孟玲寧 劉錦燕 趙悅 王鈺婷1， 項明潔

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海 200025；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院放免檢驗科，上海 200020)

條件致病性真菌在過去的幾十年中逐漸被視為人類真菌感染的重要致病菌，尤其在免疫功能低下的患者，如移植受者、艾滋病患者和癌癥患者，由念珠菌屬引起的侵襲性感染是現(xiàn)代血流感染的第4大死因[1]。目前可用的抗真菌藥物為多烯類、唑類、烯丙胺類、棘白菌素類和嘧啶類，一方面這些藥物會對患者胃腸道產(chǎn)生一定的副作用[2]，另一方面臨床上預防性抗真菌感染治療增加、抗真菌藥物廣泛和不合理的使用，導致敏感菌株被抑制或殺滅，耐藥菌株逐漸被誘導產(chǎn)生并大量繁殖，使真菌的耐藥率越來越高，尤其醫(yī)源性感染交叉感染的耐藥菌檢出率遠高于平均水平[3]。因此迫切需要研發(fā)基于新作用靶點的抗真菌藥物，避免這些已知耐藥機制的作用。

既往研究發(fā)現(xiàn)在白念珠菌中輔酶A將磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移給無活性的載體蛋白形成具有活性的全蛋白過程中，需要一種磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶Ppt2的催化作用。該酶在生物代謝過程中發(fā)揮重要作用，同時此型別是真菌所特異的，不存在于哺乳動物中，使其成為一個理想的抗真菌藥物新靶點[4]。本次實驗中我們通過同源重組以及原核表達技術(shù)成功制備了磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶Ppt2，并利用Ppt2蛋白的His標簽對其進行純化，最終獲得較高純度的目的蛋白Ppt2，為后期熒光偏振法篩選靶點為Ppt2酶的臨床藥物打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與材料

白念珠菌BWP17由中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所分子生物學國家重點實驗室饋贈；質(zhì)粒pET43.1a(+)、大腸桿菌BL21(DE3)購自生物風生物公司；DMT感受態(tài)細胞購自北京華越洋生物科技有限公司;pyrobest酶(TaKaRa公司);氨芐西林(碧云天); SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、IPTG (生工生物工程有限公司);一步法定向克隆無縫克隆試劑盒 (南京諾唯贊生物科技有限公司); PCR產(chǎn)物回收試劑盒 (Biomiga公司)。

1.2 引物設(shè)計與合成

白念珠菌PPT2基因ORF全長為408bp，根據(jù)白念珠菌基因組數(shù)據(jù)庫中的基因序列設(shè)計1對PPT2基因特異性引物。上游引物PPT2-F為5’-GACGACGACAAGATGCCAAAAGTAGGCACTGTAT-3’；下游引物PPT2-R為5’-AGCTCCCGGACTTTAGATTTGATAAACCTTCT-3’(下劃線處分別是與線性化質(zhì)粒片段互補的部分)。用于線性化質(zhì)粒的上游引物pET43.1-F為5’-CTTGTCGTCGTC-3’;下游引物pET43.1-R為5’- AGTCCGGGAGCT-3’。引物由生工生物工程有限公司合成。

1.3 PCR擴增PPT2基因和線性化質(zhì)粒pET43.1

以白念珠菌BWP17為模板，PPT2-F和PPT2-R為引物擴增白念珠菌PPT2基因。體系(50 μL)為0.25 μL pyrobest酶;5 μL 10×buffer II;4 μL dNTP mix(2.5 mol/L);引物(10 μmol/L)各1 μL;模板100 ng。PCR反應(yīng)條件為94℃ 1 min預變性;98℃ 5s,55℃ 45s,72℃ 1 min,共25個循環(huán)。以質(zhì)粒pET43.1為模板，pET43.1-F和pET43.1-R為引物線性化擴增pET43.1片段，反應(yīng)體系同上。反應(yīng)條件為94℃ 1 min預變性;98℃ 5s,55℃ 45s,72℃ 8 min,共30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.4 重組表達載體的構(gòu)建及鑒定

利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒對PPT2基因和pET43.1片段進行回收純化。取純化后的產(chǎn)物于冰水浴中配制反應(yīng)體系(20 μL)，其中線性化克隆載體pET43.1為50～200 ng；插入片段擴增產(chǎn)物為20～200 ng；ExnaseTMII為2 μL；5×CE II buffer為4 μL。體系配制完成后置于37℃反應(yīng)30 min，然后冰水浴中冷卻5 min，將冷卻反應(yīng)液加入到200 μL感受態(tài)細胞DMT中，混勻后在冰上放置30 min，42℃熱擊90秒，冰水浴孵育2 min，加入900 μL LB培養(yǎng)液后 37℃搖菌45 min，取100 μL菌液均勻涂布在含有適當氨芐西林的LB平板上于37℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性單克隆菌落利用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒進行質(zhì)粒DNA的抽提，質(zhì)粒DNA產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)有限公司進行測序。測序正確后將重組表達質(zhì)粒pET43.1a(+)/PPT2轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞大腸埃希菌BL21(DE3)，利用含氨芐西林抗性平板篩選陽性克隆。

1.5 誘導表達重組蛋白Ppt2

挑取pET43.1a(+)/PPT2陽性克隆菌株于含有氨芐西林的2 mL LB培養(yǎng)液中37℃ 200 r/min搖菌16 h，將過夜培養(yǎng)物以1∶50稀釋轉(zhuǎn)種于含氨芐西林的LB培養(yǎng)液中繼續(xù)以37℃ 200 r/min搖菌。當菌液OD600=0.6時，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L誘導過夜。4℃ 8 000 g離心10 min收集沉淀，保存于-80℃。

1.6 重組蛋白的抽提

沉淀菌體用10倍重量體積的PBS懸浮，冰浴條件下400 W，工作4s，間歇6s超聲直至破菌液不粘稠。12 000 r/min離心30 min，分別收集上清液和沉淀。SDS-PAGE分析重組蛋白可溶性情況。

1.7 重組蛋白的純化

利用重組蛋白上的HIS標簽對其進行純化。首先Ni柱清洗后用平衡液(20 mmol/L PB, 500 mmol/L NaCl, pH7.4)平衡3～5個柱體積；蛋白抽提上清液進行上樣后收集柱流出組分；再用含50 mmol/L咪唑緩沖液(20 mmol/L PB, 500 mmol/L NaCl, 50 mmol/L 咪唑，pH7.4)洗滌，去除結(jié)合能力較弱的雜蛋白和核酸的雜質(zhì)；最后分別用含100 mmol/L、200 mmol/L、500 mmol/L 咪唑緩沖液洗脫目標蛋白，收集洗脫峰。再利用AKTA 層析系統(tǒng)對上述100 mmol/L咪唑洗脫的組分進行進一步的純化。首先系統(tǒng)和柱子清洗后用Buffer A(20 mmol/L PB, 200 mmol/L NaCl, pH7.4)平衡，將100 mmol/L咪唑洗脫的組分上樣后收集流出組分，再分別用含有100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L和500 mmol/L不同咪唑濃度梯度的Buffer B洗脫液(20 mmol/L PB, 200 mmol/L NaCl, 相應(yīng)濃度咪唑, pH7.4)洗脫并收集洗脫峰。取樣后進行SDS-PAGE純度分析并通過Western-blot進行驗證。

1.8 重組蛋白的透析

取截留分子量為1萬的透析袋裝入含目的蛋白的洗脫液，在10倍體積的外透液(PBS，pH=7.4)條件下4℃攪拌透析過夜，后取截留分子量3萬的離心濃縮管，4 000 r/min 4℃離心濃縮至需要的體積。最后利用Bradford法測定所獲得蛋白Ppt2濃度。

2 結(jié) 果

2.1 PPT2片段和線性化質(zhì)粒pET43.1 PCR產(chǎn)物鑒定

以BWP17為模板，PPT2-F/R為引物擴增白念珠菌PPT2基因全長，擴增產(chǎn)物片段大小為408 bp，電泳結(jié)果如圖1所示。將PCR產(chǎn)物回收后送生工生物工程有限公司進行測序，測序結(jié)果與白念珠菌SC5314的PPT2基因序列對比，沒有發(fā)生點突變。以質(zhì)粒pET43.1為模板，pET43.1-F/R為引物對質(zhì)粒進行線性化擴增，擴增產(chǎn)物片段大小應(yīng)為7275 bp,電泳結(jié)果如圖2所示。

圖1PPT2片段PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳分析圖2線性化質(zhì)粒pET43.1 PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳分析

Fig.1Agarose gel electrophoresis analysis of PCR amplification of PPT2 fragmentFig.2Agarose gel electrophoresis analysis of linearized plasmid pET43.1 by PCR amplification

2.2 表達產(chǎn)物Ppt2蛋白抽提鑒定

0.1 mmol/L IPTG過夜誘導的結(jié)果如圖3所示，通過對超聲裂解液進行SDS-PAGE電泳，可見IPTG誘導后的蛋白表達產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在于沉淀中(泳道D)，分子量與預計大小一致為76 kD；只有少部分以可溶性蛋白的形式存在于上清中(泳道C)。后期放大搖菌量集菌后蛋白抽提結(jié)果如圖4所示，超聲裂解液的上清中存在大量的可溶性蛋白Ppt2，故收集上清中的可溶性蛋白進行后續(xù)的掛柱純化，富集可溶性蛋白Ppt2。

圖3表達產(chǎn)物Ppt2蛋白抽提的SDS-PAGE分析. 注：B1-3:誘導細胞裂解液；A:未誘導細胞裂解液；B:誘導細胞裂解液；C:誘導細胞裂解液上清；D:誘導細胞裂解液沉淀；MK:蛋白質(zhì)分子量圖4放大搖菌量集菌后蛋白抽提的SDS-PAGE分析

Fig.3SDS-PAGE analysis of protein extraction of Ppt2. Lane B1-3: Induced cell lysate; Lane A: Non-induced cell lysate; Lane B: Induced cell lysate; Lane C: Supernatant of cell lysate； Lane D: Precipitation of cell lysate； MK: Molecular weight markerFig.4SDS-PAGE analysis of protein extraction after amplifying the bacteria. Lane A: Non-induced cell lysate Lane； B: Whole induced cell lysate； Lane C: Supernatant of cell lysate Lane； D: Precipitation of cell lysate； MK: Molecular weight marker

2.3 Ppt2蛋白純化結(jié)果鑒定

首先通過Ni柱純化后的目的蛋白SDS-PAGE以及Western blot結(jié)果如圖5所示，可見洗脫液濃度為50 mmol/L咪唑和100 mmol/L咪唑時，能夠富集到目的蛋白Ppt2，但是驗證到蛋白存在部分降解。因此收集100 mmol/L咪唑洗脫餾分進行下一步akta-HIS柱純化提高目的蛋白純度，結(jié)果顯示大部分目的蛋白Ppt2存在于流穿液中，故收集流穿液餾分透析濃縮后作為最終產(chǎn)物。最后通過Bradford法測得蛋白濃度為0.4 mg/mL，蛋白產(chǎn)物為0.4 mg/mL×5.5 mL=2.2 mg(見圖6)。

圖5Ni柱純化后的目的蛋白SDS-PAGE以及Western blot結(jié)果。注：P:陽性對照;N:陰性對照;A:裂解液上清樣品；B:流穿液；C-G：不同濃度咪唑洗脫液(20 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、250 mmol/L、500 mmol/L)；MK:蛋白質(zhì)分子量圖6akta-His柱純化后的目的蛋白SDS-PAGE結(jié)果。注：A:100 mmol/L咪唑洗脫液；B:流穿液；1-9:不同濃度咪唑洗脫液；MK:蛋白質(zhì)分子量

Fig.5SDS-PAGE and Western blot results of the target protein after purification on Ni columnFig.6SDS-PAGE results of target protein after purification on akta-His column

3 討 論

白念珠菌是臨床最常見的條件致病性真菌，近年來，其感染率和耐藥率均不斷上升，給臨床治療白念珠菌感染帶來巨大的挑戰(zhàn)。因此基于真菌新作用靶點的藥物研發(fā)是迫切需要的。

磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(phosphopantetheinyl transferases，PPTases)存在于細菌、真菌以及哺乳動物中，其在生物代謝過程中發(fā)揮著重要作用[5]。輔酶A將磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移給無活性的載體蛋白后形成具有活性的全蛋白，從而發(fā)揮作用，在此過程中需要PPTases的催化作用。在真菌中，PPTases分為三種型別，第1種“結(jié)構(gòu)域”型,參與細胞質(zhì)中脂肪酸的合成；第2種為Sfp型(釀酒酵母和白念珠菌中為Lys5，在煙曲霉菌中為PptA)，參與賴氨酸的生物合成，激活α-氨基乙氨酸還原酶參與聚酮化合物和非核糖體肽合成酶復合物的合成[6]；第三種為AcpS型(在釀酒酵母和白念珠菌中為Ppt2，在煙曲霉菌中為PptA),參與線粒體中脂肪酸的合成，將輔酶A中的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移給線粒體中的?；d體蛋白Acp1,使其具有活性后成為線粒體中硫辛酸合成的輔因子，硫辛酸是線粒體中的輔酶，對于真菌線粒體呼吸作用非常重要。

細菌中的PPTase大多為Sfp型，此前有研究發(fā)現(xiàn)2-吡啶基-N-(4-芳基)-哌嗪-1-硫代甲酰胺表現(xiàn)出對細菌Sfp-PPT的亞微摩爾級的抑制作用，而其類似物中4-(3-氯-5-(三氟甲基)吡啶-2-)-N-(4-甲氧基吡啶-2-)哌嗪-1-硫代甲酰胺(ML267)具有更強的對微生物PPT2的抑制作用和選擇性。然而，目前國內(nèi)外對于真菌磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的研究比較少，且大多數(shù)聚焦在PPTase的功能學研究等方面，并沒有進行更加深入的臨床相關(guān)研究[7]。Dobb等[4]發(fā)現(xiàn)抑制PPT2基因表達的白念珠菌在SD培養(yǎng)基上無法生長。此外,AcpS型別的PPTases還是真菌所特有的，哺乳動物中均為Sfp型，使其成為一個非常有潛力的抗真菌藥物的靶點。所以本次研究通過制備白念珠菌Ppt2蛋白，為后續(xù)熒光偏振篩選藥物提供條件，最終能夠為臨床治療白念珠菌感染提供新的思路。

在本次研究目的蛋白抽提過程中，Ppt2主要以包涵體的形式存在于裂解液沉淀中，只有少部分可溶性蛋白存在于上清液中，但考慮到包涵體蛋白后期純化過程涉及到復性等較復雜的操作[8]，故本次實驗采用擴大搖菌量獲取上清液中的可溶性蛋白進行進一步純化。在目的蛋白純化過程中，第1步Ni柱純化時蛋白Ppt2有一部分存在于流穿液中，而不同濃度洗脫液中100 mmol/L咪唑洗脫組分中除去目的蛋白外雜帶最少，所以選取100 mmol/L咪唑洗脫液進行下一步純化；在akta-His柱純化過程中，目的蛋白有部分存在于流穿液中，咪唑洗脫的各部分也有目的蛋白，但是流穿液中組分純度最好，故收集流穿液進行透析和濃縮，目的蛋白Pp2出現(xiàn)在流穿液中，可能是因為蛋白Ppt2跟Ni柱結(jié)合不緊密，這跟蛋白本身結(jié)構(gòu)有關(guān)。

綜上所述,我們通過原核表達技術(shù)成功制備了白念珠菌Ppt2重組蛋白,蛋白純化步驟簡便且得率較高,為日后利用靶酶Ppt2進行高通量的熒光偏振法藥物篩選打下了基礎(chǔ)。