何爽，翟雅芯，王德萍，侯真珍，張愛勤?

(1.新疆大學 生命科學與技術(shù)學院，新疆 烏魯木齊830047;2.克拉瑪依市高級中學，新疆 克拉瑪依834000; 3.新疆九洲熏蒸消毒有限責任公司，新疆 烏魯木齊830011)

0 引言

繁殖是生物繁衍后代延續(xù)種族最基本的行為和過程，對于兼性繁殖的克隆植物來說，有性繁殖常被認為是適應(yīng)不穩(wěn)定環(huán)境和物種地理遷移的重要手段[1].然而，受生態(tài)和遺傳條件影響，有性繁殖在不同物種間，以及在同一物種的不同分布區(qū)間均存在巨大差異.克隆繁殖有助于植物在異質(zhì)性生境中擴張空間、捕獲資源，但是，較大的克隆投資無形中增加了對有性繁殖的對抗，一些物種由于克隆生長使得有性繁殖顯得極為脆弱，甚至瀕危[2,3].植物有性與無性繁殖間的沖突之一是兩種繁殖方式間的分配權(quán)衡，以及克隆繁殖對花粉擴散和交配系統(tǒng)所產(chǎn)生的影響[4,5].克隆生長一定程度增加了花展示，但同時也增加了同株異花授粉的比例和克隆株內(nèi)花粉的傳遞.很多自交不親和的克隆植物因為自花傳粉比例過高而導(dǎo)致有性繁殖受阻[6?8].在低溫的高山環(huán)境，克隆植物的有性繁殖還受傳粉者數(shù)量、種類、訪花行為的限制.

北極花（Linnaea borealisL. ）是位于北半球高寒地帶的單種屬忍冬科北極花族植物，主要分布在北美和歐亞等地，具克隆生長習性，由于分布區(qū)的不斷縮小，在蘇格蘭等地已被定為瀕危物種[9].在我國目前仍做為珍稀種被記載[10].已報道的對蘇格蘭分布區(qū)北極花的研究顯示，自然居群的結(jié)實率在0～25%之間，居群的片斷化以及大克隆斑塊中親和花粉的缺乏是導(dǎo)致有性繁殖受阻的主要原因[2,11].而在斯堪的納維亞半島，居群自然結(jié)實率在24～60%之間，表現(xiàn)出不同分布區(qū)結(jié)實狀況的較大差異.位于新疆北部的北極花居群為歐亞分布區(qū)的邊緣居群.空間的分離和環(huán)境因子的差異，使得新疆境內(nèi)的北極花居群有著怎樣的有性繁殖狀態(tài)和傳粉模式是一個值得探討的問題.前期觀測顯示作為游擊型克隆植物的北極花訪花者并不少，結(jié)實初期也有著很高的結(jié)實率，而到后期卻大量脫落，其影響因素并不清楚.為此，本文從北極花的開花習性、花部特征、傳粉昆蟲的訪花行為及結(jié)實格局等方面對其進行研究，以探討北極花的有性繁殖狀態(tài)及其在花粉傳遞方面的影響因素.同時，為植物繁育系統(tǒng)多樣性的研究及世界范圍內(nèi)珍稀、瀕危物種的保護與交流提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究地點及試驗材料

研究地點位于喀納斯國家自然保護區(qū)內(nèi)(86°55′E ～87°03′E 48°36′N ～48°42′N)，海拔1 500 ～2 000m的針葉林下.年均氣溫4?C左右，7月份平均氣溫15～20?C，屬溫帶高寒山區(qū)氣候.

研究材料北極花為匍匐狀的常綠小灌木, 具游擊型克隆構(gòu)型，主莖柔軟細長，分株須根在3～5cm 的土層內(nèi).每花序具2 花，雙懸垂，粉紅色或粉白色，花果期在6～8 月.與伴生種越橘(Vaccinium vitis-idaeaL. )、鐮狀卷耳（Cerastium bungeanumVyed.）、獨麗花（Moneses uniflora(Linn.) A. Gray）等的花期有重疊.研究時間為2014～2016年的花期和結(jié)實期.

1.2 研究方法

1.2.1 開花物候及開花習性的觀測

花期，隨機標記不同植株上即將開放的花序和單花各15個（朵），進行花序及單花開放動態(tài)的連續(xù)觀察，記錄花序開放的持續(xù)時間、單花壽命、開放特點、雌雄蕊的生長狀態(tài)及花粉散布情況，并對物候期進行觀察.

1.2.2 花部特征及花粉、柱頭形態(tài)的掃描觀察

花部特征參數(shù)的測定: 盛花期，隨機采集不同基株上正開放的單花30朵，分別進行花冠開口直徑、花冠長、雌雄蕊長度的測定.測量工具為游標卡尺（精度0.02mm）.

花粉量、胚珠數(shù)及花粉敗育率的測定：參照Cruden(1997)的方法[12]，盛花期，在標記的20個分株上隨機選取30朵即將開放的花苞固定，帶回室內(nèi)統(tǒng)計各單花花粉的數(shù)量和胚珠數(shù). 同時，另取20個即將開放的單花，進行花粉敗育率的檢測.

不同散粉時間柱頭花粉數(shù)的測定及自動自花授粉的檢測：盛花期，在50個分株上隨機標記剛開放的單花150個，從開放當天開始，每天取標記單花30個，連續(xù)5d進行單花柱頭花粉數(shù)統(tǒng)計.同時，隨機選取20個剛開放沒散粉的單花進行套袋，4d后，進行套袋內(nèi)柱頭花粉數(shù)的統(tǒng)計.

花粉及柱頭形態(tài)的掃描觀測：盛花期，在不同分株上隨機選取不同時期的單花各20個，剝出花柱，立即用2%的戊二醛固定液(0.1mol/L磷酸緩沖液配置)固定，帶回室內(nèi)用于不同散粉時期柱頭形態(tài)的掃描觀察.所取材料為：1）即將開放的單花；2）開放后上邊2枚雄蕊正散粉的單花；3）開放后下面2枚雄蕊散粉的單花；4）成熟的花粉粒.花粉和柱頭樣品的制備參照黃云蘭等的方法進行[13].

1.2.3 北極花及伴生種的傳粉媒介和花粉散布格局

盛花期，在北極花的實驗樣地隨機選取樣方6個（2m×3m），統(tǒng)計每樣方內(nèi)正開放的北極花以及伴生種的種類和開花數(shù)目，通過人工移栽補充伴生種的開花種類和數(shù)目，構(gòu)成半人工居群6個，在晴朗天氣下進行連續(xù)觀測（每次30min，累計30h），分別記錄北極花及伴生種的訪花昆蟲種類，訪花行為與訪花頻率.在昆蟲訪花距離的調(diào)查中，我們設(shè)同一花序上的兩朵單花的距離為0，每20cm為一個范圍，通過記錄訪花者每次在花間訪問時相鄰兩花間的距離，統(tǒng)計不同距離范圍內(nèi)發(fā)生的頻次，分析北極花的花粉散布格局.測量距離的工具為卷尺（精度cm）.

1.2.4 花粉萌發(fā)及花粉管生長狀況的熒光觀察

盛花期，在不同的分株上隨機標記即將開放的單花約300朵，從單花開放起，每隔8～10h隨機選取單花10～15朵，用FAA固定液（70%乙醇-福爾馬林-乙酸配置）固定，帶回室內(nèi)進行樣品處理后，通過熒光顯微鏡觀測不同時間段北極花的花粉萌發(fā)和花粉管生長狀況.

1.2.5 結(jié)實格局

隨機標記1m ×1m的北極花樣方30個，分別在結(jié)實初期和后期統(tǒng)計每樣方中有性分株頂端不掛果實、掛1個果實、2個果實的比例，計算北極花不同結(jié)實階段的平均結(jié)實率，分析不同階段果實形成狀態(tài)及分布格局.

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

用Excel2007 軟件和SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理與分析. 首先用One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test 進行數(shù)據(jù)的正態(tài)性檢驗，經(jīng)檢驗各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布后，用One-Way ANOVA 或t檢驗進行花部特征中各相關(guān)參數(shù)的比較.統(tǒng)計數(shù)據(jù)用平均值±標準誤差表示.

2 結(jié)果

2.1 開花物候與開花習性

連續(xù)3年的物候期觀測顯示，北極花初花期在6月底或7月初，1周左右進入盛花期，7月底或8月初進入結(jié)實期，年份間有波動.北極花的花序生于有性分枝的頂端，同一基株上的幾個雙懸花可同步開放.但同一花序上雙懸的兩單花具典型的序次開放現(xiàn)象，往往一朵花正在散粉或散粉后另一朵花才相繼開放，兩花開放間隔1～2d.

先開放的單花，花冠口半張，柱頭探出，花冠內(nèi)壁具白色毛狀附屬物，濃密、飽滿、直立，交叉成網(wǎng)狀覆蓋在雄蕊上.隨著花冠開口的進一步張開，毛狀附屬物從花冠口開始逐漸倒伏，約3～4h后，露出花中較高的兩枚雄蕊，并開始散粉.隨花冠內(nèi)側(cè)毛狀附屬物的繼續(xù)倒伏，在上邊兩枚雄蕊散粉即將結(jié)束時，下面兩個較矮的雄蕊也逐步暴露出來，并開始散粉.兩對雄蕊散粉完畢需2～3d，散粉后的單花持續(xù)1～2d脫落，單花期4～5d.花序開放時間5～7d.

2.2 花部特征及花粉、柱頭形態(tài)

2.2.1 花部特征參數(shù)的測定

北極花的花冠鐘狀，下垂，雌雄異位，四枚雄蕊兩兩序次呈現(xiàn)，如圖2 f.每單花有花粉量2 504±120粒，胚珠10±1枚，受精后只有1個胚珠可發(fā)育成種子.對上、下兩枚花藥的敗育率進行檢測，結(jié)果顯示兩者無顯著差異.

對不同散粉時期的柱頭花粉數(shù)進行測定，結(jié)果如圖1.隨著開花時間的延長，柱頭花粉數(shù)在逐步增高，在開放后第4～5d時達最高，說明柱頭被拜訪的次數(shù)在逐步增加.其中，在單花開放的第1 ～2d，只有上兩枚雄蕊散粉時，在標記的單花中43.9%的柱頭有花粉，到了第4～5d，下兩枚花藥處于散粉或散過粉狀態(tài)時，在標記的單花中有84.2%的柱頭有花粉，平均柱頭花粉數(shù)為17.93±3.09粒.自然狀態(tài)下，套袋內(nèi)柱頭花粉數(shù)為0，說明無自動自花授粉現(xiàn)象.

表1 北極花花部特征參數(shù)Tab 1 Floral traits parameters of Linnaea borealis

圖1 北極花不同開花時期柱頭花粉數(shù)Fig 1 The No. of pollen grains on stigma in different flowering days

2.2.2 花粉及不同時期柱頭形態(tài)的掃描

對北極花花粉和不同時期柱頭形態(tài)的掃描觀測顯示：待開花苞的柱頭表面形態(tài)與正散粉的柱頭無顯著差異，柱頭乳突細胞均飽滿有活力，表明在花藥散粉前柱頭即具有接受花粉的能力(圖2 a-b).北極花的花粉粒近球形，具3個萌發(fā)孔和刺狀突起的外壁紋飾(圖2 c).

2.2.3 花粉萌發(fā)及花粉管的生長狀態(tài)

熒光觀測顯示：北極花的柱頭花粉均能正常萌發(fā)和進行花粉管的生長(圖2 d-e).開放后8h開始有花粉萌發(fā)，隨著開花時間的延長，柱頭上萌發(fā)花粉的數(shù)目和有花粉的柱頭數(shù)目在明顯提高.其中，開放后0～24h、25～50h 和50～72h，分別有17.2%、43.3% 和70%的柱頭有花粉數(shù)，在72h后出現(xiàn)有生長到子房的花粉管.這與自然狀態(tài)下所測柱頭花粉數(shù)一致.所有有花粉的花柱，均處于花粉萌發(fā)或花粉管生長狀態(tài).但生長到子房頂部的花粉管數(shù)量很低，約占相同散粉時段有花粉柱頭的1/3.

2.3 傳粉者訪花情況及傳粉距離

北極花的訪花昆蟲有蠅、食蚜蠅、獨居蜂，其中，蠅為主要的訪花者，約占總拜訪次數(shù)的70%.晴朗天氣，10:00以后有昆蟲出現(xiàn)，12:00～17:30訪花昆蟲數(shù)量較多，為訪花高峰期，19:00以后逐步減少.平均訪花頻率為0.102 4±0.056 7次/花/h. 訪花昆蟲活動受光照和氣候條件影響較大，同一時間段，晴朗天氣和有陽光照射的地方訪花昆蟲較多，而陰雨天氣和遮陰的地方無訪花昆蟲或訪花昆蟲很少.

北極花與伴生種的花期不完全一致，但有重疊，且訪花昆蟲種類一致.通過移栽伴生種，構(gòu)建半人工居群觀測訪花偏好及訪花頻率，結(jié)果表明：北極花與伴生種間有昆蟲互訪現(xiàn)象，但無明顯的訪花偏好.其中伴生種獨麗花的花期較早，在北極花的盛花期，獨麗花已到盛花末期，其訪花頻率為0.009 5±0.009 5次/花/h；鐮狀卷耳的訪花頻率為0.246 5±0.058 6次/花/h；伴生種的平均訪花頻率為：0.102 9±0.027 7次/花/h，與北極花(0.102 4±0.056 7)相比二者無顯著差異(t=1.559;P=0.121).

對昆蟲所訪相鄰兩朵花的距離進行統(tǒng)計（圖3），不同訪花距離的發(fā)生頻率并不相同，傳粉者對花粉的傳播距離主要集中在0～20cm范圍之內(nèi)，發(fā)生頻率達58.33%，其中在同一花序上訪問的發(fā)生頻率為13.33%；20～40 cm范圍內(nèi)的發(fā)生頻率為18.33%，隨著距離的增加，發(fā)生頻率在逐步降低.

圖2 北極花花序、花粉，柱頭的形態(tài)觀察及花粉的萌發(fā)與生長Fig 2 The morphological obvision of inflorescence, pollen grains, stigma as well as the pollen germination and pollen tube growth of L. borealise

圖3 北極花花粉傳播距離的頻率分布Fig 3 The frequency distribution of pollen migration distance

2.4 結(jié)實格局

對分布區(qū)內(nèi)各樣方的結(jié)實率及果實分布格局進行統(tǒng)計，結(jié)果如圖4.在北極花的不同結(jié)實階段，結(jié)實率及果實分布格局明顯不同.結(jié)實初期，平均結(jié)實率為82.18±1.48%，該階段為進入結(jié)實期的第10d，雖然果實存在，但果實膨大不明顯，果實內(nèi)的胚珠也沒表現(xiàn)出明顯的變化，掛2個果的比例最高，達59.65±2.8%，掛1個果和不掛果的比例分別為31.01±3.03%，9.33±1.67%，顯著不同.到結(jié)實后期，平均結(jié)實率僅為34.85±4.18%，該階段為進入結(jié)實期的第25d，果實膨大明顯，果實內(nèi)有正發(fā)育的種子.從果實的分布格局看，在結(jié)實后期，掛1個果(24.32±2.21%)和掛2個果(22.69±3.88%)的比例遠低于不掛果的花序比例(52.99±4.72%).結(jié)實后期，掛1個果的比例(24.32±2.21%)與初期(31.01±3.03%)沒有差異，但是掛2個果的比例(22.69±3.88%)顯著低于結(jié)實初期(59.65±2.8%).

圖4 北極花的結(jié)實格局及不同階段的結(jié)實率Fig 4 The fruit-set pattern and the fruit- set rate of L.borealisein different fruiting stage

3 討論

同株異花授粉對植物的交配系統(tǒng)具有重要影響，在克隆植物中表現(xiàn)的尤為突出.為此，有花植物表現(xiàn)出了多種性狀以降低同株授粉的影響.但是由于傳粉過程中影響因素的復(fù)雜性，使得這些性狀的有效性不同[15,16].尤其在較大斑塊的克隆植物內(nèi)更是難以避免[17,18].在北極花中，花部特征、開花習性、游擊型克隆構(gòu)型及自交不親和性等性狀在降低雌雄蕊干擾、避免同株異花授粉方面具有積極作用，但是較短的傳粉距離所導(dǎo)致的高比例的同株異花授粉現(xiàn)象尤為突出，并成為影響北極花有性繁殖的重要因素.

3.1 花展示及同株異花粉的生殖干擾

雌雄異熟和雌雄異位是植物常見的兩種避免花內(nèi)自交和降低雌雄干擾的機制[14,19]. 北極花雌蕊高8.60±0.15 mm，二強雄蕊高度分別為5.91±0.11 mm，4.12±0.07 mm，單花半開時，雌蕊已探出，并具活力，而雄蕊仍被花冠內(nèi)毛狀附屬覆蓋，隨著毛狀附屬物逐漸倒伏，才暴露出較高的兩枚雄蕊，從雌蕊探出到上兩枚花藥開始散粉，間隔3～4h左右，表現(xiàn)出典型的雌雄異位和不完全的雌雄異熟.這為避免花內(nèi)自花粉滯留和降低雌雄蕊干擾提供了保障.

在單花水平，北極花4枚雄蕊兩兩序次呈現(xiàn)，使得單花期持續(xù)4～5 d；而在花序上，雙懸的兩單花具典型的序次開放現(xiàn)象，使得花序開放時間得到了延長，達6～7d.對北極花不同時期花柱頭花粉數(shù)的檢測可以看出，從上兩枚雄蕊散粉時，43.9%的柱頭有花粉，到下兩枚花藥處于散粉或散過粉狀態(tài)時，81.4%的柱頭有花粉，隨著散粉時間的推遲，北極花柱頭花粉數(shù)和有花粉的柱頭數(shù)目均在增加. 相同的例子，在由蜂鳥傳粉的雌性先熟的藤本植物Bomarea acutifolia中，6枚雄蕊依次開裂，一個花序的散粉時間可持續(xù)9d[20].在缺乏傳粉者或低溫的高山環(huán)境，花粉的序次呈現(xiàn)對于提高雄性適合度以及對高山或極地等嚴酷環(huán)境適應(yīng)性的提高均具重要意義[21?23].

然而，自然狀態(tài)下北極花較低的結(jié)實率（34.85±4.18%）反映其花展示在促進異交方面并沒有得到有效的發(fā)揮.北極花柱頭花粉數(shù)為17.93±3.09，且只有一枚胚珠可發(fā)育成種子，較充足的柱頭花粉數(shù)似乎不存在花粉限制.但是，熒光觀測顯示柱頭上正常萌發(fā)的花粉，約有1/3能夠長到子房頂部.這說明柱頭上較高的花粉數(shù)顯然為不親和的同株花粉.北極花具自交不親和性，對其進行人工異花授粉，可明顯提高結(jié)實率[24].這一現(xiàn)象在北極花的蘇格蘭分布區(qū)也有發(fā)現(xiàn)[2,11].北極花具典型的避免花內(nèi)自交，促進異花授粉的花部綜合征，但并沒能避免同株異花授粉的生殖干擾.

3.1.1 花傳粉模式與有性生殖

影響植物花粉流傳播的因素主要受傳粉昆蟲和開花式樣的影響[25]. 蠅類在高山環(huán)境中分布較為普遍[26,27]，但具有活動能力低，訪花時間短，訪花路徑?jīng)]有規(guī)律性等特征[28?30].北極花的訪花昆蟲有蠅、食蚜蠅和蜂.其中，蠅為主要訪花者，但訪花距離非常有限，主要集中在0～20cm范圍之內(nèi)，并成為北極花高比例同株異花授粉的主要原因.盡管北極花為游擊型克隆構(gòu)型，但居群呈明顯的斑塊狀分布[21]，較短的訪花距離限制了基株間異花粉的傳遞.同時，同期開花的植物–伴生種在增加傳粉者吸引的同時也增大了對訪花者的競爭和對花粉傳遞的干擾.這些因素均增加了花粉流近距離的傳遞.種子和果實的發(fā)育通常受資源限制或花粉來源的影響，出現(xiàn)受精前或受精后的敗育.在北極花中，從結(jié)實格局的數(shù)據(jù)看，如果受資源限制，結(jié)實初期掛1個果的比例會較大，不掛果或掛2個果的比例會較低.但事實不是如此，結(jié)實初期掛2個果的比例最高，達59.65±2.8%，掛一個果的比例次之，不掛果的比例最低.也證明了北極花中較高的果實脫落率緣于不親和的高比例同株異花授粉.自交不親和降低了同株授粉的雌性代價，在基株間花粉傳遞充足的情況下，自交不親和的維持是有益的. 但是如果親和花粉限制，自交不親和將降低種子生產(chǎn)，其維持代價將會很高.在北極花中，克隆生長習性、較為單一的傳粉者、較短的傳粉距離所導(dǎo)致的高比例的同株異花授粉等成為植物有性繁殖率低下的主要原因.