榮玉靜，夏 露，胡深強，王繼文

（四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，成都611130）

禽類卵巢中卵泡數(shù)量眾多，根據(jù)發(fā)育階段和功能不同形成了嚴格的等級體系。產(chǎn)蛋期家禽卵泡按排卵順序可分為等級卵泡和等級前卵泡，其中等級卵泡按大小和排卵順序分為F1、F2、F3、F4、F5[1]，F(xiàn)1最接近排卵。顆粒細胞在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，廣泛參與營養(yǎng)攝入[2]，卵泡膜細胞分化[3]和類固醇激素生成[4]。類固醇激素是卵母細胞和顆粒細胞存活或凋亡的重要調(diào)控因子，和家禽繁殖性能相關(guān)的類固醇激素主要有孕激素、雌激素和雄激素。對卵巢起調(diào)控作用的主要孕激素是孕酮，當卵泡發(fā)育接近成熟時，顆粒細胞分泌大量孕酮促進排卵[5]。睪酮屬于雄激素，是雌二醇合成的必須底物，而雌二醇是家禽卵巢中生物活性最強的雌激素，可促進卵泡及卵母細胞發(fā)育成熟。

外部環(huán)境和禽體內(nèi)分泌的刺激使下丘腦分泌促性腺激素釋放激素（GnRH），GnRH促進垂體分泌卵泡刺激素（FSH）和促黃體生成素（LH）作用于卵巢和卵泡上相應受體，啟動細胞內(nèi)類固醇激素的合成，此過程由多個基因共同參與。膽固醇是類固醇激素合成的前體物質(zhì)，它在細胞內(nèi)的分布情況對膽固醇穩(wěn)態(tài)以及類固醇激素的合成非常重要。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory element-binding protein，SREBPs）屬于膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子家族，成員SREBP-2主要調(diào)控膽固醇合成，是維持膽固醇平衡必需基因[6]，其活性主要受細胞固醇含量調(diào)控。類固醇激素急性調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域4（START domain containing 4，STARD4）屬于START家族，主要受膽固醇和SREBP-2特異性調(diào)控[7]。STARD4與膽固醇在細胞內(nèi)的跨細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運有關(guān)，在將膽固醇遞送至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過程中發(fā)揮重要作用[8]。類固醇激素合成急性蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，STAR）位于線粒體膜，是膽固醇從線粒體外膜轉(zhuǎn)運到內(nèi)膜的限速酶，隨后膽固醇側(cè)鏈裂解酶（cholesterol side-chain cleavageenzyme，CYP11A1）將內(nèi)膜上的膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮，作為合成孕酮的底物。

作為調(diào)控機體膽固醇轉(zhuǎn)運與類固醇激素合成的關(guān)鍵基因，SREBP-2、STADR4、STAR和CYP11A1在鵝卵泡發(fā)育過程中的作用及其調(diào)控機制尚不清楚。因此，本研究選取四川白鵝為研究對象，分析四個基因在鵝卵泡發(fā)育過程中的表達模式和不同固醇類物質(zhì)對其轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，以期為揭示鵝卵泡發(fā)育機制和提高產(chǎn)蛋量提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

實驗動物來自四川農(nóng)業(yè)大學家禽育種場。挑選4只同期孵化，相同飼養(yǎng)環(huán)境并處于產(chǎn)蛋高峰期的天府肉鵝母系母鵝。放血法處死后迅速取出卵巢，按以下標準分離出各個發(fā)育階段卵泡：等級卵泡F1、F2、F3、F4、F5；等級前卵泡（10 mm以下）按每1 mm為一個等級（即9～10 mm、8～9 mm、7～8 mm、6～7 mm、5～6 mm、4～5 mm、3～4 mm、2～3 mm、＜2 mm）；閉鎖卵泡（AF）；排卵后卵泡（POF）。卵泡樣品經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于RNA提取。本研究中實驗動物使用程序按照四川農(nóng)業(yè)大學動物護理與使用指南進行。

1.2 顆粒細胞分離培養(yǎng)

選擇符合1.1條件的母鵝，取出卵巢后按照本課題組的方法[9]分離并培養(yǎng)F1卵泡顆粒細胞，將細胞分別接種至96孔和6孔細胞培養(yǎng)板，分別用于細胞活性檢測和RNA提取，然后將細胞放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞處理

分別將5 mg膽固醇（Sigma）、10 mg 25-羥膽固醇（Sigma）和10 mg洛伐他汀（Sigma）粉末溶于1 mL DMSO（Omega）配置母液。待細胞培養(yǎng)24 h，用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基饑餓4 h，然后換為含不同濃度膽固醇（5、10、15、20μg/mL）、25-羥膽固醇（1、5、10μg/mL）和洛伐他?。?.1、1、10μg/mL）[10-12]的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基處理細胞，另設(shè)不加任何處理的空白對照組。放入37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4 細胞活性檢測

取出96孔培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)基，加入25μL MTT（2 mg/mL，Omega）和75μL PBS后重新放入培養(yǎng)箱孵育。4 h后吸出PBS和MTT，每孔加入150μL DMSO，輕微震蕩10 min；490 nm處檢測吸光值。設(shè)不加細胞的空白對照孔，其他步驟一致，檢測時用空白對照孔校準。

1.5 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

取出6孔培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)基，PBS清洗一次。用Trizol（Invitrogen，USA）裂解細胞，按Trizol試劑標準操作提取總RNA。提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量合格后，按照PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）說明書合成cDNA。

1.6 目的基因相對表達量檢測

采用qPCR技術(shù)檢測目的基因mRNA表達量，根據(jù)PrimeScriptTMreagent KIT Perfect Real Time試劑盒（TaKaRa）說明書操作。反應體系為25μL，其中SYBR Premix ExTaqTM（2x）12.5μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板2μL，Rnase Free H2O 9.5μL。PCR程序：95℃30 s；95℃0.5 s，60℃30 s，45個循環(huán)。每個樣品3個重復，相關(guān)引物參數(shù)見表1。

表1 本研究中所用引物序列Table 1 Sequences of primer used in this study

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用2-△△Ct法計算基因相對表達量[13]，細胞活性及基因相對表達量結(jié)果使用SPSS Statistics 22（IBM，USA）軟件進行單因素方差分析確定顯著性（P＜0.05），使用Excel 2010軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 膽固醇轉(zhuǎn)運相關(guān)基因在鵝不同發(fā)育階段卵泡中的表達模式

膽固醇轉(zhuǎn)運與類固醇激素合成相關(guān)基因在鵝不同發(fā)育階段卵泡中的相對表達量見圖1。分析發(fā)現(xiàn)四個基因在各個發(fā)育階段卵泡中均有表達。隨著卵泡發(fā)育，4個基因的表達量在等級前階段先上升后下降，等級階段逐漸上升，均在排卵前（F1～F2）和直徑3～4 mm卵泡中有較高表達量，整體表達模式基本一致。除CYP11A1外，其他3個基因均在F1階段表達量最高；4個基因在POF階段的表達量均低于AF階段，其中STAR和CYP11A1在POF和AF階段的表達量顯著低于其他發(fā)育階段（P＜0.05）。

2.2 不同濃度膽固醇、25-羥膽固醇和洛伐他汀對鵝顆粒細胞活性的影響

MTT法檢測不同固醇類物質(zhì)處理鵝F1卵泡顆粒細胞后的細胞活性結(jié)果見圖2。隨著膽固醇處理濃度的增加，顆粒細胞活性逐漸增加，呈現(xiàn)劑量依賴性，在20μg/mL濃度時，細胞活性顯著增加（P＜0.01）；與對照組相比，添加25-羥膽固醇能在一定程度上抑制顆粒細胞活性，5μg/mL濃度時差異顯著（P=0.011）；各個濃度洛伐他汀均能顯著降低顆粒細胞活性（P＜0.05），但不同處理濃度之間沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖1 鵝不同發(fā)育階段卵泡中SREBP-2、STARD4、STAR和CYP11A1基因的表達模式Figure 1 Expression patterns of SREBP-2，STARD4，STAR and CYP11A1 genes ingeese follicles at different developmental stages

2.3 膽固醇對鵝顆粒細胞SREBP-2、STARD4、STAR和CYP11A1基因表達量的影響

不同濃度膽固醇處理鵝F1卵泡顆粒細胞后SREBP-2、STARD4、STAR和CYP11A1基因的表達量見圖3。隨著膽固醇處理濃度的增加，4個基因的表達量均表現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢，20μg/mL濃度時表達量最低。SREBP-2在15μg/mL濃度時表達量與10μg/mL濃度時相比顯著下降（P＜0.001），但其他3個基因在這兩個處理濃度間沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.4 25-羥膽固醇對鵝顆粒細胞SREBP-2、STARD4、STAR和CYP11A1基因表達量的影響

不同濃度25-羥膽固醇處理鵝F1卵泡顆粒細胞后SREBP-2、STARD4、STAR和CYP11A1基因的表達量見圖4。4個基因mRNA水平在25-羥膽固醇影響下有不同的變化趨勢。隨著處理濃度的增加，SREBP-2表達量逐漸降低，且差異顯著（P＜0.05），表現(xiàn)出劑量依賴性；低濃度25-羥膽固醇對STARD4表達量沒有影響（P＞0.05），而10μg/mL時STARD4表達量顯著升高（P＜0.01）；添加25-羥膽固醇能顯著降低STAR表達量（P＜0.001），但不同濃度之間沒有顯著差異（P＞0.05）；與對照組相比，低濃度25-羥膽固醇處理能顯著降低CYP11A1的表達量（P＜0.05），但濃度增加至10μg/mL時，CYP11A1表達量升高，且與對照組沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖2 不同濃度膽固醇、25-羥膽固醇和洛伐他汀處理后鵝F1卵泡顆粒細胞活性Figure 2 Goose F1 granulosa cells activity treated with different concentration scholes terol，25-hydroxycholesterol or lovastatin

圖3 不同濃度膽固醇處理鵝F1卵泡顆粒細胞后SREBP-2、STARD4、STAR和CYP11A1基因的表達量Figure 3 The expression of SREBP-2，STADR4，STAR and CYP11A1 in goose F1 granulosa cells treated with different concentrations of cholesterol

圖4 不同濃度25-羥膽固醇處理鵝F1卵泡顆粒細胞后SREBP-2、STARD4、STAR和CYP11A1基因的表達量Figure 4 The expression of SREBP-2，STADR4，STAR and CYP11A1 in goose F1 granulosa cells treated with different concentrations of 25-hydroxycholesterol

2.5 洛伐他汀對鵝顆粒細胞SREBP-2、STARD4、STAR和CYP11A1基因表達量的影響

不同濃度洛伐他汀處理鵝F1卵泡顆粒細胞后SREBP-2、STARD4、STAR和CYP11A1基因的表達量見圖5。隨著處理濃度升高，SREBP-2表達量先降低后升高，而其余3個基因均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，與SREBP-2相反。與其余兩個處理濃度相比，1μg/mL洛伐他汀處理細胞后，SREBP-2表達量顯著下降（P＜0.05），而STARD4、STAR和CYP11A1表達量顯著升高（P＜0.05）。

3 討論

本實驗檢測了SREBP-2、STARD4、STAR和CYP11A1基因在鵝不同發(fā)育階段卵泡中的表達情況，分析發(fā)現(xiàn)4個基因表達趨勢相似，均在等級階段表達量逐漸上升，到F1～F2時達到頂峰。在禽類等級卵泡中，促性腺激素主要刺激顆粒細胞分泌孕酮以促進排卵。研究表明，雞等級卵泡中顆粒細胞合成孕酮的能力隨著卵泡逐漸成熟而增強，發(fā)育到F1卵泡時達到頂峰[14]，在鵝上也有相似的報道[15]。STARD4是SREBP-2的靶基因[7]，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)STARD4和SREBP-2在鵝卵泡的不同發(fā)育階段表達模式基本一致，并和卵泡類固醇激素合成規(guī)律相同，表明二者在類固醇激素合成過程中可能通過參與膽固醇轉(zhuǎn)運發(fā)揮作用。接近排卵階段的卵泡顆粒細胞中促黃體生成素受體（LHR）表達量增加，因此LH介導的孕酮生成增加，這個過程就伴隨著STAR表達量增加[16-17]，另外此時CYP11A1主要在顆粒細胞表達，隨后可以誘導LH峰出現(xiàn)和排卵[18-20]。綜上，本研究后續(xù)實驗選擇鵝F1階段卵泡的顆粒細胞為實驗材料，初步探討不同固醇類物質(zhì)對上述4個基因的影響。

圖5 不同濃度洛伐他汀處理鵝F1卵泡顆粒細胞后SREBP-2、STARD4、STAR和CYP11A1基因的表達量Figure 5 The expression of SREBP-2，STARD4，STAR and CYP11A1 in goose F1 granulosa cells treated with different concentrations of lovastatin

細胞實驗結(jié)果顯示，不同濃度膽固醇處理顆粒細胞后，4個基因表達量隨著膽固醇濃度增加都表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，且SREBP-2在15μg/mL時表達量已顯著下降，其他3個基因則沒有。在飼喂高膽固醇飲食的小鼠肝臟中檢測到STADR4表達量降低超過2倍，并與SREBP-2表現(xiàn)出協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)[21]。Ning Y.[22]等發(fā)現(xiàn)，膽固醇能增加小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞中STAR表達量，并存在劑量效應。推測當細胞內(nèi)膽固醇濃度升高時，STADR4表達量增加，促進細胞內(nèi)膽固醇代謝平衡；同時STAR從線粒體外膜轉(zhuǎn)運進內(nèi)膜的膽固醇增加，引起CYP11A1表達量上升。而當膽固醇濃度過高時，抑制SREBP-2和STADR4表達，進一步降低STAR和CYP11A1表達量，此時可能通過刺激細胞內(nèi)膽固醇代謝增加了細胞活性。此外，SREBP-2對膽固醇濃度可能更敏感，這有助于它及時通過調(diào)節(jié)STADR4表達確保內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對細胞器（包括質(zhì)膜）膽固醇豐度的敏感性，從而保證細胞內(nèi)膽固醇水平的穩(wěn)定[8]。25-羥膽固醇是膽固醇氧化產(chǎn)物，它可以通過抑制SREBP-2裂解來抑制其下游基因轉(zhuǎn)錄激活，最終降低細胞內(nèi)膽固醇合成[23]。25-羥膽固醇還可以激活膽固醇酯化，此時細胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白STADR4的表達量會有所上升，這與本實驗結(jié)果相符。羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGCR）是合成膽固醇的限速酶，洛伐他汀是一種HMGCR競爭性抑制劑，可以抑制細胞內(nèi)膽固醇合成[24]。洛伐他汀處理小鼠巨噬細胞源性泡沫細胞，可明顯減少細胞內(nèi)總膽固醇和膽固醇酯含量[25]。實驗結(jié)果表明，不同濃度洛伐他汀處理后STARD4、STAR和CYP11A1表達趨勢相似，推測洛伐他汀通過影響胞內(nèi)STARD4來調(diào)節(jié)膽固醇平衡，從而影響STAR和CYP11A1表達量。25-羥膽固醇和洛伐他汀都能降低細胞內(nèi)膽固醇含量，但其作用方式不同，可能因此對相關(guān)基因的影響也不同。另外，二者都可以誘導細胞凋亡[26-27]，從本實驗結(jié)果來看，洛伐他汀對顆粒細胞活性的抑制效應強于25-羥膽固醇。

4 結(jié)論

SREBP-2、STARD4、STAR和CYP11A1基因在鵝產(chǎn)蛋期不同發(fā)育階段卵泡中表達模式基本一致；高濃度膽固醇能增加鵝F1卵泡顆粒細胞活性，25-羥膽固醇和洛伐他汀與之相反；不同固醇類物質(zhì)通過不同方式影響細胞內(nèi)膽固醇水平，從而可能對膽固醇轉(zhuǎn)運和類固醇合成相關(guān)基因產(chǎn)生不同影響。本實驗結(jié)果可以為進一步揭示鵝卵泡發(fā)育機制和提高產(chǎn)蛋量提供理論參考。