王文普 丁婷婷 李碩峰 李 傲 孫 紅

(天津港口醫(yī)院病理科,天津300456)

宮頸癌是全球范圍嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤，居我國(guó)女性惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的前列[1]。據(jù)報(bào)道，宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與人乳頭瘤病毒有關(guān)，大部分的婦女會(huì)感染此病毒，但僅有少數(shù)持續(xù)性感染會(huì)導(dǎo)致宮頸癌的產(chǎn)生[2]。研究表明，患有免疫缺陷病或長(zhǎng)期使用免疫抑制劑的女性患有宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著提高，表明宮頸癌的發(fā)生不僅與機(jī)體持續(xù)感染人乳頭瘤病毒有關(guān)，還與機(jī)體的免疫狀況相關(guān)[3]。免疫共刺激分子CD276(B7-H3)是近年來發(fā)現(xiàn)的B7家族的新成員，在多種癌細(xì)胞及組織中表達(dá)，如肝癌、前列腺癌等[4-6]。既往研究表明，CD276在T細(xì)胞免疫反應(yīng)的信號(hào)傳遞過程中發(fā)揮抑制作用[7]。有報(bào)道，CD276不僅參與細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，還可調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為，表明CD276在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起一定作用[8-10]。但CD276在宮頸癌中的病理作用尚不完全清楚。本研究旨在通過檢測(cè)免疫共刺激分子CD276在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)并探討其對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人源胚胎腎細(xì)胞293T、宮頸癌細(xì)胞系Caski、Hela均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物有限公司；MEM、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胰酶購(gòu)自北京索萊寶生物有限公司；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司；Lipofectamine 2000、siRNA購(gòu)自上海吉瑪生物有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)購(gòu)自日本東仁化學(xué)科技有限公司；膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)&碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride，PVDF)膜購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司；IL-8 ELISA試劑盒、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司；CD276兔抗單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)兔抗單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；熒光定量PCR儀、Image Lab分析系統(tǒng)、酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1宮頸癌細(xì)胞的培養(yǎng) 人源胚胎腎細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，宮頸癌細(xì)胞系Caski、Hela培養(yǎng)基分別接種于MEM、DMEM完全培養(yǎng)基中，放入37℃、5%CO2、95%飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，觀察到細(xì)胞濃度達(dá)到80%～90%，進(jìn)行傳代。

1.2.2熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中CD276 mRNA的表達(dá)量 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，根據(jù)Trizol試劑說明書依次加入工作液，提取細(xì)胞中總RNA，并檢測(cè)其純度、濃度以及完整性，取符合實(shí)驗(yàn)要求的RNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。吸取5 μg細(xì)胞總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒指示合成cDNA。CD276基因引物由上海生工生物公司合成，CD276引物上游序列為5′-CAAAGGATGCGATACACAGACCAC-3′，下游序列為5′-CAGCAGGCAGGATGACTTAGAGAA-3′；GAPDH上游序列為5′-TGCCAGATGAGGTTGAGCTG-3′，下游序列為5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′。采用25 μl的反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件為預(yù)變性95℃ 10 min，95℃ 15 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，40循環(huán)，72℃ 5 min。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)CD276蛋白的表達(dá)水平 收集細(xì)胞，含1% PMSF細(xì)胞裂解液，冰浴中反應(yīng)30 min，離心，收集上清，測(cè)定蛋白樣品的濃度。將適量蛋白樣品按照4∶1加入5×上樣緩沖液，沸水中變性5 min；制備適宜濃度的濃縮膠和分離膠，組裝凝膠裝置，加入40 μg蛋白樣品，電壓先調(diào)整為90 V后改為120 V，電泳約1 h，停止電泳。將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜中，100 mA轉(zhuǎn)膜30 min；置于5%脫脂奶粉中孵育3 h；根據(jù)所需濃度稀釋一抗，放入含目的蛋白條帶的PVDF膜，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次×10 min，加入稀釋二抗，室溫孵育1 h，TBST漂洗3次×10 min，避光，加入ECL發(fā)光液孵育3 min，拍照，Image Lab分析蛋白質(zhì)灰度值與內(nèi)參的比值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 收集對(duì)數(shù)期Caski細(xì)胞，分為對(duì)照組、空轉(zhuǎn)染組、CD276 siRNA組。轉(zhuǎn)染前24 h，采用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將control siRNA和CD276 siRNA基因轉(zhuǎn)染宮頸癌Caski細(xì)胞，繼續(xù)置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)1.2.3所示，利用Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中CD276的表達(dá)量。

1.2.5CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖 將各組細(xì)胞加入胰酶消化，并調(diào)整為8×103個(gè)/ml，接種在96孔板上，并加入200 μl完全培養(yǎng)基，根據(jù)1.2.4所示進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃繼續(xù)孵育2 h，置于酶標(biāo)儀中測(cè)定450 nm的細(xì)胞吸光值(OD450 nm)。

1.2.6Annexin V-FITC& PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率 根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書，將轉(zhuǎn)染后48 h的各組細(xì)胞重懸，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/ml，吸取100 μl細(xì)胞懸浮液，加入5 μl Annexin V-FITC和1 μl PI，避光孵育15 min，加入400 μl結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。

1.2.7ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-8、VEGF 分別收集各組對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，胰酶消化后，接種在細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔5×105個(gè)，培養(yǎng)48 h后，收集上清，離心，根據(jù)ELISA檢測(cè)試劑盒說明書，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-8、VEGF因子水平。

2 結(jié)果

2.1CD276在Caski、Hela以及293T細(xì)胞中的表達(dá)量 RT-PCR和Western blot檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞Caski、Hela以及正常上皮細(xì)胞293T中CD276 mRNA和蛋白的水平。結(jié)果如圖1、表1所示，與正常上皮細(xì)胞293T相比，宮頸癌細(xì)胞Caski、Hela中CD276 mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tCas mRNA=17.685，P=0.000;tHela mRNA=3.868，P=0.008;tCas蛋白=15.818，P=0.000;tHela蛋白=2.567，P=0.043)；與Caski細(xì)胞相比，Hela細(xì)胞中CD276 mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tHela mRNA=13.817，P=0.000;tHela蛋白=13.251，P=0.000)；表明CD276在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于正常上皮細(xì)胞，且在Caski細(xì)胞中的表達(dá)量較高，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)以宮頸癌Caski細(xì)胞作為研究對(duì)象。

圖1 CD276在Caski、Hela以及293T細(xì)胞中的表達(dá)量Fig.1 Expression of CD276 in Caski,Hela and 293T cells

GroupsCD276 mRNACD276 protein293T0.123±0.0090.168±0.013Caski0.754±0.0681)0.852±0.0871)Hela0.261±0.0321)2)0.279±0.0261)2)F172.872144.136P0.0000.000

Note：Compared with 293T cells group，1)P<0.05；compared with Caski cells group，2)P<0.05.

2.2轉(zhuǎn)染后Caski細(xì)胞CD276蛋白表達(dá)量 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后宮頸癌Caski細(xì)胞CD276蛋白的水平。結(jié)果如圖2所示，對(duì)照組、空轉(zhuǎn)染組、CD276 siRNA組細(xì)胞中CD276 蛋白表達(dá)量分別為0.863±0.091、0.849±0.086、0.235±0.028，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=70.310，P=0.000 )；與對(duì)照組相比，空轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中CD276 蛋白的表達(dá)量差異不顯著，CD276 siRNA組細(xì)胞中CD276蛋白的表達(dá)量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.383，P=0.000)。

圖2 轉(zhuǎn)染后Caski細(xì)胞中CD276蛋白表達(dá)量Fig.2 Expression of CD276 protein in Caski cells after transfectionNote: Compared with control group，*.P<0.05.

圖3 沉默CD276基因?qū)aski細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of silencing CD276 gene on proliferation of Caski cellsNote: Compared with control group，*.P<0.05.

圖4 沉默CD276基因?qū)aski細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of silencing CD276 gene on apoptosis of Caski cellsNote: Compared with control group，*.P<0.05.

GroupsIL-8(pg/ml)VEGF(pg/ml)Control 125.369±18.478369.254±28.157Empty transfected117.263±16.851354.287±25.496CD276 siRNA43.257±3.6121)136.751±13.2691)F 28.863 94.140P 0.001 0.000

Note：Compared with control group，1)P<0.05.

2.3沉默CD276基因?qū)aski細(xì)胞增殖的影響 CCK-8檢測(cè)沉默CD276表達(dá)對(duì)Caski細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果如圖3所示，對(duì)照組、空轉(zhuǎn)染組、CD276 siRNA組細(xì)胞OD450 nm值分別為0.659±0.068、0.672±0.070、0.326±0.035，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.204，P=0.001)；與對(duì)照組相比，空轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖無顯著差異，CD276 siRNA組細(xì)胞的增殖顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.813，P=0.001)。

2.4沉默CD276基因?qū)aski細(xì)胞凋亡的影響 Annexin V-FITC& PI雙染法檢測(cè)沉默CD276表達(dá)對(duì)Caski細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果如圖4所示，對(duì)照組、空轉(zhuǎn)染組、CD276 siRNA組細(xì)胞凋亡率分別為(5.489±0.632)%、(5.896±0.733)%、(23.487±2.579)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=125.239，P=0.000)；與對(duì)照組相比，空轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率無明顯差異，CD276 siRNA組細(xì)胞的凋亡率顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.860，P=0.000)。

2.5沉默CD276對(duì)Caski 細(xì)胞IL-8、VEGF水平的影響 ELISA檢測(cè)沉默CD276表達(dá)對(duì)Caski 細(xì)胞上清液中IL-8、VEGF水平的影響，結(jié)果如表2所示，與對(duì)照組相比，空轉(zhuǎn)染組細(xì)胞上清液中IL-8、VEGF因子的水平變化不明顯，但CD276 siRNA組細(xì)胞上清液中IL-8、VEGF因子的水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tIL-8=6.894，P=0.001 ；tVEGF=12.258，P=0.000)。

3 討論

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，其死亡率高，給患者造成的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較重，近年來的發(fā)病趨勢(shì)呈現(xiàn)年輕化。據(jù)統(tǒng)計(jì)，宮頸癌的發(fā)病率位于女性腫瘤的第4位，宮頸癌在2012年的發(fā)病人數(shù)達(dá)到52.8萬，死亡人數(shù)超過26萬，占全球女性患者死亡人數(shù)的7.5%[11]。在中國(guó)，宮頸癌的發(fā)病率為15.8/10萬，死亡率約為5.13/10萬，占中國(guó)女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的首位[12]。近年來，宮頸癌的早期診斷以及治療方式均得到顯著發(fā)展，但仍有相當(dāng)比例的宮頸癌患者就診時(shí)已為晚期，手術(shù)以及化療的治療效果不理想，亟需尋找新的治療方法。因此，從多方面研究宮頸癌的演進(jìn)機(jī)制，為治療宮頸癌提供新思路是目前臨床以及基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

越來越多的研究表明，CD276具有免疫調(diào)控和非免疫調(diào)節(jié)作用，在多種腫瘤組織中的表達(dá)異常增加，如結(jié)腸癌、口腔癌等，并且與患者的預(yù)后以及臨床意義具有顯著相關(guān)性，被認(rèn)為是一種潛在的腫瘤標(biāo)記分子和新的治療靶點(diǎn)[13-15]，表明CD276在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在胃癌中，CD276表達(dá)量的高低與腫瘤組織的浸潤(rùn)深度顯著相關(guān)[16]。研究顯示，在非小細(xì)胞肺癌中，CD276的表達(dá)量顯著增加，可顯著增加患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[17]。靶向干擾CD276在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)量，觀察到細(xì)胞的增殖能力無明顯變化，但遷移、侵襲能力顯著受到抑制[18]。但CD276在宮頸癌中的作用以及分子機(jī)制的相關(guān)研究較少。本研究通過RT-PCR和Western blot檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞Caski、Hela以及正常上皮細(xì)胞293T中CD276 mRNA和蛋白的水平，結(jié)果顯示，宮頸癌細(xì)胞Caski、Hela中CD276 mRNA和蛋白的表達(dá)量均顯著高于正常上皮細(xì)胞293T，表明CD276在宮頸癌中的表達(dá)量顯著增加，與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致。因CD276在宮頸癌細(xì)胞Caski細(xì)胞中給的表達(dá)量顯著高于Hela細(xì)胞，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)以Caski細(xì)胞為研究對(duì)象。

IL-8可由活化的巨噬細(xì)胞成纖維細(xì)胞以及多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)機(jī)體的免疫反應(yīng)以及腫瘤細(xì)胞的增殖、分化具有重要作用。在CD276基因沉默的小鼠體內(nèi)，IL-8的水平顯著降低[19]。不同濃度的IL-8作用與乳腺癌MCF-7細(xì)胞中，顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡，表明IL-8與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡密切相關(guān)[20]。VEGF是腫瘤中新生血管的形成以及腫瘤組織的轉(zhuǎn)移、細(xì)胞的增殖中不可缺少的重要因子。研究證實(shí)，CD276可能通過促進(jìn)腫瘤血管的生成從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[21]。在乳腺癌中，CD276的表達(dá)水平與VEGF的表達(dá)量密切相關(guān)，沉默CD276基因的表達(dá)可調(diào)節(jié)VEGF的水平[22]。因此本實(shí)驗(yàn)通過siRNA靶向干擾Caski細(xì)胞中CD276的表達(dá)量并檢測(cè)了細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-8、VEGF的表達(dá)量，結(jié)果顯示沉默CD276基因的表達(dá)量抑制宮頸癌細(xì)胞Caski的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并下調(diào)IL-8、VEGF的蛋白水平，表明CD276可能是通過抑制IL-8和VEGF的產(chǎn)生，從而阻礙腫瘤細(xì)胞的增殖，提示CD276在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，可能是抗腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，CD276在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于正常細(xì)胞，沉默CD276基因的表達(dá)能明顯抑制Caski細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能是通過抑制IL-8、VEGF水平，從而阻礙腫瘤的發(fā)展，這表明CD276在腫瘤的演進(jìn)中起重要作用，但其在體內(nèi)外的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的探究。