延 永，李玉萌，張亦琳，李 倩

(1.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000；2.商洛學(xué)院 健康管理學(xué)院，陜西 商洛 726000)

面膜作為清潔、保養(yǎng)和營養(yǎng)面部肌膚的化妝品，得到越來越多人的青睞[1]。美容面膜在剛興起的時候，人們一般采用人工合成的化學(xué)制品作為主要添加成份，但隨著科學(xué)的發(fā)展，人們逐步認識到長期使用化學(xué)藥品所存在的安全問題[2]。與化學(xué)藥品類面膜相比，天然藥物面膜不僅具有自然無毒、副作用小和安全性高等特點，而且還具備眾多生理方面的功效[3]?？喽〔?Ilex kudingcha C. J. Tseng)是冬青科植物大葉冬青的葉，主要分布在華南地區(qū)和西南地區(qū)等地，在陜西陜南地區(qū)也有廣泛的種植，苦丁茶一直是中國一種傳統(tǒng)的純天然保健飲料佳品，茶中含有苦丁皂甙[4]、多酚類、黃酮類、咖啡堿[5]、三萜類[6]等多種功能成分，具有清熱消暑、降壓減肥、抑癌防癌、抗衰老、活血脈等多種功效[7]。若能將冬青苦丁茶進行深加工，提取有效活性成分，添加到面膜中，不僅增加產(chǎn)品附加值，還能豐富面膜類型，具有十分重要的經(jīng)濟價值和現(xiàn)實意義。

本課題基于大量調(diào)研，以苦丁茶中富含的活性物質(zhì)黃酮類化合物[8]的提取物為主要有效成分，通過優(yōu)化工藝，希望開發(fā)出具有抗氧化、抗衰老、抑菌、保濕活性等功效的功能性面膜，并對其性質(zhì)進行研究。既能促進苦丁茶資源的開發(fā)，又能促進地方經(jīng)濟的繁榮，豐富了苦丁茶的深加工產(chǎn)品種類，增加天然藥物面膜市場的產(chǎn)品類別，為廣大消費者研制出更人性化，綠色化，大眾化的保養(yǎng)品面膜，具有重要的社會經(jīng)濟價值和生態(tài)價值。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

蘆丁標品(中國藥品生物制品鑒定所)，試驗中涉及到其他試劑均為市售AR。

微型粉碎機(FW80 天津泰斯特儀器有限公司)；超聲清洗儀(KH5200E 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；紫外-可見分光光度計(UV1800 日本島津)；高速離心機(TGL-16G 上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦丁茶中黃酮的提取 稱取粉碎過60目的苦丁茶粉末2.0 g，加入60%的乙醇80 mL，置于90℃恒溫水浴鍋中回流提取2.5 h。待體系冷卻后，過濾，濾餅用60%的乙醇洗滌(10 mL*3次)，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶液中的乙醇，將剩余物用蒸餾水定容至25 mL，得到苦丁茶總黃酮提取液。

1.2.2 樣品中總黃酮含量的測定 精確稱取200.0 mg蘆丁標準品，用30%乙醇溶解并定容至100 mL，得到標準液。移取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL標準液于7支25 mL容量瓶中，加入濃度為5% NaNO2溶液0.7 mL，靜置6 min。加入濃度為10% Al(NO3)3溶液0.7 mL，靜置6 min。最后，加入濃度為4% NaOH溶液10.0 mL，混勻，用30%乙醇定容至刻度線，靜置15 min后于波長510 nm處測定溶液吸光度值，以0.0 mL為空白對照，測得不同標準溶液濃度的吸光度，繪制標準曲線得到回歸方程。

移取1.2.1中得到溶液1.0 mL于100 mL容量瓶中，加入5% NaNO2溶液2.8 mL，靜置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液2.8 mL，上下震蕩混勻，靜置6 min，再加入4% NaOH溶液40.0 mL，上下震蕩混勻，用30%乙醇定容至刻度線，15 min后于510 nm波長處測定溶液吸光度。根據(jù)回歸方程計算提取的黃酮濃度，再計算黃酮得率Y(%)。計算公式如下：

(公式1)

式中：Y為黃酮的提取率(%)；C為總黃酮濃度(mg·mL-1)；N為稀釋倍數(shù)；V為取樣量(mL)；W為粉末質(zhì)量(mg)。

1.2.3 面膜的制備工藝優(yōu)化 準確稱取適量漢生膠于少量水中，置于80～85℃恒溫水浴鍋中使其充分溶解，待其溶解至澄清透明狀，加入羧甲基纖維素鈉，攪拌使其充分溶解，當混合液溫度降至40℃左右，依次加入甘油，丙二醇，并充分攪拌，最后加入黃酮提取物，尼泊金甲酯，以及少量香精，充分攪拌使其混合均勻，即得到苦丁茶面膜液。

甘油、羧甲基纖維素鈉和丙二醇具有較好的保濕功能，常在面膜的制備工藝中加入這三種物質(zhì)保證其保濕性能。筆者研究在保障面膜性狀的前提下，以甘油、羧甲基纖維素鈉和丙二醇的加入量為考慮因素，采用正交試驗L9(43)，考查其在苦丁出面膜中的保濕作用，篩選出苦丁茶面膜最佳工藝配方(以所得面膜的保濕性為評價標準)。因素與水平表如下表3所示。

表1 因素與水平

a：50g 面膜中的含量。

1.2.4 保濕性實驗 采用醫(yī)用透氣膠布粘在小型玻璃板的裝置模擬人體皮膚，其中膠帶為0.9 cm*5.5 cm。稱取適量面膜均勻涂布于裝置表面，將該裝置放在有CaCl2飽和溶液的干燥器中，溫度保持在25℃，24 h后稱量，計算保濕率W(%)。

(公式2)

式中：M1為放置前樣品質(zhì)量；M2為放置后樣品質(zhì)量。

1.2.5 DPPH自由基清除率的測定 DPPH*是一種穩(wěn)定的自由基，在有機溶劑中呈紫色，并于517 nm處有強吸收。當有自由基清除劑存在時，DPPH*的單電子被分配而使其顏色變淺，在最大吸收波長處的吸光度變小，利用比色法可以檢測自由基清除情況，從而評價樣品的抗氧化能力[9]。

表2 抗氧化活性檢測加樣表

稱取2,2- 二苯代苦味?；?2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)標準品20.00 mg，無水乙醇定容至500.0 mL，得質(zhì)量濃度0.04 mg·mL-1溶液。按表2在10 mL比色管中加入試劑，混勻，在室溫下避光反應(yīng)30 min，于分光光度計517 nm處測定各自吸光度(分別以4.0 mL蒸餾水+1.0 mL無水乙醇為空白)。DPPH自由基在波長517 nm處有強吸收峰，當有抗氧化活性物質(zhì)存在時，DPPH自由基的電子與之配對致使吸收消褪，消褪程度與活性物質(zhì)接受的電子數(shù)量相對應(yīng)，據(jù)此依下式計算DPPH自由基清除率：

(公式3)

式中：Ai為加入樣品的DPPH的吸光度，Aj為樣品本身的吸光度，AO為DPPH的吸光度。

1.2.6 抑菌測試 培養(yǎng)基的配制：將10.0 g蛋白胨，5.0 g NaCl放入燒杯中，加水1 000 mL煮沸，加入5.0 g牛肉膏，融化后，分裝于錐形瓶包裝好之后，高壓滅菌(121 ℃)20 min，取出后，置于80 ℃水浴，備用。

采用最小抑菌濃度法(MIC)[10]，取96孔板，每一孔添加稀釋后的培養(yǎng)基100 μL，然后向第一孔添加100 μ面膜原液，混均后吸取100 μL至第二孔中，同法依次稀釋至第十一孔，第十二孔為不加抗菌皂液的對照。將稀釋好的菌液在每孔中加入100 μL，此時每孔中菌液終濃度為5×105CFU·mL-1。將96孔板蓋上蓋子，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育16～20 h。在酶標儀中設(shè)置程序，將96板放入酶標儀中，掃描各孔600 nm處的比濁度，得出無細菌生長的孔，換算濃度，即為MIC值[11]。

1.2.7 苦丁茶面膜的性能檢測 主要有:

(1)性狀與細膩度。取苦丁茶面膜10.0 g，置于試管中，觀察有無明顯顆粒析出。取苦丁茶面膜1.0 g均勻涂抹于手背，用眼睛、手等感官指標評價其細膩度。

(2)酸堿度。取苦丁茶面膜2.5 g，加入50 mL去離子水，攪拌，使其混合均勻，置于85～90℃恒溫水浴鍋中，使其微沸，冷卻至室溫，用pH計測定混懸液酸堿度。

(3)耐熱實驗。稱取六份5.0 g苦丁茶面膜液分別置于10 mL試管中，編號為1～6，用保鮮膜密封，分別置于溫度梯度為25，30，35，40，45，50℃的恒溫水浴鍋中，放置10 h，觀察面膜性狀有無明顯變化。

(4)耐寒實驗。稱取六份5.0 g苦丁茶面膜液分別置于10 mL試管中，編號為1-6，用保鮮膜密封，分別置于溫度梯度為0，-5，-10，-15，-20，-25℃的恒定溫度的冰箱中。放置10 h，觀察其外觀性狀的變化。

(5)離心實驗。在室溫下，取苦丁茶面膜置于4 mL離心管中，5組于離心機中，分別以2 000，3 000，4 000，5 000，6 000 rmp離心15 min，觀察是否有分層現(xiàn)象。

(6)刺激性實驗。邀請24名皮膚健康的在校大學(xué)生，男生、女生各半，分別將0.5 g面膜均

勻涂抹于左前臂柔軟的皮膚表面，右臂同一部位不涂做空白對照，24 h后觀察兩處的皮膚現(xiàn)象，連續(xù)測試一周。

2 結(jié)果與討論

2.1 苦丁茶中黃酮含量的測定

以吸光度為縱坐標，蘆丁濃度為橫坐標，建立蘆丁標品標準曲線，如圖1得出回歸方程；y=6.588 7x+0.065 6，R2=0.994 9。式中y為吸光度，x為蘆丁濃度(mg·mL-1)；

圖1 蘆丁標準曲線

由1.1.2知在510 nm處苦丁茶中黃酮提取物吸光度為0.943 5，代入回歸方程中得提取物濃度為0.133 2 mg·mL-1?？喽〔杩傸S酮提取液的濃度為13.32 mg·mL-1，由公式1可得黃酮得率為16.65%。

表3 正交試驗結(jié)果

2.2 苦丁茶面膜工藝優(yōu)化

2.2.1 苦丁茶總黃酮提取物加入量的確定 通過前期研究，苦丁茶總黃酮提取物具有良好的抗氧化活性，但由于提取物是混合物，而且在面膜中的溶解度有限，當加入的提取物過多時，面膜中有明顯不溶物懸浮，根據(jù)面膜的外觀需要，選擇加入面膜的苦丁茶總黃酮提取液為5 mL(苦丁茶總黃酮提取液的密度近似等于1 g·mL-1)適宜，換算成苦丁茶總黃酮含量為66.6 mg，配制面膜液體積為48.0 mL，面膜液中苦丁茶總黃酮含量為1.39 mg·mL-1。

2.2.2 配方優(yōu)化 通過正交實驗對面膜的處方進行優(yōu)化，結(jié)果如表3，最佳組合為A3B3C1，因此，苦丁茶面膜理論最佳配方如下：甘油7.5 g，羧甲基纖維素鈉0.5 g，丙二醇0.5 g，漢生膠0.05 g，尼泊金甲酯0.01 g，苦丁茶黃酮提取物水溶液5.0 mL (總黃酮含量13.32 mg·mL-1)，香精2～3滴，加去離子水至50 g。方差分析可知：對面膜保濕性影響最顯著的是甘油，其次是羧甲基纖維素鈉，影響最小的是丙二醇。經(jīng)驗證，在最佳配方下苦丁茶面膜的保濕性達到89±1%。

表4 方差分析

表5 DPPH自由基清除作用

2.3 DPPH自由基的清除作用

由圖2可知，面膜濃度為0.1 mg·mL-1時，對DPPH自由基的清除率達到51.66%，當濃度提高為0.5 mg·mL-1時，DPPH自由基的清除率為達到74.8%，結(jié)果表明面膜對DPPH自由基有良好的清除作用。

2.4 苦丁茶黃酮面膜抑菌測試

圖2 面膜對DPPH自由基的清除作用

細菌名稱面膜稀釋倍數(shù)a5122561286432168421苦丁茶總黃酮MIC/(mg·mL-1)b金黃色葡萄球菌---------+5.02大腸桿菌---------+10.55肺炎克雷伯菌----------20.09傷寒桿菌----------20.09黑曲霉----------40.18

注：a:“+”代表有抑菌現(xiàn)象；“—”代表無抑菌現(xiàn)象。b:采用同樣方法測得。

如表7所示，苦丁茶面膜原液對大腸桿菌和金黃色葡糖球菌有抑菌效果，相當于苦丁茶總黃酮的MIC均為1.39 mg·mL-1，低于苦丁茶總黃酮提取物的MIC(5.02～10.55 mg·mL-1)，造成這種結(jié)果的原因可能是面膜液中其他添加成分對這兩種測試菌有抑制效果。由于面膜液中，苦丁茶總黃酮的含量有限，僅為1.39 mg·mL-1，面膜并沒有對肺炎克雷伯菌、傷寒桿菌和黑曲霉表現(xiàn)出抑菌活性。

2.5 苦丁茶面膜得性能評價

所制得的苦丁茶面膜為淡黃色粘稠透亮液體，氣味清香，分布均勻，涂抹于手上無顆粒感，細膩柔滑，無刺激性，性狀穩(wěn)定。具體如表7。

表7 苦丁茶面膜理化性質(zhì)

3 結(jié)論

筆者以苦丁茶為原料，研究其總黃酮提取物為主要有效成分的多功能面膜工藝。

(1)乙醇體積分數(shù)為60%，苦丁茶與乙醇的添加比為1∶40，90℃回流2.5 h，苦丁茶總黃酮的提取率為16.65%。

(2)正交試驗表明，苦丁茶面膜的最佳工藝配方：甘油7.5 g，羧甲基纖維素鈉0.5 g，丙二醇0.5 g，漢生膠0.05 g，尼泊金甲酯0.01 g，苦丁茶總黃酮提取物水溶液5.0 mL (總黃酮含量13.32 mg·mL-1)，香精2～3滴，加去離子水至50 g。

(3)經(jīng)驗證該面膜保濕率達到89±1%；面膜液濃度為0.5mg·mL-1時，對DPPH自由基的清除率達到74.8%。對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有良好的抑制作用。

(4)成品苦丁茶面膜為淡黃色粘稠透亮液體，氣味芳香、質(zhì)地均勻、pH=7.1，無刺激性、性質(zhì)穩(wěn)定，符合QB/T 2872-2017面膜行業(yè)的標準。