李忠光 孫渝婷 史夢婷 楊 蓉 王 丹 梁 瑜 于秋霞 王澤帆 王 娟 任珂星 王李陽,3 周 鑫 MengMeng Xu William Isaacs Jianjie Ma 徐學(xué)紅

1 陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細胞遺傳及發(fā)育生物學(xué), 西安, 710119；2 Ohio State University School of Medicine, Columbus;3 BID Medical Center, Harvard Medical School, Boston; 4. Duke University Medical Center, Durham；5 Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD21287, USA

CRISPR/Cas(簡稱CRISPR)精密編輯技術(shù)是繼誘導(dǎo)干細胞技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用后，有史以來人類最有希望的研究，該技術(shù)在健康醫(yī)學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用前景。與干細胞及誘導(dǎo)干細胞技術(shù)相結(jié)合，可從理論上攻克目前基因分子醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的眾多難題，進一步應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床，具有前所未有的醫(yī)療效果。雖然還有許多技術(shù)層面的問題有待探討，應(yīng)用層面的可行性研發(fā)以及可操作性需要詳盡評估，但該技術(shù)將給人類攻克癌癥、心血管疾病和其他疾病帶來極大的希望。本文以CRISPR精密編輯技術(shù)理論研究和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用為基礎(chǔ)，探究CRISPR基因精密編輯對改變器官移植社會需求和對社會經(jīng)濟、社會生活的重大影響。

1 CRISPR知識產(chǎn)權(quán)歸屬的重要社會影響

1.1 CRISPR的社會客觀性

CRISPR是繼同源整合基因編輯技術(shù)、鋅指核酸酶(ZFN)和TALEN技術(shù)以來新出現(xiàn)的基因編輯技術(shù)[1]。該技術(shù)操作簡單、省時且能夠?qū)魏塑账嵝蛄羞M行基因精密編輯。但該技術(shù)的知識產(chǎn)權(quán)歸屬問題存在不小的爭議。該技術(shù)將是醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)造福于社會標(biāo)志性的技術(shù)，它的實施將有助于最終戰(zhàn)勝威脅人類健康的重大疾病。發(fā)現(xiàn)發(fā)明者在科學(xué)史上也將留下重要的記錄。

1.2 社會認可的知識產(chǎn)權(quán)時間優(yōu)先和創(chuàng)新性優(yōu)先的原則

由Jennifer Doudna領(lǐng)導(dǎo)的加利福尼亞大學(xué)研究團隊和張峰領(lǐng)導(dǎo)的麻省理工學(xué)院Broad研究所團隊分別于2013年底和2014年初提交了CRISPR/Cas的發(fā)明專利申請，不確切的知識產(chǎn)權(quán)保護范圍使FDA陷入了困境。2012年， Doudna帶領(lǐng)的團隊報道，他們重組了CRISPR/Cas，可以在選擇的位點切割DNA；而在2013年，張峰帶領(lǐng)的研究小組報道，CRISPR/Cas可在活的真核細胞(包括人類細胞)中起作用[1- 2]。此后生物醫(yī)學(xué)工作者對這個系統(tǒng)的不斷優(yōu)化，使其功能更為多樣和精準，如基因的敲除、過表達以及修飾等功能均可特異并精準到一個堿基的遺傳學(xué)修飾[2]。FDA根據(jù)確鑿的時間優(yōu)先和創(chuàng)新性優(yōu)先的原則，最終判Broad研究所為知識產(chǎn)權(quán)歸屬單位，并得到公眾和研究領(lǐng)域社團的認可。

2 社會期待該技術(shù)帶來疾病治療的變革

2.1 社會對該技術(shù)的期待源于它近年來的革命性突破

CRISPR對社會影響已經(jīng)進入“由科研人員群體到社會群體”階段的后期或末期，社會期盼政府給予更大的投資，使之早日應(yīng)用于臨床。近年來CRISPR精密編輯的革命性技術(shù)實際上是30年前發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因特性研究的積累，沒有這些積累也就不可能有該系統(tǒng)的建立，也就沒有基因水平對疾病治療實施 “單基因編碼”精密編輯的巨大變革[3]。例如，鐮刀形紅細胞貧血癥是血紅蛋白中珠蛋白β基因的第6位密碼子發(fā)生了點突變導(dǎo)致的疾病，突變使得原本編碼的谷氨酸被纈氨酸所替代，使紅細胞扭旋成鐮刀形,導(dǎo)致紅細胞變形性差、易破裂而溶血，甚至導(dǎo)致毛細血管被這些異常細胞堵塞引發(fā)的繼發(fā)癥狀[4-5]。若使用CRISPR精密編輯技術(shù)對該基因的這一位點進行修正，該疾病就有可能徹底治愈。生殖細胞的這一定位點糾正性修飾，可在該家族的后代中永遠消除該疾病的發(fā)病。成為現(xiàn)實的前提是必須清楚致病基因在基因組上的定位以及它們正常與突變之間的差異是否存在位點修飾、在哪些位點修飾、在個體發(fā)育的確定時空段進行修飾等[5]。因此，基因遺傳學(xué)治療的歷史積累也是該技術(shù)真正應(yīng)用于臨床的必須條件。

2.2 社會允準的少量臨床工作已在推進

2018年末，受病患群體支持的CRISPR已經(jīng)在人類胚胎精密編輯的領(lǐng)域里走出了極具爭議性的一步，世界首例CRISPR基因修飾胎兒降生在南方科技大學(xué)?？蒲腥藛T將抗艾滋病的修飾基因以精密編輯的方式引入到胚胎，以期獲得對艾滋病病毒有抵抗力的個體。暫且忽略該實驗的科學(xué)倫理道德，該病例已經(jīng)引起社會、科學(xué)家和相關(guān)管理機構(gòu)的關(guān)注，是否能夠?qū)崿F(xiàn)“抗艾滋病”的預(yù)期目的，是否具有有效檢測方法倍受社會關(guān)注。

3 精密編輯有望解決移植供體不足的重大問題

3.1 社會亟待解決器官移植的供體排斥問題

由于機體病變或衰老導(dǎo)致的肺、腎、心臟等器官衰竭，目前最有效的治療方法是器官移植。然而，由于移植器官的來源極為有限, 以及器官供體與受體血型的匹配有極強的免疫排斥性，使器官供體供不應(yīng)求。供體非常有限性和免疫排斥性是器官移植臨床面臨的兩大問題。在此領(lǐng)域有極大潛力的哈佛大學(xué)，計劃在豬身上實施CRISPR精密編輯技術(shù)，利用該技術(shù)多位點編輯的特點，修飾免疫排斥基因，將豬細胞中器官排斥相關(guān)基因全部修改為與人類一致的編碼，使排斥現(xiàn)象完全消除，從而徹底解決器官的供應(yīng)不足和免疫排斥的雙重難題。

3.2 哈佛大學(xué)精密編輯干細胞計劃徹底解決了供體排斥問題

美國哈佛大學(xué)和Genesis生物技術(shù)公司已實施了精密編輯豬干細胞計劃，利用CRISPR在敲除豬基因組中62個拷貝的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒基因(PERV)后，人類細胞豬病毒侵染率下降到1/1000。在監(jiān)測靈敏度范圍內(nèi)檢測不到任何侵染的同時，計劃對51種負責(zé)同源排斥的基因進行修飾，最終獲得與人類機體無免疫排斥的多位點基因修飾豬[6-7]，從而證實了研究方案在細胞培養(yǎng)水平上的可行性。隨后研究人員利用 CRISPR技術(shù)成功地使豬的原代細胞系中所有的 PERV 序列失活，利用體細胞核移植技術(shù)，培育出了豬的胚胎，將這些胚胎移植到代孕母豬體內(nèi)培育出了PERV 序列全部失活的小豬。實驗結(jié)果解除了豬源器官移植到人體的關(guān)鍵安全隱患，方案已得到了成功驗證。雖然尚未最終達到去除免疫排斥的目的[8]，但一旦培育出對人體沒有免疫識別的豬器官，就意味著患者對豬器官的免疫排斥不復(fù)存在。

4 精密編輯解決了藥物耐受問題

4.1 藥物耐受對患者的危害關(guān)乎社會穩(wěn)定

世界各國對藥物的研發(fā)都不遺余力，花費了大量的財力、物力和人力。然而，臨床研究表明，由于持續(xù)用藥導(dǎo)致人體和病原體對藥物產(chǎn)生了抵抗，使原來研發(fā)的投資幾近失效，也導(dǎo)致大量患者的生命無法挽回，使得政府必須再投資研發(fā)新藥。大量資金的重復(fù)投入，已受到社會的極大關(guān)注。近幾年CRISPR技術(shù)的突破，克耐藥機理的研究成果為徹底解決這一難題帶來了希望。

目前抗生素和抗癌藥的耐受是醫(yī)藥領(lǐng)域亟待解決的重大問題?？股?，抗癌藥等很多藥物在施用早期對疾病治療是有效的，由于長期的使用或者其他原因使得用藥劑量加大，甚至導(dǎo)致機體出現(xiàn)免疫耐受，使藥物的療效大大降低。原本治療效果很好的藥物失效或效果明顯降低，不僅對患者有影響，在某些對社會有較大影響的重大疾病上的藥物耐受，在一定程度上也影響社會的穩(wěn)定。

4.2 CRISPR精密編輯攻克藥物耐受篩選新技術(shù)

2013年，MIT團隊利用CRISPR技術(shù)對人類全基因組進行篩選發(fā)現(xiàn)了增敏相關(guān)效應(yīng)基因，對18080個基因設(shè)計了64751個獨特序列，靶向全基因組CRISPR 敲除GeCKO文庫，在人類細胞中能夠進行正向和負向的篩選。他們首先利用 GeCKO 文庫篩選出了對癌癥和多能干細胞細胞活力起作用的關(guān)鍵基因，然后在一個黑素瘤模型中捕捉到腫瘤細胞在細胞增殖的過程中相關(guān)基因表達的改變，利用高通量篩選獲得了維羅非尼(Vemurafenib)有耐藥性敏感的關(guān)鍵基因，包括NF2，CUL3，TADA2B 和 TADA1等效應(yīng)基因[8-10]。CRISPR藥物耐受研究領(lǐng)域做出的關(guān)鍵性貢獻，表明攻克耐藥性的藥物篩選的新時代已經(jīng)來臨。

5 CRISPR的社會前景與展望

德州大學(xué)Olson團隊2018年8月首次在大型動物中以CRISPR大規(guī)模精密編輯肌肉萎縮癥基因，目標(biāo)器官功能恢復(fù)率可達92%，使該技術(shù)在治療人類疾病上前進了一大步。2017年4月費城兒童醫(yī)院(CHOP)的學(xué)者發(fā)文稱發(fā)明了人造子宮系統(tǒng)，該系統(tǒng)在理論上使人類能夠在體外培養(yǎng)著床后發(fā)育的胚胎，在體外培養(yǎng)了羊的胚胎，出生后到1歲，所有羊羔個體都非常健康，大腦和肺部均無異常?？梢酝茰y，體外子宮培養(yǎng)體系的完善將是最終全方位實現(xiàn)CRISPR基因精密編輯的時刻，多位點準確精密修改包括智能、體能、外在美感和內(nèi)在善良的“完美證件照”般的優(yōu)秀個體將是CRISPR基因精密編輯的終極體現(xiàn)。