陳海燕，楊小寶，許大康

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，上海 200025；2.西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院癌癥研究所，陜西 西安 710000）

從腫瘤細(xì)胞到腫瘤微環(huán)境的研究是腫瘤研究領(lǐng)域相當(dāng)重要和關(guān)鍵的部分，對認(rèn)識腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等有著重要的意義，并在腫瘤的診斷、防治和預(yù)后評估中起著重要的作用。腫瘤細(xì)胞是生長不受控制的細(xì)胞，可通過基因突變加速細(xì)胞分裂或抑制正常控制系統(tǒng)（如細(xì)胞周期停滯或程序性細(xì)胞死亡）從而導(dǎo)致癌癥。在腫瘤組織中，除了腫瘤細(xì)胞外，其他成分還包括間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，而間質(zhì)細(xì)胞又包括成纖維細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblast，CAF）、內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，這些共同構(gòu)成了腫瘤的微環(huán)境。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是眾多成分之間相互作用的結(jié)果，其中腫瘤細(xì)胞周圍的間質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)對腫瘤的轉(zhuǎn)移有重要影響，甚至可以用來預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)。免疫治療徹底改變了人類癌癥的治療方法，然而只有15%～20%的患者對免疫療法有反應(yīng)[1]，如果有可篩選適合免疫治療者的新型生物標(biāo)志物，則可通過篩選，對部分患者進(jìn)行針對性的免疫治療，其療效可能會更顯著。

生物標(biāo)志物被定義為正?；虍惓５?、客觀且可量化的生物指標(biāo)，可以幫助疾病診斷、預(yù)后判斷和治療反應(yīng)評價等[2]。生物標(biāo)志物分為七大類，包括易感性及風(fēng)險生物標(biāo)志物、診斷生物標(biāo)志物、監(jiān)測生物標(biāo)志物、預(yù)后生物標(biāo)志物、預(yù)測生物標(biāo)志物、藥效學(xué)及反應(yīng)生物標(biāo)志物、安全生物標(biāo)志物，其可用于腫瘤診斷、預(yù)后判斷或者治療反應(yīng)評價等，是實(shí)現(xiàn)腫瘤個體化治療的關(guān)鍵步驟之一。目前臨床已應(yīng)用了幾種胃腸道惡性腫瘤的生物標(biāo)志物，以幫助患者選擇合適的靶向治療方案和用于監(jiān)測治療反應(yīng)和復(fù)發(fā)?，F(xiàn)隨著免疫療法時代的到來，迫切需要能夠指導(dǎo)腫瘤免疫應(yīng)答的生物標(biāo)志物。目前已探索了來自腫瘤微環(huán)境、腫瘤基因組和來自液體活檢的特征性生物標(biāo)志物，但單一的生物標(biāo)志物診斷價值有限，而與傳統(tǒng)的單一生物標(biāo)志物相比，多重生物標(biāo)志物的使用具有提高判斷準(zhǔn)確率的潛力。另外，尚需要對免疫生物標(biāo)志物進(jìn)行全面分析，以揭示動態(tài)和多方面的抗腫瘤免疫力，并進(jìn)行合理的設(shè)計，制定組合策略，同時開發(fā)新型的生物標(biāo)志物。

本文總結(jié)了生物標(biāo)志物在胃腸道腫瘤中的應(yīng)用，重點(diǎn)介紹新生物標(biāo)志物的開發(fā)在癌癥治療中的預(yù)測和（或）預(yù)后價值。

傳統(tǒng)生物標(biāo)志物在胃腸道腫瘤中的臨床應(yīng)用

一、診斷及預(yù)后評估

1.癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）在 結(jié)直腸癌等腫瘤中的應(yīng)用：目前在臨床中使用的胃腸道腫瘤標(biāo)志物如表1 所示。CEA 是胃腸道最常用的腫瘤標(biāo)志物之一[3]，其過度表達(dá)發(fā)生于＞90%的結(jié)腸直腸癌（colorectal cancer，CRC）和60%的其他類型的癌癥，包括胃癌、肺癌和胰腺癌[4]，故一直被廣泛用作血清腫瘤標(biāo)志物。CEA 的診斷靈敏度和特異度不高，特別是在疾病的早期階段[5]，因此不能作為篩選早期胃腸道癌癥的生物標(biāo)志物。然而，在確診疾病的患者中，血清CEA 的絕對水平與其疾病負(fù)擔(dān)呈相關(guān)[6-7]。研究顯示，CRC 肝轉(zhuǎn)移患者的平均血清CEA 水平為（64±1.6）ng/mL，而CRC 無肝轉(zhuǎn)移患者的平均血清CEA 水平為（2.6±0.8）ng/mL，2 組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示CEA 具有一定的預(yù)后評估價值。

表1 主要生物標(biāo)志物在臨床上的應(yīng)用

2.糖類抗原在胃癌中的應(yīng)用：糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）72-4 是目前診斷胃癌最佳的標(biāo)志物之一[8]，對胃癌有較高的檢出率（93.83%）；而CA19-9 在胰腺癌輔助診斷方面起重要作用，但都特異度不高，中位特異度為82%（68%～91%）[9]。因此，在對消化道腫瘤患者進(jìn)行隨訪的過程中，常需要將CEA、CA72-4、CA242、CA19-9 這4 個指標(biāo)組合在一起，綜合分析，動態(tài)觀察。對腫瘤標(biāo)志物的連續(xù)監(jiān)測、聯(lián)合檢測有助于提高診斷的靈敏度（53.2%）[10]，從而幫助腫瘤的早期診斷。

二、指導(dǎo)靶向藥物應(yīng)用

近年來，隨著科學(xué)研究的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的放、化療相比，腫瘤分子靶向治療的特異性更強(qiáng)，效果更顯著，毒副反應(yīng)也較小。

1.人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）作為胃癌的治療靶點(diǎn)：HER2 是一種酪氨酸激酶受體，屬于表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）家族，是已知的胃食管交界處（gastroesophageal junction，GEJ）腺癌的治療靶點(diǎn)和預(yù)后因素[11]。HER2 二聚體與各自的配體結(jié)合后，通過激活下游信號通路，包括膜受體酪氨酸蛋白激酶信號途徑（RAS/RAF/MAPK）和磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶-B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/AKT/mTOR），可促使HER2異常擴(kuò)增或過表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)展不受控制，研究提示7%～38%的GEJ 腺癌患者存在HER2的擴(kuò)增和（或）過表達(dá)[12]。單克隆抗體曲妥珠單抗可用于治療HER2擴(kuò)增和（或）過表達(dá)的晚期胃或GEJ癌癥患者，且當(dāng)曲妥珠單抗和順鉑合用時效果更好，可使患者的無進(jìn)展生存期（單獨(dú)化療組為5.5 個月、聯(lián)合用藥組為6.7 個月）和總生存期（單獨(dú)化療組11.1 為個月，聯(lián)合用藥組為13.8 個月）延長[13]。

2.以間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子作為胃癌的治療靶點(diǎn)：胃癌靶向治療的另一種生物標(biāo)志物是間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子（cellularmesenchymal to epithelial transition factor，c-MET）。有研究顯示，10%～20%的胃癌患者中存在著MET 基因擴(kuò)增的現(xiàn)象[14-15]。激活的c-MET 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可使癌細(xì)胞增殖、存活和侵襲的能力增強(qiáng)，是一種獨(dú)立的生存預(yù)后因素[16]。MET 基因擴(kuò)增可見于61%的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和35%的小細(xì)胞肺癌患者[17-18]，且MET 基因拷貝數(shù)較高的NSCLC 患者的預(yù)后相對較差[19]。MET 拷貝數(shù)≥5 的人群中位生存期（25.8 個月）明顯短于MET＜5 拷貝/細(xì)胞的人群（中位生存期為47.5 個月，P=0.004 5）。因此，阻斷這些靶點(diǎn)，可有效抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。

三、生存預(yù)后

1.鼠類肉瘤病毒癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene,K-RAS）：在轉(zhuǎn)移性CRC 中，K-RAS 突變狀態(tài)已被廣泛報道為預(yù)后和預(yù)測肝臟轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物，可以在12%～75%的結(jié)腸癌中被鑒定，并在大多數(shù)研究中顯示出與較差的預(yù)后相關(guān)[20]。由于小GTP 結(jié)合蛋白（RAS）致癌基因位于EGFR信號通路的下游，即使EGFR 被阻斷，K-RAS 突變也可導(dǎo)致該途徑的激活[21]。因此，K-RAS 突變狀態(tài)可作為對抗EGFR治療無反應(yīng)的生物標(biāo)志物。遺憾的是，目前尚未成功研制出KRAS 靶向藥物，絕大多數(shù)藥物仍處于一期臨床研究階段。

2.微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（microsatellite instability-high，MSI-H）和錯配修復(fù)功能缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）：微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）指DNA 甲基化或基因突變致錯配修復(fù)基因缺失，從而導(dǎo)致微衛(wèi)星重復(fù)序列長度的改變，表現(xiàn)為同一微衛(wèi)星位點(diǎn)在不同個體之間或同一個體的正常組織與某些異常組織之間，微衛(wèi)星位點(diǎn)的重復(fù)單位的數(shù)目不同，使其不能正常地發(fā)揮調(diào)控作用，導(dǎo)致細(xì)胞增殖及分化異常，促發(fā)惡性腫瘤的形成。大量研究表明，MSI 與CRC、胃癌等的發(fā)生密切相關(guān)，提示MSI 檢測具有多重臨床病理意義。為了防止MSI，機(jī)體自然進(jìn)化出了一套對抗系統(tǒng)，能修復(fù)DNA 錯配，即DNA 錯配修復(fù)（mismatch repair，MMR），其由一系列特異性修復(fù)DNA 堿基錯配的酶（由錯配修復(fù)基因編碼）組成，能夠查出MSI 并進(jìn)行修復(fù)，保證復(fù)制的精確性。如果MMR 修復(fù)機(jī)制出現(xiàn)故障,即dMMR，參與MMR 修復(fù)基因發(fā)生了突變，MMR 修復(fù)能力下降或缺失，個體的自發(fā)突變率將明顯增加。dMMR 在所有CRC 中占15%～20%，在胃癌中占8.5%～20.0%，在食管及胃食管腺癌中占3%～7%，在胰腺癌中占2%～3%[22-23]。一項(xiàng)針對2 630 例癌癥復(fù)發(fā)患者的多變量分析顯示，MSI/dMMR 腫瘤患者相比于微衛(wèi)星穩(wěn)定/錯配修復(fù)MMR 完整患者的復(fù)發(fā)后生存時間更長，調(diào)整后的風(fēng)險比（hazard ratio,HR）為0.82；95%置信區(qū)間（confidence interval,CI）為0.69～0.98；P=0.029[24]。dMMR 已被證明對結(jié)腸癌、胃癌和胰腺癌患者的生存有積極的預(yù)后[25]，例如根據(jù)MSI 狀態(tài)估計250 例胃切除術(shù)患者的卡普蘭-邁耶（kaplan-meier）生存率，微衛(wèi)星穩(wěn)定腫瘤患者的中位生存期為26.7 個月（95%CI 為20.8～32.5 個月），而MSI 腫瘤患者的中位生存期超過觀察期[26]。此外，dMMR可以預(yù)測PD-1 抑制劑的抗癌療效[27]。突變頻率增高會導(dǎo)致腫瘤免疫原性增強(qiáng)，因此dMMR 患者對免疫療法的敏感性較高[28]。

綜上所述，傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物仍存在一定的局限性，目前迫切需要尋找新的靶點(diǎn)及靶點(diǎn)標(biāo)志物以指導(dǎo)腫瘤的診斷和治療。

生物標(biāo)志物的新發(fā)展

前文已經(jīng)總結(jié)了傳統(tǒng)生物標(biāo)志物的特點(diǎn)，下文將闡述近年在生物標(biāo)志物方面取得的新進(jìn)展（總結(jié)見表2）。腫瘤微環(huán)境、腫瘤基因組學(xué)、液體活檢將為消化道腫瘤的早期診斷、療效監(jiān)測和治療提供新的思路。

一、腫瘤微環(huán)境中的生物標(biāo)志物

1.PD-1/PD-L1：在活化的淋巴細(xì)胞（包括T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞）上表達(dá)的PD-1 限制了組織內(nèi)T 細(xì)胞效應(yīng)子的功能。通過上調(diào)PD-1 的配體（PD-L1），腫瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)效應(yīng)T 細(xì)胞凋亡[29]。據(jù)報道，在不同類型的腫瘤中，PD-L1 的表達(dá)率各不相同（14%～100%），無論這些腫瘤是否對PD-1/PD-L1 治療有反應(yīng)[30]。早期研究表明，PD-L1 陽性可以增加患者從PD-1/PD-L1 抑制劑治療中獲益的概率[31]。然而，最近有更多學(xué)者質(zhì)疑了PD-L1 作為有效預(yù)測生物標(biāo)志物的準(zhǔn)確性，因?yàn)槎囗?xiàng)研究均顯示，免疫療法的效能與PD-L1 表達(dá)水平無關(guān)[32]。

表2 新型生物標(biāo)志物的開發(fā)

研究者利用攜帶人類免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠，首次開發(fā)出抗PD-1 [納武單抗（nivolumab），也稱為ONO4538、MDX-1106 或BMS-936558]的完全人源化單克隆抗體（monoclonal antibody,mAb）。納武單抗的同型IgG4 使補(bǔ)體活性或抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性最小化[33]。該抗體在IgG4 恒定區(qū)的228 位進(jìn)行絲氨酸到脯氨酸的替換，使抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性對活化T 細(xì)胞的作用最小。納武單抗的臨床試驗(yàn)于2006 年在美國開始，2009 年在日本開始被應(yīng)用于臨床。納武單抗的一期臨床研究顯示，其對NSCLC 的累積有效率為18%，黑素瘤為28%，腎癌為27%，14%的患者出現(xiàn)3 級或4 級藥物相關(guān)不良事件[34]。值得注意的是，與細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4 的單抗伊匹單抗相比，納武單抗作為單一藥物已顯示出持久的臨床活性，且不良反應(yīng)要少得多[34-35]。

迄今為止，超過500 項(xiàng)使用PD-1 信號抑制劑的臨床研究已經(jīng)在至少20 種實(shí)體和血液惡性腫瘤上使用了8 家制藥公司的9 種抗體[36]。根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院管理的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫顯示，全世界受試者總數(shù)超過20 000 人（https：//clinicaltrials.gov/[CTG]）。美國食品和藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）于2014 年批準(zhǔn)納武單抗用于不可切除或轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者，2015 年批準(zhǔn)其用于NSCLC 患者，2016 年批準(zhǔn)用于經(jīng)典霍奇金淋巴瘤和腎癌患者。FDA 還于2014 年批準(zhǔn)派姆單抗（pembrolizumab）用于治療黑素瘤，并于2015 年批準(zhǔn)其用于治療NSCLC?？筆D-L1 于2016 年被批準(zhǔn)用于不能切除的膀胱癌和NSCLC。

然而，目前的研究仍有一些局限性。PD-L1 陽性僅是派姆單抗治療NSCLC 患者的必要條件，免疫組化檢測PD-L1陰性的患者仍可以通過抗PD-1 或抗PD-L1 治療獲得臨床療效。在大多數(shù)研究中觀察到，PD-L1 陰性腫瘤患者的反應(yīng)通常在11%～20%之間，納武單抗單藥治療的總反應(yīng)高達(dá)41%。由于腫瘤具有異質(zhì)性，例如同一個病灶的不同位置以及不同病灶之間的PD-L1 表達(dá)不同，治療的不同階段，不同的治療方式均會影響PD-L1 的表達(dá)。此外，不同平臺檢測PD-L1 水平不一致性，檢測方法也存在較大差異?，F(xiàn)如今尚未有統(tǒng)一的方案，仍需進(jìn)一步探究。更為嚴(yán)重的是PD-1 阻斷治療帶來的免疫相關(guān)不良事件，包括間質(zhì)性肺炎、伴有胃腸道穿孔的結(jié)腸炎、1 型糖尿病、嚴(yán)重皮膚反應(yīng)、免疫性血小板減少、皮質(zhì)類固醇治療后中性粒細(xì)胞減少和敗血癥、腦病和神經(jīng)后遺癥、格林-巴利綜合征、脊髓炎、重癥肌無力、心肌炎和心功能不全、急性腎上腺功能不全和腎炎等[37-40]。綜上所述，PD-L1 因其局限性不是一種完備的預(yù)測免疫治療的生物標(biāo)志物，但其仍具有很大的參考價值。

2.腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞：腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte,TIL）代表具有抗腫瘤潛力的適應(yīng)性免疫的有效機(jī)制，已顯示其與各種類型的癌癥預(yù)后及對免疫療法的反應(yīng)相關(guān)[41]。自體TIL 的過繼細(xì)胞治療具有悠久的歷史，在轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者中具有豐富的臨床應(yīng)用。TIL 治療利用了腫瘤中的天然存在的腫瘤反應(yīng)性T 細(xì)胞，代表一種個體化治療，因?yàn)門IL 是從患者自身的腫瘤組織中分離出來的，并在體外激活和擴(kuò)增后重新注入。在進(jìn)行TIL 輸注之前，需先進(jìn)行預(yù)處理——淋巴清除化療，然后輸注白細(xì)胞介素2。多個獨(dú)立的研究中心報道，10%～20%的患者腫瘤完全消退，且客觀反應(yīng)率高達(dá)50%[42-45]。先前針對TIL 治療其他實(shí)體瘤的試驗(yàn)顯示其成功率有限，但免疫治療策略的最新進(jìn)展激發(fā)了人們對開發(fā)這種方法用于其他適應(yīng)證的興趣。TIL 治療現(xiàn)已在其他選定的實(shí)體瘤中顯示出臨床活性[46-47]，并在其他組織學(xué)中進(jìn)行了測試，包括卵巢癌、腎細(xì)胞癌、CRC、胰腺癌、肝細(xì)胞癌、膽管癌和胃癌。越來越多的證據(jù)支持卵巢癌和腎細(xì)胞癌作為實(shí)施TIL 治療的候選。在CRC 中，免疫細(xì)胞的類型、密度和位置，特別是細(xì)胞毒性和記憶T 細(xì)胞（HR=0.585,95%CI 為0.362～0.946，P＜0.01），能比TNM 分期（HR=3.803,95%CI 為1.179～12.274，P＜0.05）更好地預(yù)測生存期[48]。在T 細(xì)胞浸潤程度相似的CRC 中，CD103+記憶T 細(xì)胞比例最高的腫瘤預(yù)后最好[49]。CD103+CD8+T 細(xì)胞高度浸潤患者與低度浸潤患者相比，總生存期顯著延長（HR=3.418，95%CI 為1.020～11.45，P＜0.05）。

為了標(biāo)準(zhǔn)化評估CRC 中TIL 的方法，研究者提出了一種測量單核細(xì)胞在蘇木精-伊紅染色區(qū)間基質(zhì)區(qū)域所占面積的新方法。這種方法的結(jié)果證實(shí)，TIL 的密度是CRC 中有用的預(yù)后因素[50]。肝癌TIL 中自然殺傷細(xì)胞比例[（11.8±8.1）%]顯著低于周圍組織[（18.0±7.9）%]。癌巢浸潤密度低者的無瘤生存率（P=0.027）及總生存率（P=0.005）明顯低于密度高者[50]。在Epstein-Barr 病毒（EB 病毒）相關(guān)的胃癌中，證實(shí)了腫瘤內(nèi)高TILs、低PD-L1 表達(dá)與更長的無病生存期之間的關(guān)聯(lián)[51]。最近有結(jié)果顯示，利用18 個基因特征的T 細(xì)胞炎癥基因表達(dá)譜評分與胃/GEJ 癌癥的派姆單抗治療療效顯著相關(guān)[客觀緩解率（P=0.012,n=203），無進(jìn)展生存期（P=0.017,n=203）][52]，在T 細(xì)胞炎癥基因表達(dá)譜評分和PD-L1 表達(dá)之間發(fā)現(xiàn)顯著但非線性的關(guān)聯(lián)（r=0.40,P＜0.001）。這些結(jié)果表明，與PD-L1 表達(dá)相關(guān)的T 細(xì)胞炎癥基因表達(dá)譜分析有作為胃/GEJ 癌癥中選擇治療的生物標(biāo)志物的可能。

3.免疫抑制性骨髓細(xì)胞：腫瘤相關(guān)的髓樣細(xì)胞不僅會產(chǎn)生抑制或無反應(yīng)的環(huán)境，阻斷T 細(xì)胞功能和增殖，還可通過加速腫瘤干細(xì)胞生長、血管生成、基質(zhì)沉積、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移促進(jìn)癌癥。腫瘤內(nèi)和循環(huán)骨髓來源的抑制細(xì)胞的積累已被證明與胃癌的疾病進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)。例如一項(xiàng)54 例胃癌患者研究發(fā)現(xiàn)，外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞與CD4+T 細(xì)胞的比率與胃癌臨床分期、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05）[53]。

骨髓細(xì)胞對先天免疫反應(yīng)也很重要。單一骨髓標(biāo)志物不可能預(yù)測免疫反應(yīng)療效，需要開發(fā)多重生物標(biāo)志物分析，用于標(biāo)記臨床試驗(yàn)前的免疫抑制性骨髓細(xì)胞，以預(yù)測其免疫療效。

二、腫瘤基因組學(xué)中的生物標(biāo)志物

1.基因panel：基因panel 靶向測序是一種用于鑒定可能靶向基因組的新興方法，并與治療相匹配?；騪anel 同時檢測多個位點(diǎn)、多個基因，而這些位點(diǎn)和基因需要按照統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行選擇和組合，從而構(gòu)成一個檢測panel，目前仍存在著一些挑戰(zhàn)。例如紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心（Memorial Sloan KetteringCancerCenter）開發(fā)了一種靶向基因測序panel，最初包括341 個基因，現(xiàn)已擴(kuò)展到410 個癌癥相關(guān)基因。然而研究的225 例需要治療的前列腺癌患者中，只有3 例（1%）與基于測序結(jié)果的治療相匹配[54]，2 例無益處，1 例患者反應(yīng)不明確。將測序結(jié)果實(shí)際應(yīng)用于指導(dǎo)個體治療，目前僅限于胰腺癌患者，其他腫瘤中的應(yīng)用尚未成熟，未來可以在其他腫瘤中進(jìn)行嘗試。

2.腫瘤突變負(fù)荷：研究顯示腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden，TMB）與各種類型癌癥的免疫檢查點(diǎn)阻斷的臨床獲益顯著相關(guān)[55]，TMB 越高，患者從免疫治療中的獲益可能越多。然而，大多數(shù)胃腸道癌癥的突變負(fù)荷較低[56]，但MMR 缺乏者除外。一項(xiàng)包含了1 375 例各種胃腸道腫瘤患者的研究顯示，結(jié)腸癌具有高的TMB、MSI-H 和（或）微衛(wèi)星穩(wěn)定性，而那些突變頻率較高的人被發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性新抗原具有更豐富的CD8+T 淋巴細(xì)胞浸潤和更高的調(diào)節(jié)分子表達(dá)（細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4、PD-1、淋巴細(xì)胞激活基因3 和吲哚胺2,3-雙加氧酶1）[57]。在晚期胃癌患者中，TMB是接受PD-1 單抗治療的潛在療效預(yù)測標(biāo)志物，高TMB 患者（位于前20%的TMB≥12 muts/Mb）的有效率（33.3%對7.1%,P=0.017）及總生存時間[14.6 個月對4.0 個月，HR=0.48 (96%CI 0.24～0.96),P=0.038]均明顯優(yōu)于低TMB 患者（TMB＜12 muts/Mb）[58]。因而，含有TMB 的患者更易受益于免疫療法。

三、液體活檢中的生物標(biāo)志物

明確診斷需要腫瘤組織活檢，但其并不能用于監(jiān)測治療反應(yīng)[59]。外周血生物標(biāo)志物的分析，包括循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）和外泌體，其采用的非侵入性方法稱為液體活檢，已成為克服腫瘤組織活組織檢查限制的一種方法，并在監(jiān)測復(fù)發(fā)和治療效果方面顯示出巨大潛力。有研究調(diào)查了原發(fā)性胃癌患者8 個原癌基因中的68 個ctDNA 突變熱點(diǎn)后發(fā)現(xiàn)，疾病晚期ctDNA 與5 年總生存期顯著降低有關(guān)（5.6%比31.5%，P=0.028）[60]。

1.ctDNA：ctDNA 主要由活躍生長的癌細(xì)胞死亡而釋放，也可直接從循環(huán)腫瘤細(xì)胞中分泌[61]。值得注意的是，ctDNA 可以為腫瘤進(jìn)化和動態(tài)疾病監(jiān)測提供全面的基因組分析[62]。在CRC 中，ctDNA 已被證明能成功地收集EGFR 靶向治療患者的實(shí)時進(jìn)化分子。ctDNA 分析不僅可以識別可能導(dǎo)致EGFR 阻斷抗性改變的基因，還可以指導(dǎo)選擇可能對靶向藥物有反應(yīng)的罕見患者群體。在確診時可檢測到ctDNA水平的3 例患者中，手術(shù)切除后其水平降低，而姑息治療期間復(fù)發(fā)或進(jìn)行性疾病同時升高。在另一個隊(duì)列中觀察到了類似的趨勢，4 例患者術(shù)后等位基因突變頻率下降[63]。因此，治療期間ctDNA 水平的變化也可能是評價臨床免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療效果的指標(biāo)。

2.CTC：CTC 是血流中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。一項(xiàng)回顧性研究結(jié)果顯示，經(jīng)過治療的25 例Ⅰ～Ⅲ期CRC 患者中，ctDNA陽性患者的2 年無復(fù)發(fā)生存率（recurrence-free survival，RFS）為66%，而陰性者的2 年RFS 為100%[64]，進(jìn)而表明其存在與患者的總生存期或無進(jìn)展生存期降低相關(guān)。此外，還有研究報道了CTC 作為監(jiān)測治療反應(yīng)和檢測復(fù)發(fā)的治療靶點(diǎn)的價值。然而，鑒于該患者群體中CTC 的稀缺性，CTC 的預(yù)后和預(yù)測作用尚未在非轉(zhuǎn)移性環(huán)境中建立。

3.外泌體：外泌體是內(nèi)體衍生的細(xì)胞外囊泡，直徑為30～120 nm，攜帶一批蛋白質(zhì)、代謝物、RNA（包括mRNA、miRNA、lncRNA）、DNA（包括mtDNA、ssDNA 和dsDNA）和脂質(zhì)[65-66]，是液體活檢標(biāo)志物作為生物標(biāo)志物的重要來源。據(jù)報道，首次將外泌體作為生物標(biāo)志物是在8 例腎細(xì)胞癌患者和8 例健康志愿者的樣本中進(jìn)行的[67]。Zhang 等[68]研究了胃癌細(xì)胞的外泌體，發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移者體內(nèi)的外泌體水平升高。胃癌患者的血清外泌體水平比健康受試者高，且血清中的外泌體數(shù)量與胃癌分期呈正相關(guān)。盡管外泌體在非侵入性早期檢測和潛在治療方面具有很大前景，但仍具有一些局限性。外泌體生物學(xué)面臨的最大挑戰(zhàn)之一是如何準(zhǔn)確測量外泌體的數(shù)量和純度。只有一小部分細(xì)胞外囊泡攜帶相關(guān)的通訊內(nèi)容，因此其實(shí)際效率難以檢測。此外，需要更多地了解細(xì)胞外囊泡亞型的特定標(biāo)志物和每種類型細(xì)胞外囊泡的基本作用，以更好地了解其在各種疾病環(huán)境中的應(yīng)用。

生物標(biāo)志物研究的前景

在臨床中僅有少數(shù)生物標(biāo)志物可用于治療胃腸道惡性腫瘤，盡管目前已經(jīng)鑒定了許多用于胃腸道惡性腫瘤的新的生物標(biāo)志物，但尚未得到相關(guān)臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證。另一方面，指導(dǎo)患者選擇適當(dāng)?shù)闹委?，進(jìn)行生物標(biāo)志物測定是非常必要的，但如未構(gòu)建適當(dāng)?shù)纳飿?biāo)志物對患者進(jìn)行選擇，會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)療法的臨床試驗(yàn)終點(diǎn)時未能滿足要求。因此，在建立適當(dāng)?shù)纳飿?biāo)志物測定之前，不應(yīng)推進(jìn)實(shí)驗(yàn)性治療劑的開發(fā)。因此，在未來生物標(biāo)志物的開發(fā)應(yīng)與藥物開發(fā)同時進(jìn)行，每當(dāng)確定潛在的治療靶標(biāo)時，應(yīng)伴隨開發(fā)生物標(biāo)志物測定法。

對于免疫療法，單個生物標(biāo)志物通常不足以預(yù)測治療反應(yīng)。免疫生物標(biāo)志物的綜合分析不僅可以提供組合免疫療法的合理設(shè)計，還可以鑒定多種免疫生物標(biāo)志物，并隨后開發(fā)多重檢測，以共同評估多種免疫生物標(biāo)志物。腫瘤標(biāo)志物的開發(fā)、組合亦對精準(zhǔn)醫(yī)療、診斷大有裨益。遺憾的是，目前的生物標(biāo)志物檢測方法缺乏必要的診斷靈敏度和特異度，因此迫切需要開發(fā)新的無創(chuàng)、特異且靈敏的生物標(biāo)志物,以提高患者的依從性，并能更有效地追蹤臨床疾病的發(fā)展過程及治療反應(yīng)。綜合應(yīng)用多個標(biāo)志物會比單方面標(biāo)志物更為全面可靠。