常夢春 ，劉靜靜 ，劉勃纓 ，任 靜 ，張麗娜 ，李佳瑋 ，劉志東

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程中心，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津 300193）

升麻葛根湯，方出自宋代閻孝忠的《閻氏小兒方論》，又名平血飲，后被收錄于《太平惠民和劑局方》中，是方劑學(xué)“辛涼解表劑”的代表方。原方組成為：升麻 2 g，葛根 3 g，白芍 2 g，炙甘草 2 g。用法：研成粗末，每服三錢（9 g），水一盞半，煎取一中盞，去滓。具有解肌透疹、辛涼解毒的功效。主治：麻疹初期，疹發(fā)不出，身熱頭痛，咳嗽，目赤流淚，口渴，舌紅、苔薄而干，脈浮數(shù)[1]。升麻性甘、辛，微寒，歸肺、脾、胃、大腸經(jīng)，具有發(fā)表透疹，淸熱解毒，升舉陽氣的功效，為君藥；葛根性甘、辛，涼，歸脾、胃、肺經(jīng)，為臣藥，與君藥升麻合用辛能達(dá)表，為透疹解肌之要藥；白芍性味苦、酸，微寒，歸肝、脾經(jīng)，養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗，柔肝止痛，平抑肝陽為佐藥；炙甘草性味甘，平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，補(bǔ)脾和胃，益氣復(fù)脈，調(diào)和藥性，為佐使藥[2]。臨床升麻葛根湯主要用于治療乙型、丙型病毒性肝炎、藥物性肝病、耳鼻喉科疾病、痘疹未發(fā)，或發(fā)而不暢等病癥[3-9]。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，升麻中有機(jī)酸類成分主要有阿魏酸、異阿魏酸，具有抗炎、陣痛的功效[10-12]，并以阿魏酸、異阿魏酸為指標(biāo)控制其質(zhì)量[13]；異黃酮類化合物是葛根的主要活性成分，主要有葛根素、大豆苷、大豆苷元等，其中葛根素是葛根特有成分[14]；白芍中主要含有成分為芍藥總苷（TGP），包括芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷等[15]。TGP具有抗炎、抗?jié)?、抗病毒、免疫抑制等多種藥理作用，對于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病有確切的治療作用[16-17]。本實(shí)驗(yàn)建立了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC－MS/MS）的方法測定犬血漿中異阿魏酸、葛根素、芍藥苷的血藥濃度，并對犬灌胃給予升麻葛根湯顆粒后異阿魏酸、葛根素、芍藥苷的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究。

1 材料

1.1 儀器與試藥 液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Agilent公司，包括1290型高效液相色譜儀、6460型三重四級桿質(zhì)譜儀，MassHunter工作站）；XW-80A型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；XP205型十萬分之一天平（METTLER TOLEDO）；ST16R型通用臺式離心機(jī)（美國Thermo公司）。

升麻葛根湯顆粒（批號160503，由深圳華潤三九醫(yī)藥股份有限公司提供）；異阿魏酸（批號111698-201103，含量以99.2%計(jì)，中國食品藥品檢定研究院）；葛根素（批號110752-201514，含量以95.5%計(jì)，中國食品藥品檢定研究院）；芍藥苷（批號110736-201539，含量以96.4%計(jì)，中國食品藥品檢定研究院）；甲苯磺丁脲（批號20160802，Sigma公司）；甲醇、乙腈均為色譜純（購自Fisher Scientific公司）；甲酸為色譜純（購自Fluka公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Beagle犬，雌雄各半，體質(zhì)量10～12 kg，由沈陽軍區(qū)總院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供，許可證號：syxk（軍）2012-0022。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 精密稱取對照品約5.0 mg，加甲醇溶解定容于25 mL量瓶中，得濃度為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，4℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 混標(biāo)溶液的配制 精密移取各對照品1 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定溶至刻度，搖晃均勻，得濃度為20 μg/mL的混標(biāo)溶液，4℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取甲苯磺丁脲對照品約5.0 mg，加甲醇定容于25 mL量瓶中，得濃度為200 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，4℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC?BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美國 Waters公司）；柱溫：25 ℃；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；檢測波長：320 nm；流動(dòng)相：0.05%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫（0～2 min，5%B～70%B；2～4.5 min，70%B～100%B；4.5～5.5 min，100%B ～100%B；5.5～6 min，100%B～100%B；6～7 min，5%B～5%B）。

2.5 質(zhì)譜條件 離子源：采用電噴霧離子源（ESI源）；檢測方式：負(fù)離子檢測；掃描方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）；干燥氣：N2；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：11 L/min；霧化氣壓力：15 psi；毛細(xì)管電壓：3 500 V，具體參數(shù)見表1。

表1 芍藥苷、異阿魏酸、葛根素的主要質(zhì)譜條件

2.6 血漿樣品處理方法 取200μL血漿加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液（甲苯磺丁脲2 μg/mL），加入乙腈1 mL，渦旋 5 min，10 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液，氮?dú)獯蹈伞＜尤?00 μL甲醇復(fù)溶，渦旋5min，10000r/min離心5min，取上清液進(jìn)LC-MS/MS分析。

2.7 所用軟件（版本）及統(tǒng)計(jì)分析方法 使用Win-Nonlin6.4軟件的非房室模型計(jì)算方法計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 專屬性 分別取空白血漿、空白血漿加標(biāo)準(zhǔn)品和血漿樣品，按照“血漿樣品處理方法”處理后進(jìn)樣。結(jié)果表明，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定。見圖1。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液200 μL，氮?dú)獯蹈?，加入空白血漿200 μL，使芍藥苷濃度為4 144、2 072、1 036、518、207.2、103.6、51.8、10.36 ng/mL，葛根素濃度為 4 160、2 080、1 040、520、208、104、52、10.4 ng/mL，異阿魏酸濃度為 4 240、2 120、1 060、530、212、106、53、10.6 ng/mL，按照“血漿樣品處理方法”處理后進(jìn)樣，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測物濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)（W=1/x）法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。異阿魏酸回歸方程為Y=9.487 6X+5.2574，r2=0.998 9；葛根素回歸方程為Y=2.871 4X+4.405 9，r2=0.998 7；芍藥苷回歸方程為Y=4.484 9X-2.992 0，r2=0.995 6。

3.3 提取回收率 取200 μL混標(biāo)，氮?dú)獯蹈桑础把獫{樣品處理方法”項(xiàng)下的方法分別制備低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)量控制（QC）樣品（n=6），所得樣品濃度與除用混標(biāo)復(fù)溶，按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下的方法分別制備低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)量控制（QC）樣品（n=6）濃度相比，測定提取回收率。結(jié)果顯示該方法的提取回收率均在61.55%±（1.06～81.71）%±2.82之間，RSD＜15%符合生物樣品測定要求，結(jié)果見表2。

3.4 基質(zhì)效應(yīng) 取空白血漿200 μL，除去用混標(biāo)復(fù)溶外，按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下的方法分別制備低、中、高 3個(gè)濃度的質(zhì)量控制（QC）樣品（n=6），所得的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品溶液直接進(jìn)樣所得峰面積相比，測定基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果顯示不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表2。

3.5 精密度及準(zhǔn)確度 取空白血漿200 μL，按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下的方法分別制備低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)量控制（QC）樣品（n=6），在同日內(nèi)用同一條標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行處理、分析，得到日內(nèi)精密度RSD、日間精密度RSD和準(zhǔn)確度RE。結(jié)果表明4個(gè)化合物日內(nèi)精密度RSD＜15%、日間精密度RSD＜15%，準(zhǔn)確度偏差RE值均在±15%以內(nèi)，均符合目前生物樣品分析方法指導(dǎo)原則的有關(guān)規(guī)定，結(jié)果見表3。

圖1 犬血漿LC-MS/MS色譜圖

3.6 穩(wěn)定性 取空白血漿200 μL，按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下的方法分別制備低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)量控制（QC）樣品（n=6），考察樣品在室溫放置24 h（short-term stability）、-20 ℃反復(fù)凍融 3次（freeze-thaw stability）、-20 ℃凍融 30 d（long-term stability）。結(jié)果顯示4個(gè)化合穩(wěn)定性RE值均在±15%以內(nèi)，表明芍藥苷、葛根素、異阿魏酸在上述條件下可保持穩(wěn)定，結(jié)果見表4。

3.7 藥動(dòng)學(xué)研究 取受試犬6只，給藥前禁食12 h，自由飲水。灌胃給予升麻葛根湯顆粒，劑量9 g/只（成人一天給藥劑量為9 g）。于給藥前0 h及給藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10、12、24 h 取犬前腿靜脈血2.5 mL，置肝素離心管中，3 000 r/min離心10 min，分離血漿至試管中，-80℃冷凍待測，作為血漿樣品。測定時(shí)，取樣品血漿按“2.6”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測定血藥濃度，并計(jì)算芍藥苷、葛根素、異阿魏酸的血藥濃度，繪制平均藥時(shí)曲線，結(jié)果見圖2。

表2 芍藥苷、葛根素和異阿魏酸的提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)（n=6）

表3 方法的精密度和準(zhǔn)確度測定結(jié)果（n=6）

表4 犬血漿樣品中芍藥苷、異阿魏酸和葛根素在不同儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性（n=6）

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對血漿樣品中3種成分的提取方法進(jìn)行了考察：甲醇沉淀、乙腈沉淀、乙酸乙酯提取、叔丁基甲醚提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙睛沉淀無內(nèi)源性物質(zhì)干擾，重現(xiàn)性好，可達(dá)實(shí)驗(yàn)測定要求。考察了不同比例甲醇-甲酸水、乙睛-甲酸水及乙睛-甲酸銨、乙睛-乙酸銨作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)所建立的流動(dòng)相梯度洗脫程序能有效地將3個(gè)成分和內(nèi)源性成分分離。

圖2 犬灌胃給藥升麻葛根湯顆粒后芍藥苷、異阿魏酸和葛根素血漿藥物濃度時(shí)間曲線（n=6）

表5 犬灌胃給藥升麻葛根湯顆粒后芍藥苷、異阿魏酸和葛根素的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（，n=6）

表5 犬灌胃給藥升麻葛根湯顆粒后芍藥苷、異阿魏酸和葛根素的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（，n=6）

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HPLC法同時(shí)檢測異阿魏酸、葛根素、芍藥苷的含量及指紋圖譜文獻(xiàn)多有報(bào)道[18-21]，單個(gè)化合物的藥代動(dòng)力學(xué)也有較多文獻(xiàn)研究[22-24]，但是3種化合物同時(shí)檢測未見報(bào)道。本文以甲苯磺丁脲為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，采用LC-MS/MS建立了犬灌胃給予中藥復(fù)方“升麻葛根湯”顆粒后血漿中異阿魏酸、葛根素、芍藥苷的含量測定方法，為升麻葛根湯顆粒的質(zhì)量控制及藥理作用研究提供了依據(jù)。芍藥苷屬于苷類、中性化合物，正負(fù)離子檢測模式均可，本實(shí)驗(yàn)通過條件優(yōu)化結(jié)果比較可知，負(fù)離子檢測模式較好，適合芍藥苷的體內(nèi)分析及藥動(dòng)學(xué)研究，具有較好的參考價(jià)值。該方法具有較高的專屬性、靈敏度，且提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)、精密度與準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性均符合生物樣品測定要求。