黃玉婷，王棟麟，張衛(wèi)紅，劉大林

(揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

鋁在土壤中主要以氧化物或硅酸鹽沉淀物等形式存在，對(duì)植物和環(huán)境無(wú)毒害作用，但當(dāng)土壤變?yōu)樗嵝陨踔羛H<5時(shí)，結(jié)合態(tài)的鋁變?yōu)殡x子態(tài)，對(duì)植物產(chǎn)生毒害[1]。而環(huán)境的破壞導(dǎo)致酸雨頻繁發(fā)生，加劇土壤酸化程度，土壤中Al3+的釋放量增多，嚴(yán)重影響草本植物的生長(zhǎng)。研究表明，鋁脅迫對(duì)植物農(nóng)藝性狀及抗氧化酶系統(tǒng)等均有抑制作用[2-3]。目前，植物耐鋁機(jī)制研究已取得一定的進(jìn)展，其中鋁脅迫導(dǎo)致根系分泌大量有機(jī)酸，并與鋁螯合，緩解了鋁對(duì)植物根系的毒害作用，減少了根系對(duì)Al3+的吸收，其中檸檬酸與Al3+結(jié)合程度最高[4]，因而檸檬酸成為緩解植物鋁毒的一個(gè)重要物質(zhì)。黃凱豐等[5]研究表明，檸檬酸處理在一定程度上能緩解鋁脅迫對(duì)苦蕎造成的傷害。金婷婷等[6]對(duì)大豆的研究表明，添加一定濃度的檸檬酸能緩解鋁脅迫對(duì)大豆的毒害作用。但關(guān)于鋁脅迫下，添加檸檬酸對(duì)禾本科植物特別是黑麥草生長(zhǎng)影響的研究較少。

多年生黑麥草(Loliumperenne)是我國(guó)南方應(yīng)用廣泛的禾本科牧草，具有抗性強(qiáng)、再生性強(qiáng)和不易倒伏等優(yōu)點(diǎn)，還因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適口性好以及生物產(chǎn)量高等特點(diǎn)成為草食畜禽的優(yōu)質(zhì)青飼料[7]。此外，黑麥草對(duì)土壤中多種重金屬有較強(qiáng)的富集能力[8]，而輕金屬鋁脅迫對(duì)黑麥草的影響研究較少。因此，研究不同濃度的檸檬酸對(duì)鋁脅迫下多年生黑麥草的種子萌發(fā)和幼苗生理特性的影響，以期為緩解酸性土壤中鋁脅迫對(duì)植物的毒害作用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

多年生黑麥草品種維多利亞，購(gòu)于河南世紀(jì)天緣生態(tài)科技有限公司；試驗(yàn)試劑為氯化鋁(AlCl3)、檸檬酸(C6H8O7)、1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。

1.2 試驗(yàn)方法

材料培養(yǎng)采用培養(yǎng)皿濾紙發(fā)芽法[9]。挑選形態(tài)飽滿均勻的維多利亞種子，用0.2%次氯酸鈉溶液消毒15 min，用蒸餾水反復(fù)沖洗4～5次，在水溫為(25±2)℃條件下浸種30 min。設(shè)18個(gè)處理組，每個(gè)處理組重復(fù)3次：(1)不加鋁不加檸檬酸(對(duì)照)，Al0N0(CK)；(2)加鋁不加檸檬酸，鋁的處理分別為250，500 mg/L，2個(gè)濃度等級(jí)，代號(hào)依次為Al250N0，Al500N0；(3)加檸檬酸不加鋁，檸檬酸的處理 0.2，0.5，0.8，1.1，1.5 mmol/L，5個(gè)濃度等級(jí)，代號(hào)依次為Al0N0.2，Al0N0.5，Al0N0.8，Al0N1.1，Al0N1.5；(4)加鋁加檸檬酸，代號(hào)依次為Al250N0.2、Al250N0.5、Al250N0.8、Al250N1.1、Al250N1.5、Al500N0.2、Al500N0.5、Al500N0.8、Al500N1.1、Al500N1.5。在培養(yǎng)皿(直徑10 mm)底部放入雙層濾紙，每個(gè)培養(yǎng)皿放60粒種子，分別加入處理液10 mL，每天補(bǔ)充等量蒸餾水。第5 d換培養(yǎng)皿，在新培養(yǎng)皿底部放入雙層濾紙，將幼苗移栽進(jìn)去，分別加入處理液10 mL，每天補(bǔ)充等量蒸餾水。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo) 種子放入培養(yǎng)皿中發(fā)芽開始，每天定時(shí)觀察種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的情況，并記錄每天發(fā)芽的種子數(shù)(胚根長(zhǎng)等于種子長(zhǎng)度一半)，發(fā)芽率按第9 d計(jì)算。

發(fā)芽勢(shì)(GP)=前4 d發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽率(GR)=試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(9 d)種子發(fā)芽總數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽指數(shù)(GI)=ΣGt/Dt

式中：Gt為t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的試驗(yàn)天數(shù)。

株高的測(cè)定：種子放入培養(yǎng)皿中發(fā)芽開始，第10 d各個(gè)處理隨機(jī)取5株完整的黑麥草，用直尺測(cè)定植株基部到頂部的距離作為株高，每個(gè)處理3次重復(fù)。

根長(zhǎng)的測(cè)定：種子放入培養(yǎng)皿中發(fā)芽開始，第10 d各個(gè)處理隨機(jī)取5株完整的黑麥草，用直尺測(cè)定胚軸與根之間的過(guò)渡點(diǎn)開始到根末端的長(zhǎng)度，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3.2 生理指標(biāo) 種子放入培養(yǎng)皿培養(yǎng)10 d后分別測(cè)定葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性、葉片丙二醛(MDA)含量和葉片相對(duì)電導(dǎo)率。SOD活性測(cè)定采用比色法[10]；MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸(TBA)法[10]；葉片相對(duì)電導(dǎo)率采用浸泡法[11]，用DDS-11A型電導(dǎo)率儀測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2016輸入數(shù)據(jù)并計(jì)算基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，然后用SPSS 18.0進(jìn)行Duncan法單因素方差分析和多重比較，最后用Excel 2016進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬酸對(duì)鋁脅迫下多年生黑麥草的生長(zhǎng)特性

2.1.1 種子萌發(fā) 與無(wú)檸檬酸處理相比，不進(jìn)行鋁處理以及500 mg/L的鋁濃度處理下，檸檬酸處理對(duì)黑麥草的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)無(wú)顯著(P<0.05)影響，甚至還有抑制作用；250 mg/L的鋁濃度處理下，Al250N0.8處理組提高了黑麥草種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)，分別為83.89%，91.11%和63.10%。但差異不顯著(P<0.05)。檸檬酸對(duì)鋁脅迫下多年生黑麥草種子萌發(fā)并無(wú)顯著(P<0.05)促進(jìn)作用(表1)。

表1 不同濃度檸檬酸對(duì)鋁脅迫下多年生黑麥草種子萌發(fā)的影響

注：不同小寫字母表示該品種在相同濃度Al3+、不同濃度檸檬酸處理間差異顯著(P<0.05)，下同

2.1.2 幼苗根長(zhǎng)和株高 與無(wú)檸檬酸處理相比，單檸檬酸處理對(duì)黑麥草幼苗地下部分生長(zhǎng)無(wú)明顯效應(yīng)(P<0.05)；250 mg/L的鋁濃度處理下，添加檸檬酸提高了黑麥草幼苗的根長(zhǎng)，其中，Al250N0.8處理能顯著(P<0.05)促進(jìn)其根長(zhǎng)；500 mg/L的鋁濃度處理下，添加不同濃度的檸檬酸均能促進(jìn)黑麥草幼苗的根長(zhǎng)，其中Al500N0.8和Al500N1.1處理能顯著(P<0.05)促進(jìn)其根長(zhǎng)，且2種鋁濃度處理下根長(zhǎng)隨著檸檬酸濃度的升高先升后降?？梢姍幟仕崽幚韺?duì)鋁脅迫下多年生黑麥草幼苗的根長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用。

與無(wú)檸檬酸處理相比，單檸檬酸處理對(duì)黑麥草幼苗地上部分的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著(P<0.05)影響；250、500 mg/L的鋁濃度處理下，檸檬酸處理能提高黑麥草幼苗的株高，但差異不顯著(P<0.05)?？梢姍幟仕崽幚碓谝欢ǔ潭壬夏芫徑怃X脅迫對(duì)多年生黑麥草幼苗地上部分生長(zhǎng)的抑制作用(圖1，2)。

圖1 不同濃度檸檬酸處理的鋁脅迫下多年生黑麥草幼苗的根長(zhǎng)Fig.1 Effects of different concentrations of citric acid on root length of seedling under aluminum stress

圖2 不同濃度檸檬酸處理的鋁脅迫下多年生黑麥草幼苗的株高Fig.2 Effects of different concentrations of citric acid on plant height of seedling under aluminum stress

2.2 檸檬酸對(duì)鋁脅迫下多年生黑麥草幼苗葉片生理特性的影響

2.2.1 葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性 與無(wú)檸檬酸處理相比，不進(jìn)行鋁處理以及250 mg/L的鋁濃度處理下，檸檬酸處理提高了黑麥草幼苗葉片SOD活性，但差異不顯著(P<0.05)；500 mg/L的鋁濃度處理下，檸檬酸處理提高了黑麥草幼苗葉片SOD活性，其中Al500N0.2和Al500N1.1處理SOD活性顯著(P<0.05)高于CK。由此可見，檸檬酸處理能提高鋁脅迫下黑麥草幼苗葉片SOD活性(圖3)。

圖3 不同濃度檸檬酸對(duì)鋁脅迫下多年生黑麥草幼苗葉片SOD的活性Fig.3 Effects of different concentrations of citric acid on SOD activity in leaf of seedling under aluminum stress

2.2.2 葉片丙二醛(MDA)含量 與無(wú)檸檬酸處理相比，不進(jìn)行鋁處理以及250、500 mg/L的鋁脅迫下，添加檸檬酸后，黑麥草幼苗葉片MDA含量有所降低，且隨著檸檬酸濃度升高，MDA含量呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)。其中250 mg/L的鋁濃度處理下，5個(gè)檸檬酸濃度處理組MDA含量均顯著(P<0.05)降低，Al250N1.1處理下MDA含量達(dá)到最低值。可見檸檬酸處理降低了黑麥草幼苗葉片的MDA含量(圖4)。

2.2.3 葉片相對(duì)電導(dǎo)率 與無(wú)檸檬酸處理相比，單一檸檬酸處理均能降低黑麥草幼苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率，其中Al0N0.5處理下相對(duì)電導(dǎo)率最低；250 mg/L的鋁濃度處理下，Al250N0.5、Al250N0.8、Al250N1.1、Al250N1.5處理能降低黑麥草幼苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率，其中Al250N0.8處理組的相對(duì)電導(dǎo)率最低；500 mg/L的鋁濃度處理下，Al500N0.5、Al500N0.8、Al500N1.1處理均能降低黑麥草幼苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率，其中Al500N0.8處理組的相對(duì)電導(dǎo)率最低；但各處理均不顯著(P<0.05)。由此可知添加檸檬酸能降低黑麥草幼苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率(圖5)。

圖4 不同濃度檸檬酸處理的鋁脅迫下多年生黑麥草幼苗葉片的MDA含量Fig.4 Effects of different concentrations of citric acid on MDA content in leaf of seedling under aluminum stress

圖5 不同濃度檸檬酸處理的鋁脅迫下多年生黑麥草幼苗葉片的相對(duì)電導(dǎo)率Fig.5 Effects of different concentrations of citric acid on relative conductivity in leaf of seedling under aluminum stress

3 討論

檸檬酸具有調(diào)節(jié)pH值的作用，而pH值的改變能夠破壞胚細(xì)胞的結(jié)構(gòu)[12]，抑制酶活性。試驗(yàn)表明，檸檬酸對(duì)鋁脅迫下多年生黑麥草種子萌發(fā)(發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù))無(wú)顯著(P>0.05)促進(jìn)作用，該結(jié)果與于敏等[13]添加檸檬酸對(duì)水稻銅毒害的研究以及邢素芝等[14]添加檸檬酸對(duì)小白菜種子萌發(fā)的研究結(jié)果相似。其結(jié)果可能是由于種子內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)遭到破壞，其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

鋁毒主要通過(guò)抑制主根和側(cè)根的伸長(zhǎng)進(jìn)而影響植株生物量。鋁在根尖細(xì)胞壁上的積累是鋁對(duì)植物根尖產(chǎn)生鋁毒的先決條件，是植物鋁毒敏感的主要特征，Al3+能通過(guò)離子交換的形式結(jié)合到細(xì)胞壁[15]，迫使K+外流[16]，導(dǎo)致細(xì)胞壁變薄。初曉輝等[17]對(duì)多花黑麥草的研究表明高濃度鋁脅迫下，多花黑麥草的根長(zhǎng)顯著下降(P<0.05)。試驗(yàn)中鋁脅迫均不同程度地抑制了多年生黑麥草幼苗根系的生長(zhǎng)，添加檸檬酸后幼苗根系顯著增長(zhǎng)(P<0.05)，因此，添加外源檸檬酸對(duì)鋁脅迫下多年生黑麥草幼苗的根長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，該結(jié)果與徐芬芬[18]對(duì)大豆的研究結(jié)果相似。Al250N0.8，Al500N0.8和Al500N1.1處理組的緩解效果最為顯著(P<0.05)，因此，不同濃度的鋁脅迫下，緩解效果最佳的檸檬酸濃度基本一致。此外，鋁毒也會(huì)抑制植物地上部分的生長(zhǎng)，蕭鳳迴等[19]研究證明，鋁脅迫下綠豆的株高降低，總生物量減少。試驗(yàn)中，檸檬酸處理在一定程度上增加了鋁脅迫下幼苗的株高，孫遠(yuǎn)秀等[20]對(duì)西瓜幼苗的研究也獲得類似的結(jié)果。但是，試驗(yàn)中檸檬酸對(duì)地上部分的緩解作用并不顯著，可能是因?yàn)楦滴盏匿X大部分殘留在根系組織中，極少數(shù)運(yùn)輸至地上部分[21]，導(dǎo)致Al3+對(duì)地上部分的毒害較輕。有研究報(bào)道，檸檬酸處理對(duì)植物根系影響較大，而對(duì)地上部分影響較小，這可能是種子在萌發(fā)期間由胚乳提供能量，在胚乳的能量消耗完后幼苗開始由根部向外界汲取生長(zhǎng)所需能量，當(dāng)用檸檬酸處理時(shí)，根系首先受到影響且影響程度比其他部分更加顯著[22]。

SOD是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，它能維持活性氧的產(chǎn)生和清除平衡，保護(hù)植物細(xì)胞免受傷害，有研究報(bào)道低鋁脅迫會(huì)刺激植物SOD活性升高[23]，但隨著鋁濃度升高，SOD活性下降[24]。陳佳等[25]對(duì)栝樓的研究發(fā)現(xiàn)，添加檸檬酸能明顯緩解鋁脅迫對(duì)栝樓葉片SOD活性的抑制作用，試驗(yàn)表明檸檬酸處理后，鋁脅迫下黑麥草幼苗葉片SOD活性提高，不同檸檬酸濃度產(chǎn)生的效果有所差異，鋁濃度越高，適宜的檸檬酸濃度越低，可能是植物受到鋁脅迫時(shí)，根系自身會(huì)分泌檸檬酸所致，其原因還有待進(jìn)一步研究。

MDA和相對(duì)電導(dǎo)率都是膜脂過(guò)氧化指標(biāo)。MDA是膜脂過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，大量積累會(huì)損傷質(zhì)膜，使其選擇透過(guò)性變差，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，破壞相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境[26]。曹林等[27]報(bào)道，鋁脅迫導(dǎo)致菊芋MDA含量增加。而添加檸檬酸能降低葉片MDA含量[28]，修復(fù)植物細(xì)胞膜系統(tǒng)。相對(duì)電導(dǎo)率可反應(yīng)細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度，是研究植物抗逆性的重要生理指標(biāo)，鋁脅迫導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞、穩(wěn)定性下降，透性增大[29]，最終迫使植物葉片相對(duì)電導(dǎo)率上升[30]。試驗(yàn)結(jié)果表明，檸檬酸能降低鋁脅迫下多年生黑麥草幼苗葉片MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率，且隨著檸檬酸濃度升高，MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)。在鋁濃度為250 mg/L時(shí)添加不同濃度的檸檬酸都能使MDA含量顯著下降(P<0.05)，添加0.8 mmol/L檸檬酸能使相對(duì)電導(dǎo)率下降到最低，膜脂過(guò)氧化程度相對(duì)最輕。因此，檸檬酸處理能使鋁脅迫下幼苗葉片細(xì)胞膜傷害的程度得到緩解。

4 結(jié)論

鋁脅迫下，檸檬酸處理對(duì)多年生黑麥草種子萌發(fā)無(wú)促進(jìn)作用，說(shuō)明檸檬酸不能緩解鋁脅迫對(duì)多年生黑麥草種子萌發(fā)的毒害作用。此外，通過(guò)對(duì)鋁脅迫下多年生黑麥草幼苗在檸檬酸處理后的2個(gè)形態(tài)指標(biāo)以及3個(gè)生理指標(biāo)進(jìn)行分析對(duì)比，得出添加檸檬酸能不同程度地緩解鋁脅迫對(duì)多年生黑麥草幼苗的毒害作用，但不同濃度的鋁毒作用下，不同濃度的檸檬酸對(duì)其生長(zhǎng)的緩解效果不同。分析認(rèn)為，檸檬酸濃度為0.8 mmol/L時(shí)對(duì)鋁脅迫下多年生黑麥草品種維多利亞的生長(zhǎng)最有益。因此，添加檸檬酸可以有效緩解酸性土壤中Al3+對(duì)多年生黑麥草的毒害作用。