王臣玉，張耀東，張迎輝※

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南省兒童醫(yī)院兒科，鄭州 450018)

遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥(hereditary spherocytosis，HS)又稱先天溶血性貧血，其在世界范圍內(nèi)均有發(fā)病，主要因先天性紅細(xì)胞膜骨架蛋白異常所致，目前臨床主要采用部分脾切除、脾動(dòng)脈栓塞術(shù)及全脾切除治療，HS患兒常散發(fā)性就診，誤診及漏診率較高，易延誤救治時(shí)間，威脅患兒生命安全[1-3]。HS發(fā)病的分子機(jī)制是紅細(xì)胞膜骨架缺陷，導(dǎo)致表面積減少，并促使其發(fā)生球形改變，導(dǎo)致紅細(xì)胞膜彈性及機(jī)械穩(wěn)定性喪失，這主要與基因突變有關(guān)[4]。HS可分為常染色體顯性遺傳和隱性遺傳，其分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)具有異質(zhì)性，紅細(xì)胞膜蛋白缺陷類型及基因突變類型均存在明顯差異。研究表明，SLC4A1(編碼帶3蛋白)、ANK1(編碼錨蛋白)、SPTA1(編碼α-血影蛋白)、SPTB(編碼β-血影蛋白)、EPB42(編碼4.2蛋白)等基因的突變與HS密切相關(guān)[5]。有研究顯示，帶3蛋白缺陷與錨蛋白缺陷是HS患兒紅細(xì)胞膜蛋白缺陷的主要類型[6-7]。目前關(guān)于HS相關(guān)基因突變的研究較少，現(xiàn)就基因突變與HS關(guān)系的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為臨床診斷HS及產(chǎn)前優(yōu)生檢查提供參考依據(jù)。

1 HS主要臨床表現(xiàn)及其病機(jī)

1.1主要臨床表現(xiàn) HS輕度患兒無明顯癥狀，根據(jù)家族史及實(shí)驗(yàn)室檢查(外周血涂片球形紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)、骨髓細(xì)胞學(xué)檢查等)明確診斷；中度與重度患兒表現(xiàn)為貧血、黃疸、脾腫大等[8]，部分患兒合并膽囊結(jié)石，臨床表現(xiàn)異質(zhì)性明顯，同時(shí)需與營養(yǎng)性貧血、自身免疫性溶血性貧血、血紅蛋白病等相鑒別。研究顯示，HS患兒發(fā)病率明顯高于臨床診出率[9]。外周血球形紅細(xì)胞增多、紅細(xì)胞滲透脆性增加、慢性貧血伴急性溶血等是HS的主要臨床特征，而球形紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞膜蛋白分析及基因檢測等均可用于HS的診斷[10]。HS屬于遺傳性溶血性貧血，患者臨床病理特征較為嚴(yán)重，并具有蛋白缺陷及異質(zhì)性遺傳等特點(diǎn)，其主要臨床特征為紅細(xì)胞球型改變及滲透脆性增加等。HS新生兒出現(xiàn)嚴(yán)重貧血及黃疸時(shí)需接受輸血治療，甚至光療等，嬰兒期未有明顯癥狀，年長兒發(fā)病時(shí)以輕度黃疸、貧血為主要臨床癥狀，其發(fā)病原因主要為受涼感冒或過度勞累等，成年期HS以貧血、黃疸及脾腫大為主要臨床表現(xiàn)，外周血涂片檢測發(fā)現(xiàn)球形細(xì)胞和紅細(xì)胞滲透脆性增加。

1.2HS發(fā)病機(jī)制 HS的發(fā)病機(jī)制主要是紅細(xì)胞膜骨架蛋白基因突變，導(dǎo)致紅細(xì)胞膜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而促使紅細(xì)胞變?yōu)榍蛐?，由于球形紅細(xì)胞變形能力差，導(dǎo)致易被破壞而發(fā)生溶血性貧血。紅細(xì)胞膜的主要組成成分為蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及糖類，其中蛋白質(zhì)主要由錨蛋白、膜血影蛋白、4.1蛋白、4.2蛋白等組成[11]，蛋白質(zhì)主要組成蛋白發(fā)生改變可引發(fā)紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而影響HS的發(fā)生。膜蛋白缺陷：①錨蛋白缺陷。編碼基因?yàn)锳NK1，蛋氨酸與異亮氨酸內(nèi)含子剪切位點(diǎn)G→A突變引起該蛋白缺陷。②血影蛋白β缺陷。編碼基因?yàn)镾PTB，屬于常染色體顯性遺傳，SPTB基因突變可促使該蛋白缺失，進(jìn)而引發(fā)橢圓形紅細(xì)胞增多癥。③血影蛋白α缺陷。在北歐居民中，血影蛋白α缺陷約占5%，可引發(fā)HS，呈常染色體隱性遺傳[12]。④帶3蛋白缺陷。有調(diào)查顯示，因帶3蛋白缺失導(dǎo)致HS的人數(shù)占HS患者的54%(162/300)，其編碼基因?yàn)镾LC4A1，呈常染色體顯性遺傳，SLC4A1基因突變可促使紅細(xì)胞變?yōu)榍蛐蝃13]。⑤帶4.2蛋白缺陷。因帶4.2蛋白缺失引發(fā)的HS人數(shù)較少，EPB42基因可編碼該蛋白，并呈常染色體隱性遺傳，該蛋白缺失可改變細(xì)胞膜豎向結(jié)構(gòu)，進(jìn)而促使紅細(xì)胞變?yōu)榍蛐?，?dǎo)致溶血發(fā)生[14]。溶血機(jī)制：紅細(xì)胞膜性質(zhì)改變導(dǎo)致變形能力下降，并促使其形態(tài)變?yōu)榍蛐?，球形紅細(xì)胞膜蛋白磷酸化功能降低，離子通透性增加，導(dǎo)致鈉泵作用明顯增強(qiáng)，繼而促使細(xì)胞膜硬化，一旦經(jīng)過脾竇微血管，球形紅細(xì)胞將被滯留，進(jìn)而被巨噬細(xì)胞吞噬，星兒導(dǎo)致血管外溶血的發(fā)生[15]。

2 HS基因突變研究

2.1SLC4A1基因

2.1.1SLC4A1基因及其編碼的帶3蛋白 SLC4A1基因位于染色體17q21，可編碼帶3蛋白。帶3蛋白主要分布在小腸上皮細(xì)胞、紅細(xì)胞及淋巴細(xì)胞中，其約占紅細(xì)胞蛋白總量的25%[16]。研究顯示，帶3蛋白具有調(diào)節(jié)糖酵解酶活性以及維持紅細(xì)胞膜骨架穩(wěn)定等功能[17]。提示帶3蛋白缺失可導(dǎo)致紅細(xì)胞膜表面積減少，并降低紅細(xì)胞膜骨架穩(wěn)定性，進(jìn)而導(dǎo)致紅細(xì)胞變?yōu)榍蛐巍?/p>

2.1.2SLC4A1基因突變與HS 研究顯示，HS患兒及其父親均發(fā)生SLC4A1基因Arg808His位點(diǎn)突變，即G→AG→A突變，但DNA序列檢測發(fā)現(xiàn)其祖父母未發(fā)生相同突變，提示患兒父親發(fā)生Arg808His新型突變，并與帶3蛋白缺失密切相關(guān)[18]。研究顯示，SLC4A1基因內(nèi)含子剪切位點(diǎn)50處缺失G等位基因，導(dǎo)致丙酮酸激酶活性降低，從而造成紅細(xì)胞ATP含量減少[19]。SLC4A1基因突變可加重HS患者血管外溶血傾向性。通過對HS患兒進(jìn)行基因測序發(fā)現(xiàn)，SLC4A1基因14號(hào)外顯子1885-1888處發(fā)生CCGG重復(fù)雜合子突變，其直接導(dǎo)致移碼突變，進(jìn)而促使其成為不穩(wěn)定蛋白，并喪失正常功能[20]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，HS患兒發(fā)生新型雜合子突變并存在SLC4A1基因13號(hào)外顯子單核苷酸GAG→AAG(Glu508Lys)突變，其父母不是HS患者且均不存在此突變[21]，分析可能是生殖細(xì)胞減數(shù)分裂末期產(chǎn)生的新型突變，其中Glu508Lys位于帶3蛋白的跨膜區(qū)，這可能導(dǎo)致患兒帶3蛋白功能發(fā)生改變。

SLC4A1等位基因的突變形式具有多樣性，HS常見致病原因?yàn)镾LC4A1雜合突變，其主要發(fā)生在帶3蛋白胞質(zhì)和跨膜區(qū)，而SLC4A1基因雜合突變促使帶3蛋白減少20%～30%[22]。同一家族中SLC4A1基因雜合突變交叉互換后，各家族成員間可能存在不同表現(xiàn)形式[22]。SLC4A1基因編碼的帶3蛋白Coimbra突變屬于純合突變。有調(diào)查顯示，1例HS患兒母親前兩胎均于宮內(nèi)早期死亡，隨后跟蹤調(diào)查患兒母親第3次孕期，抽取懷孕時(shí)患兒心包積液及腹水進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，患兒紅細(xì)胞呈多樣性且脆性極高，探究其原因發(fā)現(xiàn)，SLC4A1基因純合突變導(dǎo)致帶3蛋白缺失，進(jìn)而促使上述現(xiàn)象發(fā)生[23]。以上研究表明，無論SLC4A1基因發(fā)生雜合突變還是純合突變均可引發(fā)帶3蛋白缺失，進(jìn)而促使紅細(xì)胞變形，導(dǎo)致HS發(fā)生。

2.2ANK1基因

2.2.1ANK1基因及其編碼錨蛋白 ANK1基因位于人染色體8p11.2，主要在紅細(xì)胞膜中表達(dá)，并連接陰離子通道和收縮蛋白等。ANK1編碼基因序列中5′端215 bp是具有啟動(dòng)子活性的基因片段，并可激活紅細(xì)胞錨蛋白，具有一定的特異性[24]。ANK1基因可編碼錨蛋白，而錨蛋白62 000結(jié)構(gòu)域含有收縮蛋白結(jié)合肽，其能夠與β-收縮蛋白磷酸化后的錨蛋白上的位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而維持紅細(xì)胞形態(tài)，55 000結(jié)構(gòu)域能調(diào)節(jié)帶3蛋白的功能，若錨蛋白合成減少導(dǎo)致膜上的錨蛋白組裝及異常組裝錨蛋白生成量減少，錨蛋白缺失可減弱成膜骨架與脂質(zhì)雙分子層間垂直方向的相互作用，進(jìn)而降低脂質(zhì)雙分子層穩(wěn)定性，其中脂質(zhì)還可變?yōu)槟遗荻鴣G失，進(jìn)而減少紅細(xì)胞膜表面積，最終導(dǎo)致紅細(xì)胞變?yōu)榍蛐蝃25]。以上提示錨蛋白與帶3蛋白可相互作用，并在紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)維持中發(fā)揮重要作用。由此可知，在錨蛋白合并收縮蛋白缺陷型HS中，錨蛋白缺陷是主要病因，究其主要原因?yàn)锳NK1基因突變引發(fā)錨蛋白缺陷，進(jìn)而造成膜收縮蛋白缺陷，錨蛋白與帶3蛋白無法正常連接導(dǎo)致收縮蛋白丟失。

2.2.2ANK1基因突變與HS ANK1基因突變引發(fā)的HS主要為顯性遺傳，突變類型主要為無義突變、移碼突變及剪接突變，其中無義突變可降解信使RNA，進(jìn)而增加錨蛋白轉(zhuǎn)錄的不穩(wěn)定性。在部分無義突變導(dǎo)致的HS患兒中，正常等位基因異常高表達(dá)時(shí)可代償性彌補(bǔ)錨蛋白缺陷，從而影響HS的嚴(yán)重程度[26]。臨床數(shù)據(jù)顯示，HS顯性遺傳患者中，錨蛋白合并收縮蛋白缺陷者病情較輕；在HS隱性遺傳者中，錨蛋白合并收縮蛋白缺陷者病情較為嚴(yán)重，甚至危及生命[27]。HS相關(guān)ANK1基因突變體還包括Marburg等移碼突變錨蛋白[28]。有研究指出，錨蛋白缺陷的隱性HS患兒中ANK1基因啟動(dòng)子序列存在明顯變化，啟動(dòng)子發(fā)生突變致使轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)破壞，從而導(dǎo)致錨蛋白合成減少，此外ANK1基因啟動(dòng)子突變主要包括108T→C、153G→A等[29]。無論是常染色體顯性遺傳還是隱性遺傳，ANK1基因突變可降低錨蛋白的合成，進(jìn)而影響HS的發(fā)生及發(fā)展。

研究顯示，HS患者ANK1基因16號(hào)內(nèi)含子中發(fā)生G→A突變，引發(fā)外顯子上游序列改變，進(jìn)而產(chǎn)生新型受體剪接位點(diǎn)，而新型突變型錨蛋白Ankara與ANK1基因異常剪接密切相關(guān)[30]。ANK1基因新生突變常出現(xiàn)在母體生殖細(xì)胞中，研究表明，HS患兒體內(nèi)出現(xiàn)ANK1基因新型雜合子無義突變，ANK1基因1號(hào)外顯子單核苷酸發(fā)生G→T突變，而患兒父母均不存在此突變，其可能是在生殖細(xì)胞前體分化過程中形成的新生突變，患兒發(fā)生嚴(yán)重溶血及貧血[31]。研究表明，ANK1基因33號(hào)外顯子L1340p T→C突變與特定HS類型有關(guān)，經(jīng)研究證實(shí)該位點(diǎn)基因突變?yōu)樵摶純喊l(fā)病的分子基礎(chǔ)[32]。研究發(fā)現(xiàn)，ANK1基因c.399位點(diǎn)T→G突變可能是兒童HS的致病基因[26]。目前關(guān)于HS相關(guān)基因的研究相對較少，ANK1基因突變與HS發(fā)病機(jī)制的關(guān)系及其具體作用機(jī)制可作為研究重點(diǎn)，為臨床遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷提供參考。

2.3HS其他相關(guān)基因 HS相關(guān)基因還包括EPB42、SPTB、SPTA1，其中EPB42基因位于人染色體15q15～q21，編碼的4.2蛋白含721個(gè)氨基酸，并可與錨蛋白、帶3蛋白結(jié)合，與細(xì)胞膜內(nèi)表面相連接，且較為穩(wěn)定，同時(shí)還與膜骨架網(wǎng)架連接，是脂質(zhì)雙分子層與膜骨架之間必不可少的紐帶之一[13]。目前研究發(fā)現(xiàn)，EPB42基因存在兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性，即c.329位點(diǎn)C→T和c.2997位點(diǎn)G→A，經(jīng)檢測證實(shí)患兒母親也存在c.329位點(diǎn)C→T突變[33]。一項(xiàng)韓國的家庭病例報(bào)道顯示，母親患有HS，其第三個(gè)兒子及其兩個(gè)孫子也患有HS，基因檢測發(fā)現(xiàn)，SPTB基因新型無義突變是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的根本原因[34]。關(guān)于HS的其他相關(guān)基因及其是否存在HS致病基因突變均需進(jìn)行多方面驗(yàn)證，根據(jù)臨床表型及基因遺傳方式確定其中具體關(guān)系。

3 HS診斷

HS診斷主要分為典型HS診斷與非典型HS診斷，其中典型HS診斷主要依據(jù)外周血涂片，濃染細(xì)胞增加較球形紅細(xì)胞增加較多是HS診斷金標(biāo)準(zhǔn)之一[35]。紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)、酸化甘油溶解試驗(yàn)易受多種因素影響而降低了診斷效能。由于非典型HS患兒臨床表現(xiàn)輕微甚至無癥狀，因而血涂片不能有效診斷，伊紅-5′-馬來酰亞胺集合試驗(yàn)可有效診斷，且具有較高的靈敏度和特異性，其主要采用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度以判斷是否患有HS，伊紅-5′-馬來酰亞胺集合試驗(yàn)還可用于診斷遺傳性熱異形細(xì)胞增多癥和遺傳性口形紅細(xì)胞增多癥，新生兒未能有效獲得病理診斷時(shí)不可否定HS的診斷，需在6月齡后進(jìn)行相關(guān)檢查[36]。

實(shí)驗(yàn)室檢測HS時(shí)還可采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測α/β血影蛋白、錨蛋白、帶3蛋白及帶4.2蛋白等的相對表達(dá)量，但檢測結(jié)果準(zhǔn)確性較低，同時(shí)帶3蛋白及帶4.2蛋白降低又可影響α/β血影蛋白、錨蛋白電泳條帶含量[13]。對分子生物學(xué)基因的研究有助于提高HS患兒的診斷率?；诩韧芯浚F(xiàn)代研究采取膜蛋白基因突變分析鑒定基因突變，此方法可有效辨別原發(fā)或繼發(fā)基因缺陷甚至新生突變，采用限制性片段長度多態(tài)性連鎖分析等分子生物技術(shù)可確定HS疾病進(jìn)展與某個(gè)基因的關(guān)聯(lián)性，進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)、聚合酶鏈反應(yīng)一單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析等方法可鑒定膜蛋白基因突變位點(diǎn)，變性高效液相色譜分析可直接檢測出單核苷酸變異，其具有靈敏度高、效率高等優(yōu)點(diǎn)，但膜蛋白基因突變分析技術(shù)耗時(shí)且費(fèi)用較高，因而尚未普及應(yīng)用。

4 小 結(jié)

HS作為遺傳性紅細(xì)胞膜缺陷病，探尋診斷HS的決定性指標(biāo)對提高診斷準(zhǔn)確率及治療效果均具有重要意義。分子生物學(xué)指標(biāo)可用于HS的診斷，其致病相關(guān)基因主要有SLC4A1、ANK1、EPB42、SPTB、SPTA1，其中SLC4A1、ANK1基因突變與HS發(fā)生最為緊密，由于不同種族或地區(qū)HS致病基因及膜蛋白缺陷類型存在明顯差異，因而需進(jìn)一步探索并建立適合本地區(qū)HS患兒紅細(xì)胞膜蛋白分析及基因診斷的方法，以期為HS診療及優(yōu)生優(yōu)育的產(chǎn)前診斷提供支撐依據(jù)。