Molecular transducer activity; M8:Receptor activity; M9:Enzyme regulator activity; M10:Antioxidant activity; M11:Protein binding transcription factor activity; M11:Protein binding transcription factor activity; M12:Nutrient reservoir activity; M13:Guanyl-nucleotide exchange factor activity; M14:Metallochaperone activity; M15:Translation regulator activity; M16:Protein tag; M17:Channel regulator activity; B1:Cellular process; B2:Metabolic process; B3:Single-organism process; B4:Response to stimulus; B5:Biological regulation; B6:Cellular component organization or biogenesis; B7:Developmental process; B8:Localization; B9:Multicellular organismal process; B10:Reproductive process; B11:Multi-organism process; B12:Signaling; B13:Growth; B14:Immune system process; B15:Reproduction; B16:Rhythmic process; B17:Biological adhesion; B18:Biological phase; B19:Locomotion; B20:Cell killing.

表4 編碼為轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)基因Table 4 Differentially expressed genes encoding transcription factors

2.8 qRT-PCR結(jié)果驗證

從差異表達(dá)基因中挑選4個表達(dá)明顯不同的基因進(jìn)行驗證，其中2個是表達(dá)趨勢不同的基因(Traes_5DL_9CC4EC839和Traes_6DL_7892214C8)，另外2個是表達(dá)量顯著不同的基因(Traes_5DL_52EC7112A和Traes_3DS_92091AAD4)。利用實時熒光定量PCR分析這4個基因在2個材料中的相對表達(dá)水平，對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行可靠性驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4個基因的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與熒光定量結(jié)果一致(圖6)；通過對三個不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組測序基因表達(dá)水平和基因相對表達(dá)量的相關(guān)性分析可知，Traes_5DL_9CC4EC839和Traes_6DL_7892214C8基因在YM57和96-2中的相關(guān)系數(shù)分別為0.951，0.644，0.994和0.961； Traes_3DS_92091AAD4和Traes_5DL_52EC7112A.2基因在YM57和96-2中的相關(guān)系數(shù)分別為1、0.667、1和0.762，都達(dá)顯著水平，表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠。

A、C、E、G為轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，B、D、F、H為RT-PCR結(jié)果; A和B是基因Traes_5DL_9CC4EC839的驗證結(jié)果；C和D是基因Traes_6DL_7892214C8的驗證結(jié)果；E和F是基因Traes_3DS_92091AAD4的驗證結(jié)果；G和H是Traes_5DL_52EC7112A.2基因的驗證結(jié)果;4L、5L、7L分別代表四葉期、五葉期、七葉期。

A,C,E,G are the result of transcriptome sequencing；B,D,F,H are the result of qRT-PCR; A and B are the result of the gene Traes_5DL_9CC4EC839；C and D are the result of the gene Traes_6DL_7892214C8; E and F are the result of the gene Traes_3DS_92091AAD4;G and H are the result of the gene Traes_5DL_52EC7112A.2; 4L，5L，7L are the 4th leaf age,the 5th leaf age,the 7th leaf age,respetively.

圖6轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與RT-PCR結(jié)果比較

Fig.6ComparisonofRNA-seqversusqRT-PCRdataforselectedgenes

3 討 論

生產(chǎn)上普遍種植的小麥?zhǔn)钱愒戳扼w，含有A、B、D三個基因組，基因組大約17 G。普通小麥的形成涉及3個原始祖先物種和兩次天然雜交，烏拉爾圖、擬斯卑爾托山羊草和粗山羊草分別是小麥A、B、D基因組的供體[23]。雖然目前A和D基因組測序和草圖繪制已經(jīng)完成[24-25]，與水稻、玉米等作物相比，小麥分子基礎(chǔ)研究還很薄弱，遺傳背景了解還比較少。近幾年來基于Illumina 測序平臺的RNA-seq技術(shù)已成為快速而全面地建立植物分子基礎(chǔ)平臺的有力工具[26-27]。

小麥穗發(fā)育是一個受多基因和環(huán)境調(diào)控的復(fù)雜過程，二棱期是與小麥抽穗期關(guān)系最密切的時期。本研究利用RNA-seq測序技術(shù)獲得Y57和96-2比對到參考基因組(中國春)上的reads數(shù)分別為38 021 371和42 375 610，但是2個材料在二棱期僅篩選出395個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因138個，下調(diào)基因257個。這也說明了Y57和96-2遺傳背景高度一致，減少了遺傳背景對差異表達(dá)基因篩選的影響。而Feng等[16]利用普通小麥中國春進(jìn)行了小麥花不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組分析，其中找到在二棱期特異表達(dá)的基因464個，這些基因主要富集在核酸綁定(nucleic acid binding)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性(transcription regulator activity)、轉(zhuǎn)錄因子活性(transcription factor activity)及DNA綁定等功能。將本研究找到的這些差異基因在Nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋，其中382個基因獲得了功能注釋；有298個基因獲得GO功能注釋，這些差異表達(dá)基因的功能也主要集中在結(jié)合(binding)、催化活性(catalytic activity)和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(nucleic acid binding transcription factor activity)等方面，與Feng等[16]研究結(jié)果類似。Wang等[17]利用90個冬小麥品種在二棱期早期及小穗原基形成期進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，并將獲得的差異表達(dá)基因與穗部相關(guān)性狀進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)小穗數(shù)與基因表達(dá)水平呈顯著相關(guān)，其次是小花數(shù)和穗粒數(shù); 由此可知，二棱期是小麥穗部發(fā)育形成的關(guān)鍵時期。對本研究獲得的差異基因進(jìn)行COG功能注釋，有103個基因獲得COG功能注釋，只有63個基因被注釋到KEGG代謝通路中。注釋基因信息之所以缺失，一方面可能是因為小麥基因組測序還沒有完成，無法對整個基因組進(jìn)行功能注釋; 另一方面，目前對小麥轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究還處于初級階段，現(xiàn)在的研究主要集中在小麥抗逆性方面[14,28]，基因功能注釋信息不夠豐富，生物信息數(shù)據(jù)庫還不夠完善，部分序列或基因無法獲得相應(yīng)的功能注釋信息。

本研究發(fā)現(xiàn)，Traes_5DL_52EC7112A和Traes_3DS_92091AAD4為絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A同源基因，且它們在Y57中幾乎不表達(dá)而在96-2中表達(dá)量較高。Janssens等[29]和Yu等[30]都表明絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A(PP2A)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞生長、分化方面起重要的調(diào)控作用，能夠促進(jìn)植物生長發(fā)育。擬南芥的PP2A顯著影響生長素轉(zhuǎn)運(yùn)[31]。由此推測，這兩個基因可能與小麥幼穗分化有關(guān)，對小麥抽穗期有正調(diào)控作用。

本研究中，差異表達(dá)基因中有多個WRKY、MADS-box、Myb-like和ERF/AP2轉(zhuǎn)錄因子。ERF/AP2和WRKY轉(zhuǎn)錄因子是許多植物生長發(fā)育過程，如應(yīng)答生物和非生物脅迫、種子萌發(fā)、ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等的主要調(diào)控因子。Kiseleva等[32]認(rèn)為ERF/AP2和WRKY轉(zhuǎn)錄因子可能影響小麥抽穗期，在大豆[33]和芒草[34]中也發(fā)現(xiàn)了控制開花期的WRKY轉(zhuǎn)錄因子。已有大量研究證明MADS-box基因家族參與生長點的確定、春化過程、開花時間調(diào)控和果實成熟等多個重要發(fā)育過程[35-37]。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)Myb-like家族轉(zhuǎn)錄因子是晝夜節(jié)律鐘和花青素合成途徑中的調(diào)控因子[38]，晝夜節(jié)律鐘可以通過調(diào)控下游基因的表達(dá)控制植物開花時間。Myb-like家族轉(zhuǎn)錄因子對小麥抽穗期的作用還需要進(jìn)一步研究。

在生物體內(nèi)，不同的基因產(chǎn)物相互協(xié)調(diào)行使生物學(xué)功能，對差異表達(dá)基因的通路注釋分析有助于進(jìn)一步解讀基因的功能。本研究KEGG分析結(jié)果表明，差異表達(dá)基因顯著富集在光合作用-天線蛋白和甘油磷脂代謝通路上。篩選到參與光合作用-天線蛋白通路中的Lhca2、Lhcb1、Lhcb2、 Lhcb3和Lhcb4差異表達(dá)基因均上調(diào)表達(dá)。它們是光系統(tǒng)Ⅰ和光系統(tǒng)Ⅱ的組成部分，參與光吸收和光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在光周期控制開花反應(yīng)中，植物通過光受體感受外界的光信號并將光信號傳遞到晝夜節(jié)律鐘系統(tǒng)控制植物的開花時間[39]，推測這些基因可能通過光周期途徑正調(diào)控小麥抽穗期。對甘油磷脂代謝通路對穗發(fā)育的影響還有待于進(jìn)一步研究。本研究還對差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO和COG功能分類，差異表達(dá)基因主要涉及植物生長發(fā)育細(xì)胞部分、結(jié)合、細(xì)胞運(yùn)輸過程、代謝過程、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和轉(zhuǎn)錄等，說明參與小麥幼穗分化前期差異表達(dá)基因主要集中于細(xì)胞內(nèi)，DNA、RNA和蛋白質(zhì)等代謝旺盛，為細(xì)胞分裂、生長和分化提供信息、能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。