梁峰豪,郎麗娜，劉亞萍，王 靜，張 鶴，徐愛遐，黃 鎮(zhèn)

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.山東省農(nóng)業(yè)廳種子管理總站，山東 濟(jì)南 250000)

根腫病是蕓薹屬根腫菌引起的土傳性真菌病害，專性危害十字花科植物的根部[1]。感病后的植株在其根部形成大小不等的腫瘤，地上葉片萎垂，植株生長(zhǎng)緩慢，最終造成產(chǎn)量損失25%左右，嚴(yán)重發(fā)病區(qū)產(chǎn)量損失高達(dá)60%[2-3]。若土壤一旦被根腫菌污染，由于休眠孢子存活力較強(qiáng)，將無法種植十字花科的植物，嚴(yán)重危害十字花科植物的生產(chǎn)[4]。根腫病始發(fā)于地中海和歐洲南部地區(qū)[5]，當(dāng)前在我國(guó)安徽、四川、山東、廣東、重慶、北京等省市地區(qū)均有發(fā)生，隨著農(nóng)業(yè)機(jī)械化程度的提高，發(fā)病面積逐年急劇增加[6]。根腫菌屬小種分化專性寄生菌，1931年Honig首次證明了該病原菌存在生理小種分化。目前國(guó)際上廣為認(rèn)可的根腫菌生理小種鑒別系統(tǒng)有2個(gè)，即Williams 系統(tǒng)和ECD系統(tǒng)[7]。在中國(guó)尚沒有研究出適合國(guó)內(nèi)根腫病菌生理小種鑒定的鑒別寄主系統(tǒng)。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究根腫病菌生理小種通常采用Williams鑒別系統(tǒng)。丁云花、季海雯、費(fèi)維新等[8-10]曾先后用Williams系統(tǒng)對(duì)我國(guó)根腫菌進(jìn)行生理小種鑒定，共鑒定出2、4、5、7、13號(hào)5個(gè)生理小種，并指出我國(guó)目前主要以4號(hào)生理小種為主。

甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.) 是世界上種植面積最廣的油料作物，也是我國(guó)目前主要種植的油菜類型，具有產(chǎn)量高，抗病蟲、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[11]，但是對(duì)于甘藍(lán)型油菜抗根腫病材料的報(bào)道卻很少。一些研究者已經(jīng)在蘿卜、甘藍(lán)、蕪菁、黑芥、白芥等油菜的近緣物種中發(fā)現(xiàn)了抗根腫病的種質(zhì)，并利用遠(yuǎn)緣雜交和人工合成的方法，將這些近緣物種的抗性基因?qū)氲礁仕{(lán)型油菜中，合成了多份抗根腫病的油菜中間材料[12]。但是截至目前極少有合成抗根腫病的甘藍(lán)型油菜品種的報(bào)道。自20世紀(jì)90年代以來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)白菜抗根腫病基因主要來源于歐洲蕪菁，且各抗性基因之間都保持相對(duì)獨(dú)立[13]。目前，在大白菜中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)8個(gè)根腫病抗性基因，分別為Crr1、Crr2、Crr3、Crr4、CRa、CRb、CRc和CRk[14-18]，這些CR基因均表現(xiàn)為顯性單基因遺傳。

由于根腫菌存在較為復(fù)雜的生理機(jī)制及小種分化，所以篩選種質(zhì)資源，并將抗性基因轉(zhuǎn)移，進(jìn)而開展抗病育種工作是解決根腫病最有效的方法之一[19]。本研究的目的是從收集到的30份十字花科材料中篩選出抗根腫病種質(zhì)，同時(shí)將獲得的抗性種質(zhì)與感病甘藍(lán)型油菜育種骨干親本雜交，將根腫病抗性基因?qū)氲礁胁〉母仕{(lán)型油菜中，并對(duì)雜種后代進(jìn)行真假雜種鑒定，旨在為甘藍(lán)型油菜根腫病抗性育種提供材料支持。

表1 30份十字花科供試材料及來源Tab.1 The name and origin of the 30 cruciferae varieties

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于種質(zhì)篩選的供試材料為30份十字花科種質(zhì)(表1)，包括3份蘿卜、4份白菜、1份甘藍(lán)、9份白菜型油菜、10份甘藍(lán)型油菜和3份歐洲蕪菁，供試菌種為四川成都4號(hào)根腫菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菌液制備與接種篩選

本試驗(yàn)病原菌種是由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)樸鐘云課題組提供的采于四川成都白菜根腫病病根，-20 ℃保存?zhèn)溆谩＞褐苽鋮⒖夹こ鐒?、郭向華[20]的方法：取50 g根腫粉碎，加蒸餾水?dāng)嚦蓜驖{；用8層尼龍網(wǎng)過濾后將濾液500 r/min，離心5 min，取上清液及上層灰色沉淀；再將獲得的上清液及上層灰色沉淀3 000 r/min離心10 min；將獲得的沉淀物利用血球計(jì)數(shù)器和光學(xué)顯微鏡稀釋孢子到1×107個(gè)/mL，并調(diào)pH值6.2作為原培養(yǎng)液。

將30份供試材料播種于50(5×10)穴盤中，每份材料播10穴，每穴播1粒種子，2次重復(fù)。出苗后3 d用注射法對(duì)其根部注射5 mL菌液，繼續(xù)培養(yǎng)，35 d后統(tǒng)計(jì)抗感病株數(shù)及抗病等級(jí)。根腫病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考Kuginuki等[21]的標(biāo)準(zhǔn)(表2)。

表2 根腫病發(fā)病調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 The grading standard of clubroot resistance

1.3 病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)與數(shù)據(jù)分析

按下列公式計(jì)算出根腫病發(fā)病率和發(fā)病指數(shù)[21]：

抗性分級(jí)以病情指數(shù)劃分參照李妍等[22]的標(biāo)準(zhǔn)如下：高抗(HR)：病情指數(shù)=0；抗病(R)：病情指數(shù)<10；中感(MS)：10≤病情指數(shù)≤20；感病(S)：20≤病情指數(shù)≤50；高感(HS)：病情指數(shù)>50。

1.4 雜交授粉與雜種培育

以篩選獲得的抗性材料歐洲蕪菁Debra作父本，感病材料甘藍(lán)型油菜作母本，采用花期重復(fù)授粉[23]的方法配制雜交組合。在雜交之前，去除母本已經(jīng)開放的花以及較小的花蕾，剝蕾、去雄。取套袋父本花藥，均勻涂抹于母本柱頭上，授粉后套袋、掛牌。第1次授粉3 d后，重復(fù)授粉1次。種莢成熟后，采收、脫粒。

為提高雜種成活率，采用組培方法培養(yǎng)雜種苗。將獲得的雜種70%乙醇消毒1 min，無菌水沖洗4～5次，接種于MS培養(yǎng)基上，組培箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度25 ℃，光周期16 h/8 h，光強(qiáng)12 000 lx。15 d后雜種苗根系粗壯進(jìn)行練苗2 d，之后移苗至基質(zhì)培養(yǎng)，常規(guī)管理。

1.5 真假雜種植株鑒定

1.5.1 DNA提取及PCR擴(kuò)增 采用改良CTAB法[24]提取篩選的抗性種質(zhì)材料及遠(yuǎn)緣雜交獲得對(duì)的雜種植株葉片DNA，并純化。PCR反應(yīng)的試劑購(gòu)于康為世紀(jì)生物科技有限公司。

PCR反應(yīng)體系為50 μL：2×TaqMasterMix 25 μL，上游引物和下游引物(10 U)各 2 μL，100 ng/μL 的DNA模板1 μL，ddH2O 補(bǔ)齊至50 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，(TM-2)℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸2 min，4 ℃保存。

1.5.2 SSR分子標(biāo)記 從http://ukcrop.net/perl/ace/search/BrassicaDB與http:www.brassica.info/ssr/SSRinfo. htm 搜索、選取100對(duì)SSR引物(Ra、Na、BN與BRMS-系列)用于雜種鑒定。

以上所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試十字花科材料抗病性差異分析

對(duì)30份供試材料出苗7 d后進(jìn)行人工接種鑒定，結(jié)果表明，不同抗性水平材料之間的發(fā)病率和發(fā)病指數(shù)均具有極顯著性差異(表3、圖1)。最終鑒定結(jié)果為：這些材料的發(fā)病率為0～100.00%，平均發(fā)病率為69.13%；病情指數(shù)為0～86.02，平均發(fā)病指數(shù)為51.45。按照抗病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將病情指數(shù)為10(圖1，黑色虛線)以下的劃為抗病品種。其中有7份材料的病情指數(shù)為0，為抗病種質(zhì)，分別是3份白菜：春蕾、春寶、根抗518；1份甘藍(lán)：文甘；3份歐洲蕪菁：斯露加、德白瑞、米藍(lán)白，占供試材料的23.33%。其他供試材料表現(xiàn)不同程度的感?。?份表現(xiàn)為中感、2份表現(xiàn)為感病、19份表現(xiàn)為高感，分別占供試材料的6.67%，6.67%，63.33%。其中19份油菜材料全部表現(xiàn)高感，而所得的7份抗性材料均來源于其他十字花科材料。

表3 30份供試材料抗性水平分析Tab.3 Resistance difference and significance of 30 rape varieties

注：表中大寫字母代表1%水平的顯著性差異。

Note: Uppercase letters represent significant in 1% respectively.

圖中大寫字母代表1%水平的顯著性差異。Uppercase letters represent significant in 1% respectively.

2.2 供試材料歐式距離連鎖聚類分析

對(duì)30份供試材料的病情指數(shù)利用SPSS軟件歐式系統(tǒng)聚類分析法進(jìn)行連鎖聚類分析，結(jié)果顯示(圖2)：當(dāng)連鎖距離為5時(shí)，可以將30份供試材料對(duì)根腫病的抗性歸為抗病、中感、感病、高感4個(gè)類群。其中，在連鎖距離為0.97處將抗病材料斯露加、德白瑞、米藍(lán)白、春蕾、春寶、根抗518、文甘7份材料聚為一類；2份中感和2份感病材料LB-A、LB-B、LB-C和春旺在連鎖距離為2.87處聚為一類；在連鎖距離為2.13處，將19份高感油菜聚為一類。這與病情指數(shù)分析結(jié)果相符合。

2.3 供試十字花科材料發(fā)病率與病情指數(shù)相關(guān)性分析

對(duì)30份供試材料進(jìn)行發(fā)病率與病情指數(shù)的相關(guān)性分析(圖3)：不同材料的病情指數(shù)隨著發(fā)病率的增加而增加，兩者之間具有顯著相關(guān)性(P<0.05)，其相關(guān)系數(shù)r=0.980，決定系數(shù)為R2=0.960 7，一元線性回歸方程為y=78.186x-2.095 9。由圖3可以看出，19個(gè)高感油菜品種(黑色方框內(nèi))的發(fā)病率達(dá)到100%，病情指數(shù)均在60以上；虛線三角形框中2份感病材料病情指數(shù)為20～40，發(fā)病率均高于40%；7份高抗材料集中于原點(diǎn)處；其余為中感材料。

圖2 30份供試材料歐式距離系統(tǒng)連鎖聚類圖Fig.2 Cluster plans chain with Euclidean distance of 30 rape varieties

圖3 30份供試材料發(fā)病率與病情指數(shù)關(guān)系Fig.3 Relations between disease index and disease incidence of 30 rape varieties

2.4 遠(yuǎn)緣雜交真假雜種鑒定

2.4.1 F1雜種形態(tài)表征及抗性鑒定 雜交組合徐09×Debra經(jīng)重復(fù)授粉的方式，對(duì)7個(gè)柱頭進(jìn)行授粉，最終獲得2個(gè)角果3粒F1雜種種子。將獲得的3株F1雜種播于基質(zhì)中后，對(duì)F1雜種及雙親的葉形、葉色、葉緣等形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行比較(圖4)：經(jīng)過初步鑒定，F(xiàn)1雜種葉色濃綠，葉片肥厚且無明顯缺刻，葉緣刺毛較少，葉型修長(zhǎng)呈橢圓形。母本為圓葉，無明顯缺刻，父本有明顯缺刻，葉片整體性狀表現(xiàn)介于兩親本之間且偏向于母本。

圖4 雜種F1真假鑒定Fig.4 F1 identification of hybrid authenticity

將獲得的F1雜種用P4生理小種菌液進(jìn)行抗性鑒定。通過接種鑒定結(jié)果表明，接種后的F1雜種無發(fā)病癥狀，這說明獲得的F1雜種為真雜種。

2.4.2 F1雜種SSR分子標(biāo)記鑒定 用100對(duì)SSR引物去掃描遠(yuǎn)緣雜種F1及雙親，進(jìn)行多態(tài)性分析。若雜種表現(xiàn)父本DNA帶型或同時(shí)表現(xiàn)父母本DNA帶型的為真雜種，僅出現(xiàn)母本DNA帶型的為假雜種。

鑒定結(jié)果最終篩選出15對(duì)SSR引物在F1雜種及雙親間具有較好的擴(kuò)增多態(tài)性(表4)，多態(tài)性引物占總引物的15%。由電泳圖(圖5)可以看到，3個(gè)雜種的帶型均同時(shí)表現(xiàn)父母本帶型，因此，可以確定此雜交組合所有F1雜種均為真雜種。

表4 多態(tài)性引物信息Tab.4 Polymorphic primer information

圖5 引物BRAS063對(duì)徐09×德白瑞雜交組合擴(kuò)增DNA電泳Fig.5 Primer BRAS063 amplification DNA electrophoresis of Xu 09×Debra

3 討論與結(jié)論

陜西省是我國(guó)油菜主產(chǎn)區(qū)之一，其根腫病發(fā)病已呈逐年加重趨勢(shì)，嚴(yán)重制約著油菜產(chǎn)量、品質(zhì)及生產(chǎn)機(jī)械化的推廣[25]。我國(guó)對(duì)根腫病的研究起步較晚，目前主要通過輪作、藥劑防治、生物防治以及篩選抗病品種方法來防治該病害。王保通等[26]利用生物制劑解淀粉芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Ba168對(duì)甘藍(lán)苗期根腫病的發(fā)生進(jìn)行了研究，其防治效果約為80%。國(guó)外對(duì)根腫病的研究較多，尤其在日本、加拿大和許多歐洲國(guó)家。日本研究者曾在2000年發(fā)現(xiàn)十字花科作物的根部?jī)?nèi)生菌(Endophytie fungi)Heteroconiumchaetospica能夠使根瘤減少52%～97%，有效防治根腫病的發(fā)生；同時(shí)，H.chaetospira可以降低輪枝菌引起的黃化病[27]。

在進(jìn)行人工抗性鑒定接種的過程中，研究者已經(jīng)發(fā)明許多接種方法，如：插入法、沾根法、注射法、菌土法等等，但所有方法最終目的均是使栽培土中含有根腫菌，為根腫病發(fā)病提供條件。本研究采用的是使用較多、操作簡(jiǎn)便的注射法[28]，用4號(hào)生理小種菌對(duì)搜集的30份十字花科材料進(jìn)行抗性篩選，其中19份高感材料均為油菜，其余十字花科材料分別表現(xiàn)不同抗性，平均發(fā)病率為69.13%。春蕾、春寶、根抗518、文甘、Siloga、Debra、Milan White共7份為高抗種質(zhì)資源，其中，文甘這份高抗根腫病的甘藍(lán)材料，是目前報(bào)道的為數(shù)不多的甘藍(lán)抗根腫病資源，為根腫病抗性機(jī)理研究及油菜抗根腫病新品種的選育提供了材料基礎(chǔ)。

由于甘藍(lán)型油菜中缺乏抗根腫病的資源，因此，急需利用遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)從其近緣物種中導(dǎo)入根腫病的抗性基因。于是本研究以甘藍(lán)型油菜育種骨干親本徐09為母本，以抗病歐洲蕪菁Debra為父本，通過遠(yuǎn)緣雜交結(jié)合常規(guī)育種獲得雜種F1。Debra具有很好的抗性，它不僅能夠抗國(guó)外根腫菌P5生理小種，還能夠抗中國(guó)的P4生理小種，而且具有多個(gè)抗性位點(diǎn)，是抗性基因的良好來源。因此，本研究選擇了Debra作為遠(yuǎn)緣雜交的抗性基因的供體親本。由于遠(yuǎn)緣雜交容易出現(xiàn)假雜種，因此，有必要對(duì)其后代材料進(jìn)行真假雜種鑒定，為了準(zhǔn)確的判斷F1雜種的真假，采用形態(tài)學(xué)鑒定、SSR分子標(biāo)記鑒定及抗性鑒定3種方法對(duì)F1雜種苗進(jìn)行真假雜種鑒定，獲得了3株F1真雜種。這3份材料可以再通過回交育種，作為抗根腫病過渡“橋梁材料”用于后續(xù)的研究。