馮莉芳，涂毅，張玲莉

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院感染管理辦公室； 2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部,湖北 武漢 430060)

臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)人們經(jīng)常吃蔬菜和水果患消化道癌癥的幾率較低，其原因可能是由于蔬菜和水果中存在一種或多種抑制腫瘤發(fā)展的植物活性物質(zhì)。蘿卜硫素(sulforaphane，SFN)是一種具較強(qiáng)抗癌作用的植物活性成分，主要在西蘭花、花椰菜及甘藍(lán)菜等蔬菜中含量較高[1]。研究發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素是一種多功能酶誘導(dǎo)物，能夠誘導(dǎo)Ⅱ型解毒酶的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗癌的效果[2-4]。胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，在腫瘤發(fā)病率中穩(wěn)居第4位，而在我國(guó)每年新增患者占全球的40%。由于對(duì)胃癌的早期診斷率較低，而且胃癌是一種多因素、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的腫瘤，目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究還不能解釋很多問(wèn)題，所以在胃癌診斷和治療的研究中還存在較大空間[5-7]。目前，較多的研究報(bào)道蘿卜硫素可以預(yù)防、延緩或逆轉(zhuǎn)腫瘤出現(xiàn)前的病變，能夠?qū)Χ喾N腫瘤具有較好的預(yù)防作用，是一種頗有價(jià)值的抗腫瘤活性成分[8]。前期也研究證實(shí)了蘿卜硫素對(duì)氧化應(yīng)激引起的胃黏膜損傷具有保護(hù)和修復(fù)作用，并且還能對(duì)胃黏膜的炎性反應(yīng)起到抑制效果[9]。本文研究蘿卜硫素對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC27的抑制作用及其可能的作用機(jī)制，以期為蘿卜硫素的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

HGC27人胃癌細(xì)胞株(武漢巴菲爾生物有限公司)；蘿卜硫素(上海原葉生物科技有限公司，HPLC檢測(cè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%，批號(hào)：CAS:142825-10-3)，采用二甲基亞砜(DMSO)溶解制備成儲(chǔ)存液，使用前稀釋成相應(yīng)濃度便可；ATP標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司，批號(hào)：CFAD-A3377-1G)；DCFH-DA(Sigma公司，批號(hào)：2044-85-1)；CCK8試劑盒(Sigma公司)；DMEM培養(yǎng)基(上海吉諾公司)；胎牛血清(FBS，四季青公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠試劑盒均購(gòu)自碧云天生物科技有限公司；抗體Bax、Bcl-2、p53、及β-actin均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

高效液相色譜儀LC-20AD型(日本島津公司)；Victor3 1420 Multilable Counter酶標(biāo)儀(DX540，美國(guó))；F2500熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)；單人超凈臺(tái)(蘇州華新空調(diào)凈化有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海醫(yī)用分析儀器廠)；SDS-PAGE凝膠電泳(型號(hào)DYCZ-24DN，北京六一儀器廠)；成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國(guó))。

1.2 HGC27細(xì)胞培養(yǎng)

將HGC27細(xì)胞常規(guī)接種于含10%FBS、1%雙抗(100 U/mL青霉素-100 μg/mL鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%左右時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HGC27細(xì)胞消化、重懸、計(jì)數(shù)后以1×104/孔細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，每孔終體積為200 μL，每組設(shè)置6個(gè)平行孔。培養(yǎng)過(guò)夜待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，加入200 μL不同濃度的蘿卜硫素培養(yǎng)液(20、40、80 μg/mL)，培養(yǎng)24、48、72 h后，吸去舊培養(yǎng)基，向各孔加入10 μL CCK8試劑，37 ℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值(A值)，計(jì)算細(xì)胞存活率SR。SR=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.4 DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS活性

HGC27細(xì)胞經(jīng)不同濃度蘿卜硫素干預(yù)處理24 h后，將細(xì)胞消化并收集于1.5 mL Ep管中，1 500 r/min離心5 min，倒掉上清，向細(xì)胞沉淀中加入1 mL DCFH-DA溶液，吹打混勻后37 ℃孵育30 min，再加入PBS終止反應(yīng)。接著1 500 r/min離心5 min，倒掉上清，收集細(xì)胞沉淀，并加入PBS重懸細(xì)胞，用F2500熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光值。其中激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)置為525 nm。

1.5 HPLC測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP水平

HGC27細(xì)胞經(jīng)不同濃度蘿卜硫素干預(yù)處理24 h后，消化、離心，收集細(xì)胞，向細(xì)胞中加入0.4 mol/L的高氯酸0.5 mL，吹打混勻后置于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存。待檢測(cè)前取出細(xì)胞置于冰上解凍，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，取20 μL上清進(jìn)樣分析。色譜條件為：日本島津公司ODS-SP C18(4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm)色譜柱，流動(dòng)相為50 mmol/L磷酸鹽緩沖液-甲醇(95∶5)，柱溫30 ℃，流速0.5 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

1.6 蛋白濃度測(cè)定

ROS活性及ATP含量檢測(cè)中所設(shè)計(jì)的蛋白濃度檢測(cè)均用BCA試劑盒，其操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.7 Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2及p53蛋白的表達(dá)水平

HGC27細(xì)胞經(jīng)不同濃度蘿卜硫素干預(yù)處理24 h后，消化、離心，收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液在冰上充分裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心12 min，提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每孔上樣量為30 μg，采用15%的SDS-PAGE凝膠分離蛋白，70 V電泳；在冰水浴中275 mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉常溫下封閉1 h，4 ℃條件下孵育一抗過(guò)夜，TBST漂洗3次后室溫下孵育二抗，再TBST清洗3次后，在ECL試劑中顯色，Bio-Rad發(fā)光系統(tǒng)成像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 蘿卜硫素對(duì)HGC27細(xì)胞存活率的影響

HGC27細(xì)胞經(jīng)不同濃度蘿卜硫素干預(yù)處理24、48、72 h后，各劑量組細(xì)胞存活率顯著低于溶劑對(duì)照組(P<0.05)，并且與蘿卜硫素劑量間存在一定的濃度依賴性。在同一劑量的蘿卜硫素干預(yù)下，隨著藥物干預(yù)處理的時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率也呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)。見表1。

表1 蘿卜硫素對(duì)HGC27細(xì)胞存活率的影響Table 1 Effect of sulforaphane on the survival rate of HGC27 cells

與溶劑對(duì)照組比較：aP<0.05； 與20 μg/mL蘿卜硫素組比較：bP<0.05； 與40 μg/mL蘿卜硫素組比較：cP<0.05。

2.2 蘿卜硫素對(duì)HGC27細(xì)胞ROS活性及ATP含量的影響

HGC27細(xì)胞經(jīng)不同濃度蘿卜硫素干預(yù)處理24 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低(P<0.05)，ATP含量也顯著降低(P<0.05)，并且均表現(xiàn)出濃度依賴性。見表2。

2.3 蘿卜硫素對(duì)HGC27細(xì)胞中Bax、Bcl-2及p53蛋白表達(dá)的影響

HGC27細(xì)胞經(jīng)不同濃度蘿卜硫素干預(yù)處理后，促凋亡蛋白Bax和抑癌蛋白P53表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平則顯著降低(P<0.05)，均表現(xiàn)出劑量依賴性。見圖1。

表2 蘿卜硫素對(duì)HGC27細(xì)胞ROS活性及ATP含量的影響

組別劑量/(μg·mL-1)ROS/(Fluo unit·mg-1)ATP/(μg·mg-1)溶劑對(duì)照組03 853±19713.98±1.52蘿卜硫素 低劑量組203 250±164a10.22±1.13a 中劑量組402 658±133ab8.67±0.85ab 高劑量組801 845±115abc6.94±0.65abc

與溶劑對(duì)照組比較：aP<0.05； 與20 μg/mL蘿卜硫素組比較：bP<0.05； 與40 μg/mL蘿卜硫素組比較：cP<0.05。

1234abcabaabcabcababaaBax/β-actinBcl-2/β-actinp53/β-actinBaxp53Bcl-2β-actin0.80.60.40.20.00.60.40.20.00.80.60.40.20.01234

1.溶劑對(duì)照組； 2. 20 μg/mL蘿卜硫素組； 3. 40 μg/mL蘿卜硫素組； 4. 80 μg/mL蘿卜硫素組。與溶劑對(duì)照組比較：aP<0.05； 與20 μg/mL蘿卜硫素組比較：bP<0.05； 與40 μg/mL蘿卜硫素組比較：cP<0.05。

圖1蘿卜硫素對(duì)HGC27細(xì)胞中Bax、Bcl-2及p53蛋白表達(dá)的影響

Figure1Effect of sulforaphane on the expression of Bax,Bcl-2 and p53 proteins in HGC27 cells

3 討論

用不同濃度蘿卜硫素對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC27進(jìn)行干預(yù)處理后，采用CCK8方法對(duì)細(xì)胞的相對(duì)存活率進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，蘿卜硫素能夠有效抑制HGC27細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，并且表現(xiàn)出一定的時(shí)間-劑量依賴關(guān)系。腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出的一個(gè)重要特征是生長(zhǎng)速度極快，使得惡變組織在短期內(nèi)體積增長(zhǎng)較快，而此時(shí)血管形成相對(duì)較慢，導(dǎo)致局部缺血缺氧微環(huán)境的形成。腫瘤細(xì)胞的缺血缺氧會(huì)導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生較多的活性氧自由基(ROS)，會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激損傷[10]。過(guò)量的ROS會(huì)導(dǎo)致核DNA的損傷、線粒體DNA的突變、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的過(guò)氧化[11]。除此之外，ROS還可以介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)通路的傳導(dǎo)，在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用[12]。本文研究發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素可以有效抑制HGC27細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。另外，腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的主要區(qū)別在于前者代謝產(chǎn)生的ATP來(lái)自于糖酵解過(guò)程[13]。前期也有研究發(fā)現(xiàn)3-溴代丙酮酸(3-BrPA)能夠通過(guò)抑制癌細(xì)胞中ATP的合成，進(jìn)一步引發(fā)腫瘤細(xì)胞的死亡[14]。本研究也表明蘿卜硫素可以顯著抑制HGC27細(xì)胞內(nèi)ATP的生成，可能是蘿卜硫素抑制腫瘤細(xì)胞增殖的主要原因之一。

Bax是Bcl-2家族中重要的促凋亡蛋白，其作用機(jī)制主要是與Bcl-2形成異源二聚體達(dá)到抑制Bcl-2的抗凋亡作用，還可以自身形成同源二聚體促使癌細(xì)胞凋亡[15]?；罨腂ax可以誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C，進(jìn)一步引發(fā)細(xì)胞凋亡[16]。并且前期研究發(fā)現(xiàn)Bax的表達(dá)水平與人胃的病變嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)性，提示Bax表達(dá)的增加可以促使腫瘤細(xì)胞凋亡[15]。本研究也發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素能夠明顯誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。p53是一種抑癌基因而分布在各種組織細(xì)胞中，在DNA損傷的應(yīng)答反應(yīng)中，損傷因子通過(guò)誘導(dǎo)p53來(lái)抑制細(xì)胞周期，已達(dá)到修復(fù)DNA損傷的作用[17]。一旦DNA遭受到無(wú)法恢復(fù)的損傷，細(xì)胞將會(huì)進(jìn)入程序化死亡途徑[18]。本研究亦發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素可以通過(guò)誘導(dǎo)p53的表達(dá)來(lái)促使HGC27細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上，蘿卜硫素可以有效抑制HGC27細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與調(diào)控氧化應(yīng)激水平、抑制ATP生成、上調(diào)Bax、p53及下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平有關(guān)。