蔡虎志 吳治諺 徐則林△ 指導 陳新宇

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2．廣東省江門市五邑中醫(yī)院，廣東 江門529000）

慢性心力衰竭（CHF）是心功能障礙的一種疾病表現(xiàn)，可由多種心血管疾病慢性進展而來，CHF在有基礎(chǔ)疾病的中老年人群中發(fā)病率較高，且其遠期預后較差［1-3］。課題組前期研究證實了MAPK信號通路中的主要亞族P38MAPK通路蛋白的磷酸化表達與CHF病情進展呈密切的正相關(guān)［4］，且溫陽振衰顆粒可顯著下調(diào)p38MAPK蛋白磷酸化的表達。作為重要的p38MAPK上游非編碼調(diào)控基因，LncRNA BIC可通過miR-155/MAP3K10途徑調(diào)控MKK-3及MKK-6，從而影響p38MAPK介導的系列生物活性反應［5-6］。溫陽振衰顆粒是否通過調(diào)控LncRNA BIC進而影響p38MAPK介導的心肌細胞損傷過程而起到抑制心肌細胞受損的效果，為驗證溫陽振衰顆粒的治療效果和作用機制而設(shè)計了本實驗研究?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 鹽酸阿霉素由深圳萬樂藥業(yè)有限公司提供（H44024359），SYBR Green PCR 試劑盒購自上海斯信生物科技有限公司（KM4101），溫陽振衰顆粒（由附子、干姜、甘草、紅參、茯苓、五味子組成，8 g/包）由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供（201705）。

1.2 心肌細胞株傳代培養(yǎng) 使用H9C2心肌細胞（中喬新舟，ZQ0102），將心肌細胞放入10%FBS含氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基中，細胞增殖到一定數(shù)量后，使用0.25%胰蛋白酶配制單細胞溶液，其余細胞溶液經(jīng)過稀釋后統(tǒng)計細胞數(shù)量，并根據(jù)現(xiàn)有濃度進行稀釋調(diào)配，直至合適種板培養(yǎng)濃度。

1.3 含藥血清制備 健康SPF級大鼠8只，雌雄各半，體質(zhì)量200～220 g，由湖南斯萊表達實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（湘）2014-002。在自由飲食、光/暗周期為 12 h/12 h（光照時間 6∶00～18∶00）保持噪音（40±10） db，溫度（20±3） ℃條件下飼養(yǎng)。 將溫陽振衰顆粒溶于蒸餾水中并按照1.44 g/（kg·d）的劑量進行稀釋，并將稀釋液給大鼠灌胃［7］，每日分2次喂服給大鼠。給藥1周后從大鼠腹主動脈取血并進行離心、過濾和分裝操作，制備為與做實驗分組相同數(shù)量的含藥血清溶液，并冷藏保存，使用時配置為10%濃度進行實驗。

1.4 心肌細胞損傷誘導 根據(jù)分組要求，加入阿霉素（ADR），標記為ADR組。培養(yǎng)液中加入ADR的濃度為2.67 μmol/L，培養(yǎng)時間同其他各組［8］。

1.5 分組方法 共使用4塊6孔板按4×103進行接種，每組使用一組6孔板，并對4塊6孔板進行編號，分別對應正常對照組、正常加含藥血清組、ADR組、ADR加含藥血清組，共培養(yǎng)44 h。

1.6 檢測指標 1）心肌細胞形態(tài)學觀察：取培養(yǎng)后各組心肌細胞，采用倒置顯微鏡觀察各組心肌細胞形態(tài)學變化。2）心肌細胞存活率檢測：實驗完成后對各組細胞溶液進行處理，每組中加入20 μL/mL的MTT溶液以檢測細胞存活情況，具體過程為吸取經(jīng)過MTT培養(yǎng)后的細胞上清液，加入 DMSO 溶液（Sigma，D2650），將培養(yǎng)板在搖床上低速振蕩10 min，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗在490 nm出檢測各組細胞的吸光值。3）心肌細胞LncRNA BIC基因表達檢測：取各組心肌細胞，根據(jù)NCBI基因庫中LncRNA BIC基因序列進行引物設(shè)計，Trizol一步法提取總RNA，在-80℃環(huán)境中對提取物進行冷藏。并根據(jù)所購PCR試劑盒說明書進行熒光分析，PCR過程中使用的引物情況，見表1。擴增條件：94 ℃、5 s，60 ℃、60 s，72 ℃、2 s，42個循環(huán)。 擴增后72℃延伸10 min，反應結(jié)束后建立RT-PCR溶解曲線，以06為內(nèi)參，校正每個樣品的ct值，表達差異以2-ΔΔCT表示。

表1 PCR過程中使用的引入情況

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示。數(shù)據(jù)資料進行正態(tài)分析，符合正態(tài)分布的資料錄入進行進一步檢驗，4組組間比較采用單因素方差分析。采用LSD法、Tamhane′T2法進行P值計算。計數(shù)資料用例數(shù)和百分比（%）描述，組間或組內(nèi)比較采用χ2檢驗，等級資料選用Ridit分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌細胞形態(tài)學觀察 見圖1。倒置顯微鏡下可見正常對照組、正常加含藥血清組心肌細胞形態(tài)、胞質(zhì)、間質(zhì)及橫紋均為正常；ADR組心肌細胞出現(xiàn)肌纖維的溶解，橫紋模糊，及胞漿空包變性，且表現(xiàn)出不同程度的炎癥細胞浸潤和間質(zhì)水腫。ADR加含藥血清組的心肌細胞較ADR組，其肌纖維溶解、恒溫模糊、胞漿空泡變性、炎癥細胞浸潤、間質(zhì)水腫等情況均有所改善。

圖1 各組心肌細胞形態(tài)學觀察（100倍）

2.2 各組心肌細胞存活率比較 見表2。正常對照組、正常加含藥血清組的細胞存活率相當（P＞0.05）；ADR組、ADR加含藥血清組與正常對照組比較，其細胞存活率均明顯下降 （P＜0.05）；ADR加含藥血清組與ADR組比較，其細胞存活率有所上升（P＜0.05）。

2.3 各組心肌細胞LncRNA BIC的表達比較 見表3，圖2。正常加含藥血清組與正常組比較，LncRNA BIC表達明顯升高 （P＜0.05）；ADR組與正常組比較，LncRNA BIC表達明顯降低（P＜0.05）；ADR加含藥血清組與ADR組比較，LncRNA BIC表達升高（P＜0.05）。

表2 各組心肌細胞存活率比較（%，x±s）

表3 各組心肌細胞LncRNA BIC的表達比較（%，x±s）

圖2 各組心肌細胞LncRNA BIC的表達

3 討 論

p38MAPK作為機體應激的主要細胞信號傳導通路，可以被組織局部神經(jīng)分泌激素ET、AngⅡ及細胞因子等刺激因素激活，加速心肌細胞的損傷［9-10］?；罨蟮膒38MAPK可以激活多種轉(zhuǎn)錄因子，使心肌細胞損傷性基因的表達上調(diào)以及細胞應激保護性基因的表達下調(diào)。P38MAPK的基因表達和活性增強是引起心肌細胞損傷和進一步加劇心肌功能障礙的重要影響因素［11-12］。LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的RNA，該類長鏈RNA不具有蛋白編碼功能，但可以再轉(zhuǎn)錄和遺傳過程中對編碼基因進行調(diào)控，從而改變后者的水平［13］，作為P38MAPK的上游調(diào)控基因，LncRNA BIC雖然自身不能直接編碼蛋白質(zhì)，但可通過miR-155/MAP3K10途徑調(diào)控MKK-3及MKK-6，進而直接對P38MAPK的活化產(chǎn)生影響，但LncRNA BIC在慢性心衰或心肌細胞損傷模型中的表達及作用目前罕有文獻報道。

溫陽振衰顆粒為湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院自制中成藥，由筆者所在醫(yī)院陳新宇教授提供配方，在研制成為顆粒劑前其基本組方的湯劑在湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院已經(jīng)應用數(shù)年，且療效肯定。該方由附子、干姜、甘草、紅參等多味中藥組方而成，其中附子、干姜分補中焦、下焦陽氣，對陽氣虛衰、陰寒內(nèi)積的病癥療效甚佳［14-15］。炙甘草進一步提升溫陽之性，同時又可調(diào)和諸藥、補虛和中［16］。根據(jù)筆者應用經(jīng)驗，該藥在治療多種類型的心血管疾病中均具有療效，尤其是各類辨證為心陽不振而表現(xiàn)出的心功能不全癥狀，同時對于陽虛水泛和水飲凌心而出現(xiàn)的全身或局部水腫也有很好的治療效果。溫陽振衰顆粒中以四逆湯為底方，同時加入多味溫補中藥提升其溫陽之功效，臨床應用時保證一定劑量的給藥還具有回陽救逆的急救功效。課題組以往研究已經(jīng)證實溫陽振衰顆粒能夠有效改善ADR誘導的心肌損傷動物的心功能，緩解心衰癥狀表現(xiàn)，同時檢測到了p38MAPK表達的下降和水平的降低。本實驗研究通過分組對比方式進行對照研究，在阿霉素誘導的心肌細胞損傷模型中，LncRNA BIC的表達明顯下降，心肌細胞的存活率也相應較低。在使用溫陽振衰顆粒含藥血清干預后，LncRNA BIC的表達顯著上調(diào)，心肌細胞的存活率也相應升高。上述實驗結(jié)果說明，LncRNA BIC的高表達有利于心肌細胞的存活，溫陽振衰顆粒有可能通過上調(diào)心肌細胞中LncRNA BIC的表達介導了心肌細胞損傷的保護作用，這可能是其治療慢性心衰的重要機制之一。心肌細胞中的LncRNA BIC可能為研發(fā)具有全新靶點的心衰治療藥物提供新的突破點，但藥物的療效機制和對疾病的治療調(diào)控仍是需要深入研究的關(guān)鍵點所在。