王宏潤，李宏宇

(1.右江民族醫(yī)學院，廣西 百色 533000； 2.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院骨科，南寧 530021)

間充質(zhì)干細胞具有來源方便，易分離、培養(yǎng)擴增、純化及多向分化和增殖能力，其可在適宜的體外環(huán)境多向分化，具有向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞及肝細胞等分化的特性，這使其在重建退化組織及相關(guān)骨疾病的臨床應(yīng)用中具有廣闊的前景[1]。微RNA(microRNA，miRNA)是由19～25個核苷酸組成的非編碼小分子RNA，其主要參與了細胞的增殖、分化、凋亡等生命活動，廣泛存在于各個生物群體中，miRNA的分子結(jié)構(gòu)包括非編碼區(qū)(untrans-lated region，UTR)及內(nèi)含子間隔開的編碼區(qū)。大量研究表明，miRNA在生物細胞的增殖、分化，病毒感染及腫瘤細胞增殖過程中起關(guān)鍵作用[2-4]。miRNA的產(chǎn)生是由RNA聚合酶Ⅱ與DNA生成初級轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)，pri-miRNA典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)經(jīng)過核糖核酸酶Ⅲ內(nèi)切酶加工后由轉(zhuǎn)運蛋白運送到細胞質(zhì)，生成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA，前體miRNA在細胞質(zhì)中核酸酶與RNA解旋酶的作用下生成miRNA[5]。miRNA的作用之一為通過與信使RNA編碼區(qū)及UTR的不完全互補配對，在后續(xù)的細胞生長及發(fā)育過程中起重要作用。而miRNA的另一作用為通過與靶基因3′UTR非完全配對抑制靶基因翻譯。此外，在成骨過程中miRNA也發(fā)揮了重要作用?，F(xiàn)就miRNA調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)成骨分化的研究進展予以綜述。

1 miRNA在成骨分化過程的作用

miRNA可調(diào)控不同細胞的成骨分化[6]，但目前對miRNA中特異性作用于BMSC成骨分化的基因家族研究較少。近年來，miRNA的修飾功能在間充質(zhì)干細胞調(diào)控成骨分化中起關(guān)鍵作用[7]。miRNA通過調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達影響成骨分化過程，不同轉(zhuǎn)錄因子作用于間充質(zhì)干細胞，使其分化為成骨細胞[Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)、鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子Osterix、β聯(lián)蛋白(β-catenin)、活化轉(zhuǎn)錄因子4、Smads、Satb2等]與破骨細胞 (轉(zhuǎn)錄因子c-Fos、Pu．1、核因子κB、活化T細胞核因子c1等)[8-11]。研究表明，miRNA不僅具有促進成骨分化的作用，也有抑制成骨分化的作用，如miR-26a可以通過成骨分化的經(jīng)典通路[骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-Smads通路]增加人脂肪來源干細胞基因的表達，從而促進成骨分化[12]；miR-125b通過對目標靶基因Cbfβ進行調(diào)控，減少成骨標志基因的表達，從而抑制成骨分化[13]。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量miRNA在成骨分化過程中的作用，但其具體機制尚不明確。

2 與BMSC成骨分化相關(guān)的信號通路

BMSC具有較高的復(fù)制能力，在體內(nèi)或合適的體外環(huán)境中通過細胞因子的誘導(dǎo)可使其分化成各種細胞，如成骨細胞、軟骨細胞、基質(zhì)細胞和造血細胞。BMSC成骨分化過程中的相關(guān)信號通路除BMP-Smads信號通路、Wnt/β-catenin信號通路和Notch信號通路3條經(jīng)典信號通路外，還有促分裂原活化的蛋白激酶信號通路、核因子κB受體活化因子信號通路等，它們在成骨分化過程也起重要作用。

2.1BMP-Smads信號通路 BMP作為轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族成員之一，在成骨分化過程中起關(guān)鍵作用，其不僅在成骨分化中作用突出，也在胚胎發(fā)育、細胞增殖及相關(guān)腫瘤形成過程中發(fā)揮重要作用。BMP-Smads信號通路通過配體BMP與細胞膜上的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合，促進下游信號蛋白中的絲氨酸或蘇氨酸磷酸化，將細胞外的信號傳入細胞內(nèi)，從而發(fā)揮多種生物功能[14-16]。Smads作為胞質(zhì)中的蛋白因子是BMP信號通路中的一個重要因子，其在體內(nèi)參與相關(guān)調(diào)節(jié)時與其他通路交互作用組成了復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。實驗證明，BMP作為最早的骨形態(tài)發(fā)生信號因子，特異性誘導(dǎo)骨形成及其細胞分化[17]。BMP在細胞外與相應(yīng)受體(BMP受體Ⅰ和BMP受體Ⅱ)配對后發(fā)生磷酸化，BMP受體通過結(jié)合絲/蘇氨酸激酶受體產(chǎn)生抑制性功能受體，抑制性功能受體在細胞質(zhì)內(nèi)與Smads結(jié)合后進入細胞核，與smrf1因子結(jié)合，其結(jié)合產(chǎn)物再通過與活化特異性轉(zhuǎn)錄因子(Runx2、Osterix等)特異性結(jié)合調(diào)節(jié)骨代謝，從而誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞成骨分化過程[18-19]。有研究發(fā)現(xiàn)，當激活BMP-Smads通路時，Runx2、Osterix作為主要受調(diào)控因子顯著上調(diào)，從而促進BMSC的成骨分化[9]。

2.2Wnt/β-catenin信號通路 作為成骨分化過程中的又一關(guān)鍵通路，Wnt信號通路參與成骨分化的部分機制已被證實[20]。目前，已發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路參與了促進骨形成、抑制脂肪形成及腫瘤發(fā)生過程等諸多生物學活動[21]。根據(jù)有無β-catenin參與，Wnt信號通路分為經(jīng)典信號通路與非經(jīng)典信號通路兩種，其中Wnt/β-catenin信號通路作為經(jīng)典傳導(dǎo)通路已成為成骨細胞的研究熱點。Wnt配體及其相應(yīng)的受體和細胞內(nèi)信號分子構(gòu)成經(jīng)典的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑成員主要包括細胞外Wnt蛋白(配體)、卷曲蛋白、β-catenin、T細胞因子/淋巴增強劑等，下游靶基因包括細胞周期蛋白D1、c-myc、Runx2、Osterix等，這些相關(guān)基因在成骨分化過程中起重要作用[22]。如Wnt信號通路抑制糖原合成酶激酶3β活性，促使β-catenin進入細胞核，β-catenin在細胞核內(nèi)啟動下游相關(guān)因子，相關(guān)因子作用于BMSC，促進成骨分化[8,23-24]。近年對Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進行研究發(fā)現(xiàn)，LRP5的突變可影響骨形成及骨代謝失調(diào)，從而影響骨量水平[25]。

2.3Notch信號通路 Notch作為保守的受體蛋白，其引導(dǎo)的信號通路已被證實在許多疾病的發(fā)病機制中起重要作用，如急性肝衰竭、銀屑病等，且其在成骨細胞分化過程中也是研究熱點[26]。Notch同源分子包括4型，即Notch1、2、3、4。而Notch受體蛋白對應(yīng)的下游配體同源分子目前有5種，分別為Delta1、3、4及Jagged1、2[27-28]。體外研究發(fā)現(xiàn)，不同的激活方式使得Notch信號通路發(fā)揮了促進成骨與抑制成骨的雙向作用，其中Notch受體蛋白通過激活Osterix/Sp7，上調(diào)細胞周期蛋白D、E，從而抑制成骨分化；另一方面，Notch受體蛋白通過結(jié)合Runx2，使Runx2活性下降，從而抑制成骨分化[29-30]。有學者通過培養(yǎng)能特異性激活Wnt/β-catenin信號通路的小鼠，檢測Notch相關(guān)配體Jagged1、Jagged2、Delta1、Delta4及相關(guān)骨代謝轉(zhuǎn)化指標(Runx2、成骨分化特異性標志物堿性磷酸酶)發(fā)現(xiàn)，Notch相關(guān)配體的表達明顯增加，且Runx2、堿性磷酸酶的表達水平也明顯升高，這表明Wnt/β-catenin信號通路可通過細胞因子刺激Notch信號，從而促進BMSC成骨分化[31]。

3 調(diào)控BMSC成骨分化的miRNA

3.1miR-99a 實驗發(fā)現(xiàn)，在含有miR-99a抑制劑的功能化支架上局部植入BMSC可以增強局部骨的形成，且與多能細胞的C3H10T-1/2相比，miR-99a在成骨細胞MC3T3-E1和MA5-A5中均顯著下調(diào)[7]。有學者在信使RNA的組蛋白去甲基化酶KDM6B序列3′ UTR上找到了miR-99a對應(yīng)序列，并分別將野生型和突變型KDM6B 3′UTR插入到pmirGLO熒光素酶載體，再將這些載體轉(zhuǎn)到C3H10T-1/2細胞[32]。結(jié)果顯示，野生型KDM6B中的miR-99a在低聚核苷酸的作用下，明顯抑制了熒光素酶的活性。而突變組逆轉(zhuǎn)了miR-99a的作用，減弱了熒光素酶的抑制作用。這一結(jié)果表明，miR-99a可以直接與KDMB6的3′UTR結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水平。因此，KDM6B被確定為miR-99a的重要目標之一。此外，HOX基因表達的蛋白質(zhì)可通過增加Runx2表達促進成骨分化。有學者通過研究HOX基因與成骨分化的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-99a可以顯著抑制HOXC6-1、HOXA10、HOXB2和HOXC10的表達,而miR-99a抑制劑可以增加HOXC6-1、HOXA10、HOXB2和HOXC10的表達，表明miR-99a通過HOX相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控KDM6B[33]。這表明，特異性抑制miR-99a可能是一種新治療方法，其可用于增強基于BMSCs的成骨分化能力。

3.2miR-26a 通過對不同來源的間充質(zhì)干細胞進行研究發(fā)現(xiàn)，miR-26a調(diào)節(jié)成骨分化的通路大致包括以下幾條：Smad1信號通路、Tob1信號通路、Wnt信號通路、糖原合成酶激酶3β信號通路[34]。在研究人脂肪組織來源間充質(zhì)干細胞成骨分化的過程中，可以檢測到miR-26a高表達，而Smad1蛋白表達下調(diào)。Balogh等[35]報道，miR-26a參與了多發(fā)性內(nèi)分泌癌蛋白調(diào)控Smad1的細胞表達過程。多發(fā)性內(nèi)分泌癌蛋白作為抑癌基因多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤致病因子1的產(chǎn)物在轉(zhuǎn)錄過程中具有廣泛作用，有學者在分析人脂肪組織來源間充質(zhì)干細胞時發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性內(nèi)分泌癌蛋白及miR-26a兩者均上調(diào)，且相關(guān)成骨標記基因Runx2、骨鈣素等也上調(diào)[35]。染色質(zhì)免疫沉淀分析發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性內(nèi)分泌癌蛋白通過與miR-26a的基因啟動子結(jié)合來誘導(dǎo)其表達，表明miR-26a在人脂肪組織來源間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中可能起關(guān)鍵作用。另一項研究發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性內(nèi)分泌癌蛋白作為調(diào)控因子，通過miR-26a對Smad1蛋白進行間接調(diào)控[36]。因此，miR-26a在成骨分化中扮演的角色及人脂肪組織來源間充質(zhì)干細胞成骨分化的具體分子機制有待進一步闡明。

3.3miR-21 miR-21通過抑制快速發(fā)育生長因子同源蛋白2抗體(Spry2)負反饋調(diào)節(jié)Runx2與Osterix，繼而調(diào)節(jié)BMSC成骨分化，在這一表達過程中，Runx家族成員之一Runx2起著至關(guān)重要的作用。Spry負向調(diào)節(jié)成纖維細胞生長因子首次在果蠅胚胎分化器官過程中被發(fā)現(xiàn)[37]。此外，Spry家族由Spry1、 Spry2、 Spry3 和Spry4四個基因組成，它們在人和大鼠之間均高度保守。在骨質(zhì)疏松癥患者BMSC成骨分化試驗中，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測經(jīng)miR-21轉(zhuǎn)染的人類BMSC發(fā)現(xiàn)，Spry1基因的表達下調(diào)，Runx2和Osterix過表達，從而導(dǎo)致BMSC的成骨分化增強。楊楠等[38]通過研究人類BMSC中的miR-21/Spry1功能軸發(fā)現(xiàn)，過表達miR-21通過抑制目標蛋白Spry1的表達對成骨分化起促進作用；為進一步確定Spry1對成骨分化的抑制作用,他們對培養(yǎng)好的人類BMSC進行miRNA及前體miR-21轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染成功后對BMSC進行體外觀察及相關(guān)指標的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達miR-21的堿性磷酸酶活性升高，而抑制miR-21表達，堿性磷酸酶活性明顯下降，且miR-21可通過下調(diào)Spry1，使成骨特異性基因Runx2和Osterix過表達，從而抑制成骨分化。

3.4miR-145 Sun等[39]通過降低成骨細胞中的miR-145水平，利用蛋白質(zhì)印跡法和定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測Runx2、Osterix、β-catenin、T細胞因子1的表達發(fā)現(xiàn)，miR-145水平的下降可以促進Runx2、Osterix、β-catenin、T細胞因子1的表達，從而促進成骨分化，過表達 miR-145通過負調(diào)節(jié)Osterix的表達抑制成骨分化。臨床檢測發(fā)現(xiàn)，骨發(fā)育不全患者中的miR-145表達較正常人減少[40]。而對miR-145成骨分化過程進行動態(tài)檢測發(fā)現(xiàn)，miR-145與叉頭框蛋白O1的表達呈負相關(guān)，即miR-145上調(diào)，叉頭框蛋白O1下調(diào)[41]。miR-145的結(jié)合位點位于叉頭框蛋白O1 3′ UTR的770～776堿基，Hao等[42]通過蛋白質(zhì)印跡法和定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測Runx2、Osterix、β-catenin、T細胞因子1的表達及對雙熒光素酶進行分析表明，miR-145可直接負調(diào)控靶基因叉頭框蛋白O1 3′ UTR。

4 成骨分化過程中間充質(zhì)干細胞與miRNA的關(guān)系

間充質(zhì)干細胞廣泛存在于體內(nèi)的組織細胞中，其定向分化能力是由多因素參與調(diào)控，各種細胞因子作用于DNA上，決定間充質(zhì)干細胞的分化方向。其中，成骨分化與成脂分化作為兩個重要的分化方向存在動態(tài)平衡，一般抑制成脂分化的miRNA會反向促進成骨分化。因此在基礎(chǔ)研究中，應(yīng)充分考慮miRNA可能的分化方向。miRNA作為細胞表達的重要組成部分，其在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)蛋白的表達。miRNA作用于間充質(zhì)干細胞后，調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細胞分化為不同細胞，其不僅在成骨分化中有重要作用，同時也在腫瘤的發(fā)生、組織生長、各個組織器官病變過程中發(fā)揮重要作用。在探索miRNA對成骨分化影響的這一過程中，已進行了大量相關(guān)實驗，包括構(gòu)建相關(guān)干擾載體，獲得穩(wěn)定的細胞株、細胞株培養(yǎng)、細胞轉(zhuǎn)染，定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測相關(guān)基因的表達，蛋白質(zhì)印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達及堿性磷酸酶的檢測等。在實驗過程中，許多不確定因素會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，如實驗操作技術(shù)、實驗中細胞株的選擇等均可能造成假陽性結(jié)果。目前，已發(fā)現(xiàn)一些miRNA在骨質(zhì)疏松中發(fā)揮重要作用，如miR-2861在小鼠實驗中被證實是通過組蛋白去乙?；?增加Runx2的表達，從而對成骨分化起正向調(diào)節(jié)作用[43]。但通過基因手段治療骨代謝疾病仍需不斷探索，與成骨分化相關(guān)的miRNA在骨質(zhì)的新生與改建中發(fā)揮著不可忽視的作用，通過對這些相關(guān)miRNA進行深入探討，將有助于更好地了解成骨分化，從而為骨代謝相關(guān)疾病的治療提供理論基礎(chǔ)。同時，大量未知miRNA的功能仍需要繼續(xù)探索，且對于大多數(shù)已知的miRNA，其調(diào)控機制、下游靶基因的選擇、表達時序性及與相關(guān)疾病的聯(lián)系等問題亦需進一步研究。

5 小 結(jié)

目前，已知miRNA在調(diào)節(jié)通路的激活過程中發(fā)揮重要作用，這使其成為生命科學研究領(lǐng)域的熱點。通過對細胞通路的探索，可以更清晰地認識細胞增殖過程及疾病發(fā)生過程，進而將治療手段從藥物干預(yù)提升至基因治療。已有一些miRNA在臨床用于治療相關(guān)疾病，如在骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松的治療方面已有了較完善的基因治療理論依據(jù)。未來，應(yīng)對miRNA這一復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行整體研究，進一步探討其成骨分化機制，從而促進成骨分化的臨床應(yīng)用和相關(guān)疾病的治療。