杜嬌，姜淑喆，未建華，申玉龍，倪金鳳

?

白蟻及其共生菌來(lái)源的4種木質(zhì)纖維素酶的共表達(dá)

杜嬌，姜淑喆，未建華，申玉龍，倪金鳳

山東大學(xué) 微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266200

杜嬌, 姜淑喆, 未建華, 等. 白蟻及其共生菌來(lái)源的4種木質(zhì)纖維素酶的共表達(dá).生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(2): 244–253.Du J, Jiang SZ, Wei JH, et al. Co-expression of lignocellulase from termite and their endosymbionts. Chin J Biotech, 2019, 35(2): 244–253.

天然的木質(zhì)纖維素材料含有纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等成分。降解天然木質(zhì)纖維素底物時(shí)，需要木質(zhì)纖維素酶共同作用。近年在木質(zhì)纖維素酶的相互協(xié)同作用方面的研究引起人們的關(guān)注，成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)，文中使用兩個(gè)不同的共表達(dá)載體pETDuet-1和pRSFDuet-1，在大腸桿菌中共表達(dá)了白蟻及其腸道微生物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶、內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶、漆酶和木聚糖酶這4種木質(zhì)纖維素酶，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析得到了與理論值一致的蛋白條帶，同時(shí)經(jīng)過(guò)酶活驗(yàn)證，這4種蛋白都具有酶活性。以磷酸處理的微晶纖維素 (PASC) 為底物，測(cè)定了共表達(dá)酶粗酶液與單獨(dú)表達(dá)酶混合液的協(xié)同作用因子，從還原糖的產(chǎn)量上經(jīng)計(jì)算共表達(dá)的粗酶液比單獨(dú)表達(dá)酶的混合液對(duì)PASC的降解協(xié)同作用提高44%；以濾紙和磷酸處理的玉米芯為底物，測(cè)定降解協(xié)同作用，分別提高了34%和20%。結(jié)果表明，共表達(dá)酶的降解效率要高于混合的單組分酶液降解效率的總和。

白蟻，木質(zhì)纖維素酶，共表達(dá)，協(xié)同作用

木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生生物質(zhì)[1]。天然的木質(zhì)纖維素材料含有纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等[2]。纖維素在木質(zhì)纖維素中為最簡(jiǎn)單的成分，大量的葡萄糖以β-1,4糖苷鍵連接形成難以被水解的類似晶體的結(jié)構(gòu)[3]。半纖維素和木質(zhì)素包裹在纖維素的外面，形成了一種天然屏障。這層天然屏障在保護(hù)植物的同時(shí)，也使得人工進(jìn)行生物降解轉(zhuǎn)化的效率很低，無(wú)法適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)化的要求。

纖維素降解酶系從功能上劃分，其主要有內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶 (EGs，EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶 (CBHs，EC 3.2.1.91) 和β-葡萄糖苷酶 (BGs，EC 3.2.1.21) 3類[4]。內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶在纖維素鏈內(nèi)部可隨機(jī)水解β-1,4-糖苷鍵，截短長(zhǎng)鏈纖維素分子，率先為外切纖維素酶提供大量的反應(yīng)末端，對(duì)纖維素的酶解至關(guān)重要[5]。外切葡聚糖酶作用于纖維素分子的末端，依次切下纖維二糖或者纖維四糖。β-葡萄糖苷酶主要負(fù)責(zé)將纖維二糖水解成葡萄糖[6]，可以緩解內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的產(chǎn)物抑制效應(yīng)，該酶在纖維素水解為單糖的過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。半纖維素在木質(zhì)纖維素中的含量為20%–30%，其中含量最為豐富的是木聚糖[7]。木聚糖酶是一種可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的多組分復(fù)合酶系[8]，可促使半纖維素降解[9]。木質(zhì)素在木質(zhì)纖維素中的含量為18%–30%[10]。木質(zhì)素的降解主要有3類酶：木質(zhì)素過(guò)氧化物酶 ( Lip，EC 1.11.1.14)、錳過(guò)氧化物酶 (MnPs，EC 1.11.1.13) 和漆酶 (Lac，EC 1.11.1.14)。

自然界中存在一些天然的高效降解木質(zhì)纖維素系統(tǒng)，包括白蟻、牛、褐腐菌、白腐菌和一部分細(xì)菌等，其中白蟻具有食木性特征[11]，有很強(qiáng)的纖維素降解功能，目前認(rèn)為在白蟻木質(zhì)纖維素降解中是雙重纖維素降解機(jī)制——內(nèi)源纖維素酶 (白蟻?zhàn)陨矸置? 和外源纖維素酶 (共生微生物分泌)[12]。白蟻及其腸道微生物來(lái)源的木質(zhì)纖維素酶具有高酶活和良好的耐堿性等特點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中，β-葡萄糖苷酶BGDS5[13]和內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶EG71[14]是我們通過(guò)DNA Shuffling的方法，獲得的高活性的白蟻來(lái)源的β-葡萄糖苷酶和內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶的突變體。漆酶CotA和木聚糖酶XylMb1 分別來(lái)源于黃翅大白蟻后腸中通過(guò)篩選分離得到的高地芽胞桿菌[15]和類芽胞桿菌sp. Mb1[16]這兩株菌。CotA蛋白耐高溫耐堿，有文獻(xiàn)報(bào)道芽胞桿菌的CotA 蛋白是具有高的最適溫度和熱穩(wěn)定性的細(xì)菌漆酶，在工業(yè)上有很大的應(yīng)用前景[17]。XylMb1 木聚糖酶酶活高且具有良好的耐堿性。

近年在木質(zhì)纖維素酶的相互協(xié)同作用方面的研究引起人們的關(guān)注，成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)，因此我們將實(shí)驗(yàn)室自主得到的白蟻及其腸道微生物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶BGDS5、內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶EG71、漆酶CotA和木聚糖酶XylMb1這4種酶在大腸桿菌中進(jìn)行了共表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及儀器

對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷 (pNPG) 購(gòu)自Sigma公司；木聚糖購(gòu)自Carbosynth化學(xué)科技公司；DNA Ladder、限制性內(nèi)切酶、Eazy酶、DNA Ligation Kit均購(gòu)自TaKaRa公司；Cycle-Pure Kit、Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit 購(gòu)自O(shè)MEGA公司；氨芐青霉素和硫酸卡那霉素購(gòu)自Invitrogen公司；異丙基--D-硫代半乳糖苷 (IPTG)購(gòu)買自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；蛋白胨、酵母粉和瓊脂粉購(gòu)自O(shè)XOID公司；Whatman No.1號(hào)濾紙、葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶 (GOD-POD) 試劑盒購(gòu)買自濟(jì)南朋遠(yuǎn)生物公司；其他均購(gòu)買自國(guó)藥公司。

PCR儀 (TaKaRa)；CHB-202 恒溫金屬浴 (杭州博日科技有限公司)；凝膠成像儀 (UVItec公司)；2802H UV/VIS分光光度計(jì) (UNICO)；JY92-II 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) (寧波新芝生物科技有限公司)；HZQ-QX 低溫振蕩培養(yǎng)箱 (黑龍江省東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基參見(jiàn)文獻(xiàn)[18]。若加入氨芐青霉素或硫酸卡那霉素 (終濃度100 μg/mL)，分別成為L(zhǎng)A或LK培養(yǎng)基；若同時(shí)加入兩種抗生素則成為L(zhǎng)AK培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基添加終濃度2%的瓊脂粉。

1.1.3 質(zhì)粒及菌株

文中所使用的.BL21(DE3)、表達(dá)載體pETDuet-1和pRSFDuet-1購(gòu)自TaKaRa。白蟻來(lái)源的β-葡萄糖苷酶突變體BGDS-5和內(nèi)切葡聚糖酶突變體EG71由實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)DNA shuffling的方法獲得；黃翅大白蟻后腸細(xì)菌來(lái)源的木聚糖酶基因XylMb1和漆酶基因CotA均為實(shí)驗(yàn)室保存。pETDuet-1和pRSFDuet-1通用引物以及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有引物由華大基因測(cè)序公司合成。

1.2 構(gòu)建表達(dá)載體

以pQE30-BGDS5為模板，DS5-HⅠ-F和DS5-d Ⅲ-R為引物 (表1)，PCR擴(kuò)增出片段，利用HⅠ和d Ⅲ雙酶切后連接到pETDuet-1的多克隆位點(diǎn)Ⅰ (MCSⅠ，Multiple cloning siteⅠ)；以pQE30-EG71為模板，EG-Ⅰ-F和EG-RⅤ-R為引物 (表1)，PCR擴(kuò)增出片段，利用Ⅰ和RⅤ雙酶切后連接到pETDuet-1-BGDS5的多克隆位點(diǎn)Ⅱ (MCSⅡ，Multiple cloning siteⅡ)，轉(zhuǎn)入.BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，涂布到LA平板上。以pQE30-CotA為模板，CotA-HⅠ-F和CotA-d Ⅲ-R為引物 (表1)，PCR擴(kuò)增出片段，利用HⅠ和d Ⅲ雙酶切后連接到pRSFDuet-1的MCSⅠ；以pQE30-XylMb1為模板，XylMb1-Ⅰ-F和XylMb1-Ⅰ-R為引物（表1），PCR擴(kuò)增出片段，利用Ⅰ和Ⅰ雙酶切后連接到pRSFDuet-1-CotA的MCSⅡ，轉(zhuǎn)入.BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，涂布到LK平板上。挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，并分別命名為Co-BGEG、Co-CotAXyl。分別取上述構(gòu)建成功的質(zhì)粒Co-BGEG和Co-CotAXyl各1 μL，充分混勻后，將混合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到.BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到LAK平板上，篩選陽(yáng)性克隆并驗(yàn)證酶活，將其命名為Co-BECX。

表1 PCR引物序列

Underlines indicate restriction enzyme sites.

1.3 誘導(dǎo)表達(dá)

分別在LA、LK和LAK平板上挑取陽(yáng)性單克隆，接種于5 mL含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。按1%的接種量接種于100 mL相應(yīng)培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)至600為0.6–0.8時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，16 ℃、180 r/min進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)16 h[19]。然后在4 ℃下10 000 r/min離心5 min收集菌體，利用破壁緩沖液 (50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/LNaCl) 洗滌菌體2次，將菌體?20 ℃凍存或立即破壁。向菌體中加入5 mL破壁緩沖液重懸菌體，超聲波破壁 (功率400 W，超聲時(shí)間5 s，間隔時(shí)間5 s，超聲次數(shù)120次)。高速離心收集上清 (12 000 r/min，4 ℃，10 min)，即為粗酶液[20]。使用粗酶液進(jìn)行酶活測(cè)定及SDS-PAGE分析。

1.4 酶活力測(cè)定

1.4.1 Na2CO3方法測(cè)定β-葡萄糖苷酶酶活

以pH 5.5的0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液(SAB buffer)為溶劑配制5 mmol/L的對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷 (pNPG) 作為底物，取200 μL底物與50 μL適當(dāng)稀釋的酶液，充分混合后，37 ℃恒溫條件下反應(yīng)30 min。結(jié)束后加入1 mL 0.6 mol/L的Na2CO3終止反應(yīng)[21]。410測(cè)定吸光值，做3個(gè)平行。以滅活的酶液設(shè)置對(duì)照。1個(gè)酶活單位 (Unit) 定義為：37 ℃、pH 5.5的反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量。

1.4.2 DNS方法測(cè)定內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶和木聚糖酶酶活

以pH 5.5的0.1 mol/L SAB緩沖液為溶劑配制底物。EG酶以1% CMC為底物[22]，木聚糖酶以1%木聚糖作為底物[23]。取200 μL底物與50 μL適當(dāng)稀釋的粗酶液，充分混合后在37 ℃恒溫條件下反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后加100 μL的DNS溶液，沸水浴反應(yīng)10 min，立即置于冰上冷卻，補(bǔ)加蒸餾水650 μL使反應(yīng)體系為1 mL。520測(cè)定吸光值，做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。以滅活的酶液設(shè)置對(duì)照。1個(gè)酶活單位(Unit)定義為：在37 ℃、pH 5.5的反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需要的酶量。

1.4.3 以ABTS為底物測(cè)定漆酶酶活

以pH 5.5的0.1 mol/L SAB buffer為溶劑配制0.5 mmol/L的2,2￠-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽 (ABTS) 作為底物[24]。取適當(dāng)稀釋的50 μL酶液加入到提前在37 ℃中保溫的950 μL的ABTS中，充分混合，37 ℃恒溫條件下反應(yīng)3 min。420測(cè)定吸光值，做3個(gè)平行。以滅活的酶液設(shè)置對(duì)照。1個(gè)酶活單位 (Unit) 定義為：在37 ℃、pH 5.5的反應(yīng)條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol底物所需要的酶量。

1.4.4 濾紙酶活的測(cè)定

使用Whatman 1號(hào)濾紙測(cè)定粗酶液的濾紙酶活[25]。具體測(cè)定方法為：在1.5 mL規(guī)格的Eppendorf (EP)管中加入200 μL SAB Buffer，將10 mg Whatman 1號(hào)濾紙浸入其中，加入50 μL適當(dāng)稀釋的酶液，37 ℃反應(yīng)1 h，離心去除不溶物，加入100 μL DNS煮沸10 min，置于冰上冷卻2 min，加水至1 mL，測(cè)520處的吸光度，做3個(gè)平行。以滅活酶液作為對(duì)照。

1.5 底物處理

1%磷酸水解微晶纖維素 (PASC)[26]：取0.4 g微晶纖維素置于燒杯中，加入蒸餾水1.2 mL，混勻成糊狀物。一邊攪拌一邊緩慢加入20 mL預(yù)冷的濃磷酸，待其成均相物，置于冰上1 h，期間多次攪拌。隨后加入80 mL預(yù)冷的蒸餾水，離心去上清，反復(fù)洗滌。加入2 mol/L Na2CO3中和殘存的磷酸，用蒸餾水洗滌至pH 5–7，最后用蒸餾水溶解。

1%磷酸處理玉米芯渣：玉米芯渣經(jīng)80 ℃高溫干燥過(guò)夜后，研磨，過(guò)40目分樣篩，得到的玉米芯渣用磷酸處理，具體參見(jiàn)文獻(xiàn)[27]。

1.6 分析共表達(dá)酶協(xié)同作用

以1% PASC、濾紙、1%磷酸處理玉米芯渣作為底物，分別測(cè)定共表達(dá)粗酶液對(duì)上述不同底物的降解作用，并與單獨(dú)表達(dá)酶的混合液進(jìn)行比較。

在混合酶組合對(duì)不同底物的降解中，分別測(cè)定共表達(dá)系統(tǒng)中4種木質(zhì)纖維素酶的酶活，50 μL的酶液體系中，保證混合酶組分中添加的相應(yīng)木質(zhì)纖維素酶酶活與共表達(dá)系統(tǒng)中的一致，若酶液體系不足50 μL則使用SAB 緩沖液補(bǔ)齊。

降解濾紙的測(cè)定方法同1.4.4。

降解PASC、磷酸處理的玉米芯渣測(cè)定：1% 的底物200 μL，加入不同組合酶液50 μL，37 ℃反應(yīng)30 min，離心去除不溶物，其余同濾紙酶活的測(cè)定。

共表達(dá)酶：共表達(dá)酶組分降解底物產(chǎn)生還原糖的量；混合酶：混合酶組分降解底物產(chǎn)生還原糖的含量。

反應(yīng)后測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物中葡萄糖和還原糖的含量，葡萄糖產(chǎn)量的測(cè)定使用葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶 (GOD-POD) 試劑盒；還原糖產(chǎn)量的測(cè)定使用DNS法，通過(guò)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出還原糖產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種木質(zhì)纖維素酶基因在大腸桿菌中的共表達(dá)

獲得兩兩酶基因 (Co-BGEG，Co-CotAXyl)和4個(gè)酶基因 (Co-BECX) 共表達(dá)的粗酶液，進(jìn)行SDS-PAGE分析和酶活性測(cè)定。由SDS-PAGE的結(jié)果可以看出(圖1)，與含有空載體pETDuet-1的.BL21(DE3) 的破壁上清相比，Co-BGEG的破壁上清中含有56 kDa的BGDS5和45 kDa的EG71蛋白條帶；與含有空載體pRSFDuet-1的.BL21(DE3) 的破壁上清相比，Co-CotAXyl的破壁上清中含有60 kDa的CotA和23 kDa的XylMb1蛋白條帶；綜合以上作為對(duì)照，在Co-BECX的破壁上清中存在BGDS5、EG71、CotA和XylMb1。進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳時(shí)，每個(gè)樣品的上樣量均為5 μL，從SDS-PAGE的結(jié)果來(lái)看，在Co-BGEG和Co-BECX中，EG71的蛋白條帶比較粗，說(shuō)明EG71在共表達(dá)體系中有較高的表達(dá)量；而對(duì)于BGDS5、CotA和XylMb1，從SDS-PAGE的結(jié)果來(lái)看，蛋白條帶均比較細(xì)，這3種木質(zhì)纖維素酶在共表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)量比較低。酶活測(cè)定分析表明大腸桿菌共表達(dá)系統(tǒng)中的β-葡萄糖苷酶、內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶、漆酶和木聚糖酶的粗酶液酶活分別為14.1 U/mL、28.64 U/mL、19.74 U/mL和18.65 U/mL。

圖1 SDS-PAGE分析Co-BGEG、Co-CotAXyl和Co-BECX在E. coli BL21(DE3)中的表達(dá)

2.2 共表達(dá)酶對(duì)底物協(xié)同降解作用

2.2.1 對(duì)PASC的協(xié)同降解作用

微晶纖維素經(jīng)過(guò)磷酸處理后形成結(jié)構(gòu)松散的PASC，經(jīng)過(guò)酸處理的微晶纖維素在體系中產(chǎn)生了大量的還原糖，也暴露出更多的反應(yīng)末端，有利于纖維素酶附著于其上發(fā)生反應(yīng)。我們測(cè)定了共表達(dá)的Co-BGEG粗酶液降解PASC的能力，并將其降解效果與單獨(dú)表達(dá)的BGDS5、EG71這兩種酶的混合酶液對(duì)PASC降解的協(xié)同作用進(jìn)行了比較。當(dāng)體系中只存在EG酶時(shí)，PASC可被降解并產(chǎn)生少量葡萄糖 (圖2)；當(dāng)體系中同時(shí)添加EG酶和BG酶時(shí)，反應(yīng)體系中的葡萄糖量明顯提高，與體系中只存在EG酶時(shí)相比，葡萄糖的產(chǎn)量大大提高。共表達(dá)Co-BECX和單獨(dú)表達(dá)的4種纖維素酶的混合酶液相比較，發(fā)現(xiàn)共表達(dá)酶液體系中還原糖的量提高，對(duì)PASC的共表達(dá)協(xié)同降解作用比4種單獨(dú)表達(dá)纖維素酶的混合酶液大約提高了44%。

2.2.2 對(duì)濾紙的協(xié)同降解作用

測(cè)定了共表達(dá)的Co-BECX粗酶液降解濾紙的能力，并與單獨(dú)表達(dá)的BGDS5、EG71、CotA 和XylMb1這4種酶組分的混合酶液對(duì)濾紙降解的協(xié)同作用進(jìn)行了比較。根據(jù)上述材料與方法中的測(cè)定方法，我們測(cè)定了共表達(dá)的Co-BECX粗酶液和單獨(dú)表達(dá)的BGDS5、EG71、CotA 和XylMb1這4種酶組分的混合酶液對(duì)濾紙的降解作用，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了處理，數(shù)據(jù)處理結(jié)果如圖3所示。當(dāng)酶反應(yīng)體系中只有EG酶時(shí)，對(duì)濾紙有降解，產(chǎn)生了一定量的還原糖，產(chǎn)生的葡萄糖的量極少，但當(dāng)反應(yīng)體系中再添加BG酶時(shí)，反應(yīng)后產(chǎn)生葡萄糖的量大約是只含有EG的酶反應(yīng)體系的2.2倍。因?yàn)樵诿阜磻?yīng)體系中添加了BG 酶，BG酶將纖維二糖水解為葡萄糖，提高了反應(yīng)體系中葡萄糖的產(chǎn)量，同時(shí)也緩解了EG酶的產(chǎn)物抑制。在以濾紙為底物時(shí)酶反應(yīng)體系中依次添加這4種木質(zhì)纖維素酶，產(chǎn)生還原糖的含量逐步增多，當(dāng)這4種木質(zhì)纖維素酶同時(shí)作用于這一反應(yīng)體系中時(shí)，產(chǎn)生的還原糖和葡萄糖的量在組合的混合酶反應(yīng)中達(dá)到最高，與體系中只有EG 酶相比分別提高了2倍和2.7倍，這4種酶可以組合成一個(gè)協(xié)同降解的木質(zhì)纖維素酶系作用于濾紙。共表達(dá)的Co-BECX和單獨(dú)表達(dá)的4種酶的混合酶液相比較，發(fā)現(xiàn)共表達(dá)酶液體系中還原糖的產(chǎn)量高，對(duì)濾紙的協(xié)同降解作用比4種單獨(dú)表達(dá)的混合酶液提高了34%，由此，共表達(dá)酶液對(duì)濾紙的協(xié)同降解效果要好。但是從葡萄糖的產(chǎn)量來(lái)說(shuō)，單獨(dú)表達(dá)的4種酶混合酶液的反應(yīng)體系中葡萄糖的產(chǎn)量要高一些，可能由于單獨(dú)表達(dá)的4種酶混合液和共表達(dá)系統(tǒng)中其他3種木質(zhì)纖維素酶對(duì)BG酶產(chǎn)生的影響不同。

2.2.3 對(duì)磷酸處理的玉米芯渣的協(xié)同降解作用

本研究中使用的玉米芯渣經(jīng)過(guò)一定程度的脫木素處理，但是并沒(méi)有完全去除木質(zhì)素的成分，同時(shí)也使用磷酸對(duì)其進(jìn)行了酸處理，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的脫木素和酸處理后，玉米芯渣的結(jié)構(gòu)疏松，纖維素束和半纖維素暴露出來(lái)，有利于木質(zhì)纖維素酶對(duì)其進(jìn)行降解。結(jié)果如圖4所示，當(dāng)酶反應(yīng)體系中只有EG酶存在時(shí)，可以對(duì)玉米芯有降解，產(chǎn)生了一定量的還原糖，但產(chǎn)生的葡萄糖的量很少，但當(dāng)反應(yīng)體系中添加BG酶時(shí)，反應(yīng)后產(chǎn)生葡萄糖的量大約是只含有EG的酶反應(yīng)體系的2.5倍。因?yàn)锽G酶可以將纖維二糖水解為葡萄糖，提高了反應(yīng)體系中葡萄糖的產(chǎn)量，同時(shí)也緩解了EG酶的產(chǎn)物抑制。由圖4中我們看到第4組數(shù)據(jù)也就是包含這4種木質(zhì)纖維素酶的酶反應(yīng)體系，要比第3組數(shù)據(jù)即包含EG、BG和Xyl三種木質(zhì)纖維素酶的酶反應(yīng)體系產(chǎn)生還原糖的含量少一些，我們認(rèn)為可能是誤差導(dǎo)致。第3組數(shù)據(jù)與第4組數(shù)據(jù)相比，在還原糖和葡萄糖的產(chǎn)量上大致相等，產(chǎn)量不再提高，我們推測(cè)在以玉米芯為底物時(shí)，隨著不同酶組分的添加，會(huì)產(chǎn)生底物競(jìng)爭(zhēng)作用[28]。我們發(fā)現(xiàn)，共表達(dá)的Co-BECX和單獨(dú)表達(dá)的4種酶的混合酶液相比較，共表達(dá)酶液體系中葡萄糖的產(chǎn)量?jī)烧呦嘁恢?，但共表達(dá)的酶液體系中還原糖的產(chǎn)量高，對(duì)玉米芯的協(xié)同降解作用大約比4種單獨(dú)表達(dá)的混合酶液提高了20%，由此表明，共表達(dá)酶液對(duì)玉米芯的協(xié)同降解效果要好。

圖4 共表達(dá)酶液與單獨(dú)表達(dá)酶液協(xié)同降解磷酸處理的玉米渣的比較

3 討論

隨著基因克隆技術(shù)的發(fā)展，迄今已有很多外源基因被克隆到不同的表達(dá)載體中進(jìn)行了研究，進(jìn)而應(yīng)用到工業(yè)領(lǐng)域，造福于人類的生產(chǎn)生活。但是很多生物學(xué)功能并不是只由一種基因或一種蛋白來(lái)控制和完成的，需要由多個(gè)基因或蛋白共同作用實(shí)現(xiàn)某一生物學(xué)功能。在工業(yè)領(lǐng)域，多個(gè)外源基因在同一表達(dá)宿主中實(shí)現(xiàn)共表達(dá)，能夠有效地節(jié)約生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)量，是生物技術(shù)在工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域中應(yīng)用的又一個(gè)新的創(chuàng)新。

白蟻?zhàn)陨砑捌淠c道微生物來(lái)源的木質(zhì)纖維素酶類具有分子量小、活性高等特點(diǎn)。目前為止，很多已發(fā)現(xiàn)的白蟻及其腸道微生物來(lái)源的木質(zhì)纖維素酶已經(jīng)由各種模式微生物單獨(dú)生產(chǎn)，但關(guān)于通過(guò)單一微生物有效生產(chǎn)多種木質(zhì)纖維素酶的報(bào)道很少。本研究所采用的共表達(dá)策略是在同一宿主中同時(shí)使用含有兩個(gè)多克隆位點(diǎn)的pETDuet1和pRSFDuet-1表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中EG、BG、CotA和XylMb1四種纖維素酶的共表達(dá)。使用帶有氨芐青霉素抗性的pETDuet-1質(zhì)粒同時(shí)表達(dá)得到了EG和BG并都具有相應(yīng)酶活；使用硫酸卡那霉素抗性的pRSFDuet-1質(zhì)粒同時(shí)表達(dá)得到了CotA和XylMb1并都具有酶活；隨后我們將上述經(jīng)過(guò)酶活驗(yàn)證后的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入到了同一個(gè)宿主中，使用氨芐青霉素和硫酸卡那霉素兩種抗生素進(jìn)行初步篩選，隨后測(cè)定4種木質(zhì)纖維素酶酶活進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究采用了3種底物來(lái)進(jìn)行上述共表達(dá)的木質(zhì)纖維素酶在協(xié)同降解效率方面的測(cè)定。在降解過(guò)程中，不同種類的酶、不同的酶組分之間具有協(xié)同作用，即組合酶組分的降解效率要明顯高于單組分降解效率總和。以PASC為底物時(shí)，共表達(dá)的粗酶液對(duì)PASC的降解與單獨(dú)表達(dá)的混合酶液相比較，葡萄糖的產(chǎn)量提高了61%，使PASC降解得更加充分；以濾紙為底物時(shí)，共表達(dá)的粗酶液對(duì)濾紙的降解要比單獨(dú)表達(dá)的混合酶液有所提高，大約提高了34%。對(duì)于木質(zhì)纖維素酶來(lái)說(shuō)，玉米芯是天然的降解底物，但在纖維素束的外圍包裹著結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的木質(zhì)素，外圍結(jié)構(gòu)緊實(shí)，難以被降解。以磷酸處理的玉米芯渣為底物時(shí)，共表達(dá)的粗酶液對(duì)玉米芯的降解與單獨(dú)表達(dá)的混合酶液相比較，大約提高了20%。這是由于Avicel經(jīng)過(guò)磷酸處理后，其纖維束外圍復(fù)雜而又緊實(shí)的結(jié)構(gòu)被酸破壞，從而使結(jié)構(gòu)疏松，暴露出纖維素束，有利于木質(zhì)纖維素酶附著于其上發(fā)揮作用。協(xié)同作用的存在與木質(zhì)纖維素底物結(jié)構(gòu)、成分的復(fù)雜性是相適應(yīng)的，因此其強(qiáng)弱也隨著底物性質(zhì)的變化而呈現(xiàn)出差異[29]。對(duì)于3種底物進(jìn)行協(xié)同作用的測(cè)定時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)體系中加入EG和BG的混合酶液時(shí)，與降解體系中只有EG時(shí)產(chǎn)生的葡萄糖的量有明顯提高，推測(cè)是由于添加β-葡萄糖苷酶后，β-葡萄糖苷酶降解了EG作用底物后產(chǎn)生的寡糖鏈，將其分解成葡萄糖，既加大了底物被降解的程度，也緩解了寡糖鏈對(duì)EG的產(chǎn)物抑制效應(yīng)。在分別以濾紙和玉米芯為底物時(shí)，在含有EG和BG的體系中加入CotA或Xyl時(shí)，都會(huì)使產(chǎn)生的還原糖含量提高，說(shuō)明CotA或Xyl都對(duì)木質(zhì)纖維素的降解有一定的促進(jìn)作用。對(duì)于單獨(dú)表達(dá)的混合酶來(lái)說(shuō)，在體系中4種酶混合時(shí)，其產(chǎn)生還原糖的量最高；從共表達(dá)的角度分析，當(dāng)體系中保證4種木質(zhì)纖維素酶的酶活分別相一致時(shí)，體系中添加共表達(dá)的粗酶液要比單獨(dú)表達(dá)的混合酶液產(chǎn)生的還原糖的含量高。不同類型的纖維素酶組分之間，纖維素酶組分與半纖維素酶組分之間均存在協(xié)同作用。Fonseca-Maldonado等在畢赤酵母中同時(shí)表達(dá)木聚糖酶和漆酶時(shí)，也得到了類似的結(jié)果，酶活比單獨(dú)表達(dá)提高了44%[30]。Kumar等使用pETDuet-1載體在大腸桿菌中同時(shí)表達(dá)了細(xì)菌來(lái)源的芽胞漆酶CotA、內(nèi)切木聚糖酶Xyl以及果膠酶Pel共表達(dá)后的混合酶制劑降解橘子皮的能力比單獨(dú)使用木聚糖酶高出20%[31]。

由此，將共表達(dá)策略應(yīng)用在工業(yè)領(lǐng)域，不僅能夠提高協(xié)同效應(yīng)，在一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)多種蛋白，還可以簡(jiǎn)化表達(dá)過(guò)程、節(jié)約成本。在本研究中，從葡萄糖的產(chǎn)量來(lái)分析，以濾紙為底物時(shí)，單獨(dú)表達(dá)的4種酶混合酶液的反應(yīng)體系中葡萄糖的產(chǎn)量要比共表達(dá)的酶液高，可能由于單獨(dú)表達(dá)的4種酶混合液和共表達(dá)系統(tǒng)中其他3種木質(zhì)纖維素酶對(duì)BG酶產(chǎn)生的影響不同。劉建明等在研究3種外切酶的協(xié)同作用時(shí)，當(dāng)多種纖維素酶組合在一起作用底物時(shí)要比兩種酶組合在一起時(shí)產(chǎn)生的還原糖的量少，推測(cè)可能是幾種酶之間存在相互競(jìng)爭(zhēng)與底物結(jié)合，降低了催化效率[28]；當(dāng)以玉米芯為底物時(shí)，單獨(dú)表達(dá)的4種酶混合酶液的反應(yīng)體系中葡萄糖的產(chǎn)量幾乎與共表達(dá)的酶液相一致，我們推測(cè)產(chǎn)生這種結(jié)果的原因，不同的底物有不同的木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)，其中半纖維素和纖維素在體系中所占的比例也不同，因此單獨(dú)表達(dá)的4種酶混合液和共表達(dá)系統(tǒng)中其他3種木質(zhì)纖維素酶對(duì)BG酶產(chǎn)生的影響不同，導(dǎo)致葡萄糖的產(chǎn)量有所不同，所以對(duì)于各酶組分的最佳比例還需要進(jìn)一步的研究。

[1] Ohkuma M. Termite symbiotic systems: efficientbio-recycling of lignocellulose. Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 61(1): 1–9.

[2] Li HJ, Yelle DJ, Li C, et al. Lignocellulose pretreatment in a fungus-cultivating termite. Proc Natl Acad Sci USA, 2017, 114(18): 4709?4714.

[3] Gardner KH, Blackwell J. The structure of native cellulose. Biopolymers, 1974, 13(10): 1975–2001.

[4] Woodward J, Wiseman A. Fungal and other β-D-glucosidases—their properties and applications. Enzyme Microbial Technol, 1982, 4(2): 73–79.

[5] Angelov A, Pham VTT, übelacker M, et al. A metagenome-derived thermostable β-glucanase with an unusual module architecture which defines the new glycoside hydrolase family GH148. Sci Rep, 2017, 7(1): 17306.

[6] Watanabe H, Tokuda G. Cellulolytic systems in insects. Ann Rev Entomol, 2010, 55(1): 609–632.

[7] Polizeli MLTM, Rizzatti ACS, Monti R, et al. Xylanases from fungi: properties and industrial applications. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 67(5): 577–591.

[8] Chávez R, Bull P, Eyzaguirre J. The xylanolytic enzyme system from the genus. J Biotechnol, 2006, 123(4): 413–433.

[9] Shang TT, Si DY, Zhang DY, et al. Enhancement of thermoalkaliphilic xylanase production bythrough novel fed-batch strategy in high cell-density fermentation. BMC Biotechnol, 2017, 17: 55.

[10] Raud M, Tutt M, Olt J, et al. Effect of lignin content of lignocellulosic material on hydrolysis efficiency. Agron Res, 2015, 13(2): 405–412.

[11] Donovan SE, Eggleton P, Bignell DE. Gut content analysis and a new feeding group classification of termites. Ecol Entomol, 2001, 26(4): 356–366.

[12] Nakashima K, Watanabe H, Saitoh H, et al. Dual cellulose-digesting system of the wood-feeding termite,Shiraki. Insect Biochem Molec Biol, 2002, 32(7): 777–784.

[13] Ni JF, Tokuda G, Takehara M, et al. Heterologous expression and enzymatic characterization of β-glucosidase from the drywood-eating termite,. Appl Entomol Zool, 2007, 42(3): 457–463.

[14] Ni JF, Takehara M, Miyazawa M, et al. Random exchanges of non-conserved amino acid residues among four parental termite cellulases by family shuffling improved thermostability. Protein Eng Des Select, 2007, 20(11): 535–542.

[15] Ning N. Cloning and expression of lignocellulase genes from termites and their endosymbionts[D]. Ji’nan: Shandong University, 2017 (in Chinese). 寧娜. 白蟻及其腸道微生物來(lái)源木質(zhì)纖維素酶基因的克隆與表達(dá)[D]. 濟(jì)南: 山東大學(xué), 2017.

[16] Shi XY. Purification and cloning the bacterial xylanase from the hindgut ofand the microbial diversity in combs of fungus-growing termites[D]. Ji’nan: Shandong University, 2015 (in Chinese). 石小玉. 黃翅大白蟻后腸細(xì)菌來(lái)源木聚糖酶的純化與基因克隆以及培菌白蟻菌圃微生物多樣性研究[D]. 濟(jì)南: 山東大學(xué), 2015.

[17] Martins LO, Soares CM, Pereira MM, et al. Molecular and biochemical characterization of a highly stable bacterial laccase that occurs as a structural component of theendospore coat. J Biol Chem, 2002, 277(21): 18849–18859.

[18] Sawant SS, Salunke BK, Kim BS. Degradation of corn stover by fungal cellulase cocktail for production of polyhydroxyalkanoates by moderatehalophilesp. LL1. Bioresource Technol, 2015, 194: 247–255.

[19] Dong WL, Xue ML, Zhang Y, et al. Characterization of a β-glucosidase fromspecies and its application for succinic acid production from sugarcane bagasse hydrolysate. Bioresource Technol, 2017, 241: 309–316.

[20] Gao HY, Liu ZC, Duan SW, et al. Coexpression of β-mannanase and xylanase genes in. Microbiology China, 2012, 39(3): 344–352 (in Chinese). 高海有, 劉正初, 段盛文, 等. β-甘露聚糖酶和木聚糖酶基因在大腸桿菌中共表達(dá). 微生物學(xué)通報(bào), 2012, 39(3): 344–352.

[21] Riou C, Salmon JM, Vallier MJ, et al. Purification, characterization, and substrate specificity of a novel highly glucose-tolerant β-glucosidase from. Appl Environ Microbiol, 1998, 64(10): 3607–3614.

[22] Ni JF, Wu Y, Yun C, et al. cDNA cloning and heterologous expression of an endo-β-1, 4-glucanase from the fun-growing termite. Arch Insect Biochem Physiol, 2014, 86(3): 151–164.

[23] Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem, 1959, 31(3): 426–428.

[24] Geng AL, Wu J, Xie RR, et al. Characterization of a laccase from a wood-feeding termite,. Insect Sci, 2018, 25(2): 251–258.

[25] Yu XX, Liu Y, Cui YX, et al. Measurement of filter paper activities of cellulase with microplate-based assay. Saudi J Biol Sci, 2016, 23(S1): S93–S98.

[26] Zhang YHP, Cui JB, Lynd LR, et al. A transition from cellulose swelling to cellulose dissolution by-phosphoric acid: evidence from enzymatic hydrolysis and supramolecular structure. Biomacromolecules, 2006, 7(2): 644–648.

[27] Banerjee G, Car S, Scott-Craig JS, et al. Alkaline peroxide pretreatment of corn stover: effects of biomass, peroxide, and enzyme loading and composition on yields of glucose and xylose. Biotechnol Biofuels, 2011, 4: 16.

[28] Liu JM. Screening for cellobiohydrolase genes and the secretion of thermostable cellulase in[D]. Shanghai: East China University of Science and Technology, 2011 (in Chinese). 劉建明. 細(xì)菌纖維素外切酶基因的篩選及耐熱纖維素酶基因在枯草桿菌系統(tǒng)里的表達(dá)[D]. 上海: 華東理工大學(xué), 2011.

[29] Zhang YHP, Lynd LR. Toward an aggregated understanding of enzymatic hydrolysis of cellulose: noncomplexed cellulase systems. Biotechnol Bioeng, 2004, 88(7): 797–824.

[30] Fonseca-Maldonado R, Ribeiro LF, Furtado GP, et al. Synergistic action of co-expressed xylanase/laccase mixtures against milled sugar cane bagasse. Process Biochem, 2014, 49(7): 1152–1161.

[31] Kumar S, Jain KK, Bhardwaj KN, et al. Multiple genes in a single host: cost-effective production of bacterial laccase (cotA), pectate lyase (pel), and endoxylanase (xyl) by simultaneous expression and cloning in single vector in.. PLoS ONE, 2015, 10(12): e0144379.

Co-expression of lignocellulase from termite and their endosymbionts

Jiao Du, Shuzhe Jiang, Jianhua Wei, Yulong Shen, and Jinfeng Ni

State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Qingdao 266200, Shandong, China

Natural lignocellulosic materials contain cellulose, hemicellulose, and lignin. Cellulose hydrolysis to glucose requires a series of lignocellulases. Recently, the research on the synergistic effect of lignocellulases has become a new research focus. Here, four lignocellulase genes encoding β-glucosidase, endo-1,4-β-glucanase, xylanase and laccasefrom termiteand their endosymbionts were cloned into pETDuet-1 and pRSFDuet-1 and expressed in. After SDS-PAGE analysis, the corresponding protein bands consistent with the theoretical values were observed and all the proteins showed enzyme activities. We used phosphoric acid swollen cellulose (PASC) as substrate to measure the synergistic effect of crude extracts of co-expressing enzymes and the mixture of single enzyme. The co-expressed enzymes increased the degradation efficiency of PASC by 44% compared with the single enzyme mixture; while the degradation rate increased by 34% and 20%, respectively when using filter paper and corn cob pretreated with phosphoric acid as substrates. The degradation efficiency of the co-expressed enzymes was higher than the total efficiency of the single enzyme mixture.

termite, lignocellulase, co-expression, synergism

June 8, 2018;

August 28, 2018

National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (No. 2011CB707402), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31272370, 30870085).

Jinfeng Ni. Tel/Fax: +86-531-88363323; E-mail: jinfgni@sdu.edu.cn

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2011CB707402)，國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos. 31272370，30870085) 資助。

2018-09-19

10.13345/j.cjb.180235

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180914.1513.001.html

(本文責(zé)編 陳宏宇)