鄒昭琪 許彤彤 何川 豐懿恬 牛林 鄒蕊

牙槽骨是人體骨骼最活躍的部分，具有高度可塑性，其生長代謝受到牙生長發(fā)育、脫落替換、雌激素水平[1-2]及咬合壓力的影響。咬合壓力由上下頜牙咬合時咀嚼肌群的肌力產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)[3-7]咬合力改變可引起牙槽骨形態(tài)以及微結(jié)構(gòu)變化，但在既往研究[8-14]中，干預咬合力的手段及時間并不統(tǒng)一，研究者通常選擇較長的干預時間，且不同研究組選擇的時間變化跨度較大，無法確定某一干預手段下咬合力改變引起牙槽骨發(fā)生變化的始末。Micro-CT是微米級高效、無損檢測設(shè)備，可清晰再現(xiàn)牙槽骨的內(nèi)部及外部結(jié)構(gòu)，精確地對其進行定量分析，目前廣泛用于牙槽骨微結(jié)構(gòu)觀察[15-17]，下頜第一磨牙的牙槽間隔作為明顯的咬合力集中區(qū)常作為骨小梁形態(tài)學測定的感興趣區(qū)域[18]。本實驗擬通過飲食法[11]干預雄性大鼠咬合力后，在不同時間點利用Micro-CT對其牙槽骨微結(jié)構(gòu)發(fā)育進行時序性觀察，驗證咬合力改變對牙槽骨微結(jié)構(gòu)發(fā)育的影響，并探究其產(chǎn)生影響的時間節(jié)點。從而為對牙槽骨微結(jié)構(gòu)改變的進一步深入研究提供可靠的造模方法以及干預時間的選擇依據(jù)，節(jié)省實驗時間，提高研究效率。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用23 d齡的雄性SD大鼠63 只， SPF級，由西安交通大學實驗動物中心提供。

1.2 主要實驗設(shè)備及試劑

Micro-CT(Y.XLON公司，型號Y.Cheetah，德國); 軟件VG studio Max3.0(Volume Graphics公司，德國); 戊巴比妥、 4%多聚甲醛(西安國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組 選用23 d齡剛離乳，未行任何咀嚼運動的雄性SD大鼠63只，隨機分為基線(Baseline)組7只、軟食(SD)組28 只和硬食(HD)組28只。硬食組統(tǒng)一喂養(yǎng)標準鼠飼料，軟食組統(tǒng)一喂養(yǎng)由與硬食組同種等重量鼠飼料磨成的粉末與飲用水的混合物(2∶1)。各組動物飲水自由，飼養(yǎng)條件嚴格一致，定期記錄體重。基線組大鼠于當日處死。SD組和HD組大鼠分別在實驗開始后第2 周、 第4 周、 第6 周、 第8 周各處死7 只。

1.3.2 Micro-CT掃描組標本制備 按照上述各組的節(jié)點，給相應的大鼠腹腔注射過量戊巴比妥，采用4%多聚甲醛灌注左心室的方式先行內(nèi)固定后，分離取出大鼠下頜骨并置于4%多聚甲醛中行后固定， 4 ℃保存24 h。后將樣本置于固定期內(nèi)，進行掃描，掃描參數(shù)：電壓90 kV，電流30 μA，投影數(shù)720，曝光時間600 ms，分辨率5 μm，使用專業(yè)軟件VG studio Max3.0進行三維重建。

1.3.3 觀察指標 Micro-CT掃描獲得各組樣本的圖像后，進行三維重建，在大鼠下頜第一磨牙牙槽間隔區(qū)近根分叉的松質(zhì)骨選擇半徑為400 μm、高度1 mm的圓柱體設(shè)定為感興趣區(qū)域(Region of interest, ROI)(圖 1～2)，上界為第一磨牙的根分叉，做定量分析，測量指標包括：骨體積/總體積(BV/TV,%)，骨表面積/總體積(BS/BV,1/mm)，平均骨小梁厚度(Tb.Th, mm)，平均骨小梁數(shù)量(TbN,1/mm)，平均骨小梁間距(Tb.Sp,mm)。

1.4 統(tǒng)計學分析

圖 1 下頜骨ROI矢狀面Fig 1 ROI on the sagittal plane of the mandible

圖 2 ROI三維重建圖像Fig 2 3D reconstruction image of ROI

使用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析， 首先對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗。組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗； 若P<0.05， 則表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

實驗中SD組及HD組的大鼠體重變化僅與年齡相關(guān)，同一時間節(jié)點下，SD組與HD組的大鼠體重差異無統(tǒng)計學意義。

2.1 Micro-CT掃描參數(shù)分析結(jié)果

23 d齡的大鼠下頜第一磨牙Micro-CT矢狀面影像顯示，隨著日齡增加，第一磨牙的牙根逐漸增長，根尖孔從第6 周開始逐漸閉合，根分叉區(qū)牙槽間隔松質(zhì)骨密度增加；與SD組相比，同一時間節(jié)點下的HD組根分叉區(qū)牙槽間隔松質(zhì)骨骨量較多(圖 3)。

2.1.1 SD組與HD組的樣本ROI的骨體積分數(shù)(BV/TV)均隨年齡的增長不斷增加。 第2、 4、 6、 8 周， SD組的BV/TV分別為0.36±0.42、 0.43±0.19、 0.49±0.03、 0.52±0.02， 分別為HD組的78.26%、79.63%、73.13%、75.36%，差異均具有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖 4A)。

2.1.2 SD組與HD組樣本ROI的骨表面積體積比(BS/BV)均隨著年齡增長整體呈下降趨勢，第0～2 周下降速度最快，但第2～4 周2 組BS/BV均升高。 第2、 4、 6、 8 周， SD組的BS/BV分別為30.65±4.13、 34.64±0.82、 25.73±1.79、 24.76±2.29，分別為HD組的1.15、1.22、1.42、1.31倍，其中第2 周的差異無統(tǒng)計學意義，第4、 6、 8 周的差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖 4B)。

2.1.3 SD與HD組樣本ROI平均骨小梁數(shù)量(TbN)在0～2 周呈下降趨勢，在第2～4 周升高。 第2、 4、 6、 8 周， SD組的TbN(5.61±0.35、7.60±0.15、 6.40±0.47、 6.53±0.8)均低于HD組(6.07±0.43、 7.65±0.95、 6.95±0.91、 6.83±0.42)， 但差異無統(tǒng)計學意義(圖 4C)。

A: Baseline組; B： 2 周SD組; C： 2 周HD組; D： 4 周SD組; E： 2 周HD組; F： 6 周SD組; G： 6 周HD組; H： 8 周SD組; I： 8 周HD組A： Baseline group; B： SD group at week 2; C： HD group at week 2; D： SD group at week 4; E： HD group at week 4; F： SD group at week 6; G： HD group at week 6; H： SD group at week 8; I： HD group at week 8

2.1.4 SD組與HD組樣本ROI平均骨小梁厚度(Tb.Th)整體呈上升趨勢，但在2～4 周下降。 第2、 4、 6、 8 周， SD組的Tb.Th分別為0.066±0.087、 0.058±0.001、 0.078±0.005、 0.084±0.004，分別為HD組的86.84%、82.86%、69.03%、82.35%，其中第2周差異無統(tǒng)計學意義，第4、 6、 8 周的差異有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05)(圖 4D)。

2.1.5 SD組與HD組樣本ROI的平均骨小梁間距(Tb.Sp)在第0～2 周增大，第2～4 周減小， 第4～6 周略有上升。第2、 4、 6、 8 周， SD組的Tb.Sp分別為0.115±0.01、0.079±0.003、0.082±0.006、0.078±0.0011，分別為HD組的1.26、1.27、1.28、1.08倍，其中第8周的差異無統(tǒng)計學意義，第2、 4、 6 周的差異有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05)(圖 4E)。

綜上所述，在第2、 4、 6、 8 周，與HD組相比，SD組的BV/TV、Tb.Th、TbN減??； BS/BV、Tb.Sp增大。其中TbN的差異在4 個時間節(jié)點均無統(tǒng)計學意義， BV/TV、 Tb.Th、BS/BV、Tb.Sp在多個時間節(jié)點有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。

喂食后第0～2 周、 4～8 周，SD組與HD組的BV/TV、 Tb.Th、 Tb.Sp增大， BS/BV、 TbN減小；喂食后第2～4 周， BV/TV、 BS/BV、 TbN 增大， Tb.Th、 Tb.Sp減小。

3 討 論

3.1 飲食法模型的可靠性

咬合力可通過牙齒傳遞至牙槽骨，為了觀察咬合力對牙槽骨的影響，國外學者建立了幾種模擬不同咬合力狀態(tài)的動物模型， ① 磨牙法[8]、 ② 拔牙法[9-10]、 ③ 飲食法[11]、 ④ 固定橋修復法[12]、 ⑤ 肌肉切除法[13]。其中飲食法是將部分大鼠喂以硬食，使咀嚼肌的功能增強，產(chǎn)生的咬合力增大，將部分大鼠喂以軟食，使咀嚼肌的功能減弱，產(chǎn)生的咬合力降低； 該方法無創(chuàng)傷且簡單易行，因此本實驗采用飲食法[11]模型觀察咬合力對剛離乳大鼠牙槽骨微結(jié)構(gòu)發(fā)育的影響。結(jié)果表明，剛離乳的23 d齡的大鼠在喂養(yǎng)后第2、 4、 6、 8 周，相比HD組大鼠，SD組大鼠的第一磨牙牙槽間隔近根分叉處的松質(zhì)骨骨量下降，骨小梁變細、變稀疏，骨髓腔變大。說明咀嚼肌產(chǎn)生的咬合力是影響牙槽骨微結(jié)構(gòu)發(fā)育的重要因素，證實了飲食法模型的可靠性。

圖 4 Micro-CT掃描參數(shù)分析Fig 4 Analysis of the data of Micro-CT scanning

3.2 牙槽骨微結(jié)構(gòu)發(fā)育的時序變化

在咬合力影響牙槽骨發(fā)育的研究中，Tanaka等[19]將雄性3 周齡的Wistar大鼠分軟、硬食組觀察9 周，通過Micro-CT觀察發(fā)現(xiàn)軟食組下頜骨髁突松質(zhì)骨的礦化程度較硬食組明顯更低。此后，Bresin等[20]將年輕大鼠分軟、硬食兩組喂養(yǎng)4周發(fā)現(xiàn)，軟食組第一磨牙牙槽間隔的松質(zhì)骨骨密度減小、下頜骨骨量減小。近些年，Hichijo等[21]用 10 只 21 d齡的雄性Wistar大鼠，分軟、硬食兩組喂養(yǎng)11 周，發(fā)現(xiàn)軟食組在髁突和咬肌附著處的骨體積分數(shù)(BV/TV)顯著低于硬食組。Shimizu等[22]將3周齡雄性Wistar大鼠分軟、硬食兩組喂養(yǎng)9 周，用Micro-CT檢測發(fā)現(xiàn)軟食組下頜第一磨牙牙槽間隔的BV/TV、Tb.Th、TbN顯著減小，與本研究結(jié)果一致。

以上研究都僅描述了某一時間節(jié)點咬合力對牙槽骨形態(tài)或結(jié)構(gòu)的影響，而關(guān)于牙槽骨的連續(xù)性變化的研究目前相對較少。因此本研究選取0、 2、 4、 6、 8 周作為對咬合力影響牙槽骨微結(jié)構(gòu)發(fā)育觀察的時間點，發(fā)現(xiàn)其影響在軟食組和硬食組具有一致性：①在喂食后0～8周，牙槽骨微結(jié)構(gòu)的發(fā)育表現(xiàn)為隨著大鼠日齡的增加，ROI內(nèi)BV/TV逐漸增大，表明這個時段大鼠第一磨牙牙槽間隔近根分叉處的松質(zhì)骨骨量增多；② 在喂食后0～2 周、 4～8 周，ROI區(qū)域內(nèi)Tb.Th、Tb.Sp增大說明樣本骨小梁變粗，變稀疏，骨髓腔變大。表明這個時段大鼠第一磨牙牙槽間隔近根分叉處的松質(zhì)骨生長以整體的膨脹性生長為主；③ 值得注意的是，在喂食后第2～4 周，ROI內(nèi)BS/BV增大，說明骨量增加但骨表面積增量更大；Tb.Sp減小說明骨小梁變密集，骨髓腔變小。此外，ROI內(nèi)Tb.Th減小、TbN 增大，導致這一變化的原因可能是新生骨小梁增多，以上結(jié)果表明這一時期的大鼠第一磨牙牙槽間隔近根分叉處的松質(zhì)骨生長以骨小梁的生長為主。④在喂食后第8周，樣本ROI的TbN、Tb.Th、Tb.Sp趨于一致，可能由于8 周后骨小梁的生長逐漸完成，有待研究證實。在通過以上對牙槽骨微結(jié)構(gòu)發(fā)育的時序變化特點的進一步了解，可幫助后續(xù)的相關(guān)研究選擇更具有針對性的時間節(jié)點。

4 結(jié) 論