李惠民 綜述 申才良 審校

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是由外界暴力直接或間接作用于脊柱，引起脊椎骨的骨折或累及脊髓神經(jīng)節(jié)的損傷。世界范圍中，創(chuàng)傷所導(dǎo)致的SCI大概有133 226萬(wàn)例，每年新增病例大概有179 312例[1]。治療SCI的方法主要包括藥物治療、手術(shù)治療以及康復(fù)治療，但都只是對(duì)癥治療。細(xì)胞移植理論認(rèn)為干細(xì)胞不僅可以自我復(fù)制，而且是具有分化成多種組織細(xì)胞潛能的細(xì)胞。應(yīng)用干細(xì)胞的多向分化潛能，可生成各種組織細(xì)胞，特別是特定的神經(jīng)細(xì)胞，這樣就有可能修復(fù)受損的脊髓組織，恢復(fù)脊髓功能[2]。 目前已有一些早期臨床試驗(yàn)證明干細(xì)胞移植的可行性[3-4]，該文就干細(xì)胞移植修復(fù)SCI的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為臨床上進(jìn)一步治療SCI提供新的理論依據(jù)。

1 胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

多能胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)可以從早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中獲得。McDonald et al[5]將ESCs注射到挫傷的SCI大鼠脊髓中，發(fā)現(xiàn)存活的ESCs在體內(nèi)分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，而且接受移植的SCI模型的大鼠BBB評(píng)分都得到提高。

多能胚胎干細(xì)胞由于必須取材于人類胚胎，臨床應(yīng)用一直存在倫理問題。為了判斷多能胚胎干細(xì)胞移植治療SCI患者的療效，Shroff et al[6]在2015年獲得英國(guó)上議院再生醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)委員會(huì)認(rèn)可，將胚胎干細(xì)胞通過靜脈注射治療5例下半身癱瘓或者四肢癱瘓的患者，患者都是慢性SCI，根據(jù)美國(guó)SCI協(xié)會(huì)損傷分級(jí)(American Spinal Injury Association Impairment Scale，AIS)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，接受治療中有兩人評(píng)分沒有改變，一人是從A級(jí)提升到C級(jí)，兩人是從A級(jí)提升到B級(jí)。在隨訪中，患者在沒有接受免疫抑制劑的情況下都沒有出現(xiàn)畸胎瘤。這項(xiàng)研究表明胚胎多能干細(xì)胞移植治療SCI患者可能是一個(gè)有效安全的方法，但是仍然需要更多臨床數(shù)據(jù)的支持。此后Shroff et al[7]將胚胎干細(xì)胞與物理療法結(jié)合在一起治療226例慢性SCI患者，其中有136例是下肢癱瘓，90例是四肢癱瘓，接受治療的患者中A、B、C、D級(jí)各有153、32、36、5例，治療后A級(jí)提升到B級(jí)占15.0%，A級(jí)提升到C級(jí)占37.3%，B級(jí)提升到C級(jí)占40.6%，B級(jí)提升到D級(jí)占3.1%，C級(jí)提升到D級(jí)13.9%，D級(jí)提升到E級(jí)占60.0%。這項(xiàng)研究結(jié)果表明物理治療輔助人胚胎干細(xì)胞療法促進(jìn)SCI患者功能的整體改善。然而，Shroff et al并沒有解釋這篇研究中所涉及的倫理問題。目前關(guān)于ECSs來源的細(xì)胞用于治療SCI的臨床試驗(yàn)仍然很少，ECSs的安全性需要進(jìn)一步研究。此外，ECSs來源于有限的胚胎，在體外分化的條件高,這些都制約著ESCs 細(xì)胞建系和廣泛的應(yīng)用。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是由Takahashi et al[8]在2006年首先報(bào)道的。當(dāng)時(shí)通過在大鼠成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)入Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種轉(zhuǎn)錄因子，從而形成iPSCs。隨后Takahashi et al[9]在2007年成功的從成人組織中獲取iPSCs。 Miura et al[10]體外實(shí)驗(yàn)證明了iPSCs細(xì)胞可以分化成神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。iPSCs治療SCI的具體機(jī)制目前并不清楚，考慮可能由于各種移植干細(xì)胞的作用包括神經(jīng)元細(xì)胞替代、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)分泌因素、促進(jìn)血管生成、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和神經(jīng)保護(hù)。

Tsuji et al[11]從正常鼠中獲取iPSCs，并移植到SCI 9 d后的大鼠受損脊髓，與對(duì)照組比較，移植組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能有明顯的恢復(fù)，這種恢復(fù)機(jī)制可能是移植細(xì)胞衍生的雙極星形膠質(zhì)細(xì)胞支持脊髓束軸突再生和移植細(xì)胞促進(jìn)髓鞘再生。Oh et al[12]通過使用SCI后手術(shù)期間移除的椎間盤來源的細(xì)胞產(chǎn)生的iPSC進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究顯示椎間盤來源的細(xì)胞產(chǎn)生的iPSC表現(xiàn)出和人類胚胎干細(xì)胞相似的特征，并有效分化成神經(jīng)前體細(xì)胞，具有在體外分化為成熟神經(jīng)元的能力，而且移植到SCI后9 d的大鼠受損脊髓后，結(jié)果顯示后肢功能障礙顯著改善。雖然動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明移植iPSCs對(duì)SCI的大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能障礙的改善有一定的作用，但是關(guān)于SCI的臨床前和臨床干細(xì)胞移植的研究相當(dāng)匱乏。此外iPSCs的獲取效率仍然較低(0.001%～10%)[13]，最為關(guān)鍵的是iPSCs大多數(shù)是通過使用逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒作為轉(zhuǎn)運(yùn)載體來獲取，重新編程的過程中可能會(huì)出現(xiàn)內(nèi)源基因表達(dá)改變，從而增加引起腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，這需要研究人員未來在提取方法上進(jìn)一步完善，提高安全性。

2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是從骨髓中獲得的一種可以自我更新的多能干細(xì)胞，大約占成人骨髓有核細(xì)胞總數(shù)的0.001%～0.01%，可以通過髂棘穿刺從骨髓中獲得[14-16]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞之所以被一些研究者所喜愛，主要是由于間充質(zhì)干細(xì)胞具有：① 捐贈(zèng)來源和保存相對(duì)比較容易；② 細(xì)胞擴(kuò)增到臨床應(yīng)用規(guī)模需時(shí)短；③ 保存過程效能丟失少；④ 可以減少脫髓鞘，促進(jìn)神經(jīng)元再生；⑤ 不良反應(yīng)少[17]。

最近，一些研究者發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)神經(jīng)元再生并且減少瘢痕形成的傾向。Okuda et al[18]從雌性Fischer 344大鼠提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，制備骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼片，與明膠海綿對(duì)比，移植到T8水平的SCI的大鼠受損脊髓。結(jié)果表明移植8周后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞明顯減少GFAP陽(yáng)性的瘢痕細(xì)胞并且大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能在移植4周和8周后都得到改善。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用開展的比較早，Sykov? et al[19]2005年首次開展骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床研究，采用椎動(dòng)脈導(dǎo)管內(nèi)途徑和靜脈途徑兩種移植方式將從7例急性和13例慢性SCI患者的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到患者體內(nèi)，隨訪其中11例患者超過2年沒有出現(xiàn)不良反應(yīng)，結(jié)果得出自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可能是一種安全的方法，但是仍然需要更長(zhǎng)的隨訪來證實(shí)。Dai et al[20]將自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到20例完全慢性頸脊髓損傷的患者，隨訪6個(gè)月后，其中10例患者得到不同程度的功能恢復(fù)，1例患者得到運(yùn)動(dòng)功能改善，2例患者得到運(yùn)動(dòng)和感覺功能改善，1例患者得到感覺和膀胱功能改善，6例患者得到運(yùn)動(dòng)，感覺和膀胱功能改善。在這6個(gè)月中，自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植組沒有出現(xiàn)傷口感染，切口腦脊液漏及腫瘤形成。另外Kakabadze et al[21]將自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到18例完全慢性SCI的患者，隨訪12個(gè)月發(fā)現(xiàn)骨髓干細(xì)胞移植后18例中有9例出現(xiàn)不同程度的運(yùn)動(dòng)和感覺功能改善。根據(jù)美國(guó)SCI協(xié)會(huì)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，9例患者中有7例觀察到1級(jí)改善，2例改善了2級(jí)。Geffner et al[22]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到8例SCI的患者，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤形成，沒有出現(xiàn)感染或疼痛增加的病例并且患者的生活質(zhì)量得到一定的改善。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞易于提取、分離，能夠自體移植且組織兼容性好，但是仍然有很多問題需要解決，比如間充質(zhì)干細(xì)胞的生存率，移植的細(xì)胞中CD34+ 表達(dá)量，患者的年齡和性別[19]。

3 神經(jīng)干細(xì)胞

神經(jīng)干細(xì)胞首先在1989年被提出存在于小鼠的腦室下區(qū)，并在1992年首次從小鼠紋狀體組織和腦室下區(qū)中分離出來。這些細(xì)胞能夠自我更新并在體外和體內(nèi)產(chǎn)生神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。將其移植到受損脊髓后，神經(jīng)干細(xì)胞能夠產(chǎn)生成熟的神經(jīng)表型并在一些SCI模型中促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

直接移植神經(jīng)干細(xì)胞到受損脊髓，神經(jīng)干細(xì)胞主要分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞且并不總是可以改善SCI的動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能。一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，來源于人類胎兒組織或者胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞可以提高SCI動(dòng)物的功能障礙的恢復(fù)，但是這種來源通常存在倫理問題以及臨床應(yīng)用存在爭(zhēng)議。隨著iPSCs的出現(xiàn)，一些研究者發(fā)現(xiàn)iPSCs可以作為神經(jīng)干細(xì)胞的來源，并且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這種神經(jīng)干細(xì)胞一樣可以改善SCI動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)障礙，這種神經(jīng)干細(xì)胞移植到動(dòng)物脊髓受損區(qū)域，在該區(qū)域大部分分化成神經(jīng)元，但是這項(xiàng)技術(shù)仍然受制于iPSC本身提取效率的低下。此外，為了使神經(jīng)干細(xì)胞移植發(fā)揮更好的作用，一些研究者采取共同療法。Karimi-Abdolrezaee et al[23]將神經(jīng)干細(xì)胞與軟骨素酶ABC(可以下調(diào)硫酸軟骨素蛋白聚糖，從而防止軸突延長(zhǎng)細(xì)胞骨架破壞)移植到SCI的大鼠受損脊髓中，結(jié)果顯示皮質(zhì)脊髓束軸突的延長(zhǎng)以及移植細(xì)胞和受損區(qū)域整合的提高，并且最終改善大鼠運(yùn)動(dòng)功能。有研究者發(fā)現(xiàn)通過將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞序貫移植到SCI的大鼠體內(nèi)，大鼠運(yùn)動(dòng)功能得到改善并且減少神經(jīng)干細(xì)胞膠質(zhì)化的傾向[24]。由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后在宿主體內(nèi)無(wú)法長(zhǎng)期存活、分化不確定性，宋旆文 等[25]體外實(shí)驗(yàn)通過制備骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基，將其和神經(jīng)干細(xì)胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)條件培養(yǎng)基可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化增多，而向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化減少。神經(jīng)干細(xì)胞具備取材不受倫理限制，但是取材有限，獲取材料具有侵襲性，對(duì)患者造成二次傷害。而且如何解決神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)的存活率以及如何誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化，仍然需要大量臨床前數(shù)據(jù)才能得出結(jié)論。

4 少突膠質(zhì)祖細(xì)胞

少突膠質(zhì)祖細(xì)胞起源于胚胎發(fā)育的神經(jīng)上皮細(xì)胞，可分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。2005年，Keirstead et al[26]首次報(bào)道少突膠質(zhì)祖細(xì)胞改善挫傷的SCI大鼠軸突髓鞘再生和運(yùn)動(dòng)功能并且之后有研究顯示少突膠質(zhì)祖細(xì)胞很大程度上可以抵抗NK細(xì)胞的殺傷作用。

Kerr et al[27]將胚胎干細(xì)胞來源的少突膠質(zhì)祖細(xì)胞在損傷后急性期注射到SCI的大鼠模型中，移植8 d后，檢查到少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物包括CNPase、GalC、Olig1、O4和O1，說明這些細(xì)胞至少可以存活8 d。在另外一項(xiàng)研究中，Sharp et al[28]將少突膠質(zhì)祖細(xì)胞移植到頸脊髓損傷大鼠模型以評(píng)估前肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。移植后第4周到第9周，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)明顯前肢步幅長(zhǎng)度增加。病理切片顯示移植組病變部位廣泛的白質(zhì)和灰質(zhì)保留，并且沒有出現(xiàn)損傷誘導(dǎo)的空洞。Geron公司在2009年被允許為SCI進(jìn)行第一個(gè)干細(xì)胞治療臨床試驗(yàn)。在第二年，Geron公司啟動(dòng)了第一個(gè)臨床試驗(yàn)(第一階段)，以測(cè)試完全性胸段水平截癱并喪失運(yùn)動(dòng)和感覺功能的患者中人類胚胎干細(xì)胞衍生的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞-GRNOPC1療法的安全性。GRNOPC1是指損傷后14 d內(nèi)用低劑量的200萬(wàn)個(gè)細(xì)胞作用于損傷部位，長(zhǎng)期隨訪結(jié)果中沒有發(fā)生嚴(yán)重的不良事件。此外，他們計(jì)劃在下一步測(cè)試細(xì)胞濃度為2 000萬(wàn)的安全性。2011年11月，Geron由于經(jīng)濟(jì)原因宣布已經(jīng)結(jié)束了SCI干細(xì)胞研究計(jì)劃。為了少突膠質(zhì)祖細(xì)胞可以臨床應(yīng)用于SCI的患者，一項(xiàng)裸鼠實(shí)驗(yàn)證明在頸部脊髓損傷后1周內(nèi)注射少突膠質(zhì)祖細(xì)胞可以顯著改善運(yùn)動(dòng)功能，并且這種改善和實(shí)質(zhì)性空洞減少以及受損部位髓鞘再生有關(guān)。通過大規(guī)模生物分布和毒理學(xué)研究，表明少突膠質(zhì)祖細(xì)胞遷移僅局限于脊髓和腦干，并且沒有造成不良反應(yīng)，產(chǎn)生毒性，異位性或者腫瘤[29]。

5 干細(xì)胞分化細(xì)胞

干細(xì)胞分化細(xì)胞用于治療SCI也有一些研究，并且取得了一些進(jìn)展。

嗅鞘細(xì)胞是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)特殊的膠質(zhì)細(xì)胞，具有促進(jìn)神經(jīng)再生和軸突延長(zhǎng)的作用。嗅鞘細(xì)胞已經(jīng)開展了臨床實(shí)驗(yàn)，Wu et al[30]遵從嚴(yán)格的倫理學(xué)規(guī)定，從人類16周歲的胎兒體內(nèi)提取的嗅鞘細(xì)胞治療11例慢性SCI患者，患者治療過程中都沒有出現(xiàn)神經(jīng)方面并發(fā)癥，運(yùn)動(dòng)功能改善并不明顯，但是可以觀察到感覺功能改善很多，認(rèn)為嗅鞘細(xì)胞是一種安全的方法并且對(duì)感覺功能改善作用更大。Tabakow et al[31]將自體嗅鞘細(xì)胞移植到3例完全SCI患者，根據(jù)美國(guó)SCI協(xié)會(huì)損傷分級(jí)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，3例患者都是A級(jí)。隨訪1年后1例從A級(jí)提升到C級(jí)，1例提升到B級(jí)，還有1例雖然沒有提升但是可以觀察到損傷水平以下運(yùn)動(dòng)和感覺功能的改善。

施旺細(xì)胞存在于周圍神經(jīng)系統(tǒng)，可以促進(jìn)髓鞘再生和軸突延長(zhǎng)。一些臨床研究[32]報(bào)道施旺細(xì)胞移植似乎是安全的。與同種異體細(xì)胞移植相比，自體細(xì)胞不需要免疫抑制，但細(xì)胞制造的工作量更大，2009～2012年在邁阿密大學(xué)進(jìn)行的經(jīng)美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)臨床前施旺細(xì)胞移植研究(NCT01739023)，一期安全性研究已經(jīng)啟動(dòng)，這項(xiàng)研究在2016年已經(jīng)徹底完成，但是目前還沒有相關(guān)文章報(bào)道實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

6 展望

為達(dá)到挽救SCI患者生命，提高生活質(zhì)量和完全治愈SCI的夢(mèng)想，細(xì)胞移植治療一直吸引著眾多研究者。雖然有一些臨床研究表明細(xì)胞移植對(duì)運(yùn)動(dòng)和感覺功能改善起到一些作用且認(rèn)為似乎是一種安全的方法，但是仍然需要更多的臨床前研究以及臨床研究才能最終證實(shí)這種方法的療效和安全性。以上提到的幾種干細(xì)胞各有優(yōu)缺點(diǎn)：ESCs具有全能性，可分化方向多，但是取材有限，受到倫理限制；iPSCs具有多能性，取材不受倫理限制，但是提取效率低下，而且和ESCs一樣存在安全性問題；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞來源較廣，不受倫理限制，但是體內(nèi)定向誘導(dǎo)問題亟需解決；少突膠質(zhì)祖細(xì)胞無(wú)致瘤性，但是目前取材受到倫理限制；干細(xì)胞分化細(xì)胞臨床應(yīng)用目前較為安全，但是臨床治療效果需要進(jìn)一步研究。

此外，對(duì)于這些細(xì)胞促進(jìn)修復(fù)和功能改善的機(jī)制知之甚少，最常提出的5種機(jī)制包括神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、軸突再生、神經(jīng)元再生和髓鞘再生，神經(jīng)保護(hù)作用和移植細(xì)胞分泌某些因子有關(guān)，當(dāng)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌受損時(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)SCI的神經(jīng)保護(hù)作用會(huì)下降，但腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量非常低也會(huì)影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生存率，這就不清楚受損的脊髓中心組織的減少是由于腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌減少，還是繼發(fā)于其他骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的取決于細(xì)胞存活的神經(jīng)保護(hù)作用。免疫調(diào)節(jié)的研究大多數(shù)集中于SCI后細(xì)胞因子釋放的整體變化以及免疫細(xì)胞的豐度，但很少有研究分析移植細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的直接相互作用。移植細(xì)胞可以促進(jìn)軸突再生，研究人員發(fā)現(xiàn)這種再生能力和受損神經(jīng)元有關(guān)并且可以通過治療提高，但在經(jīng)常研究的挫傷SCI模型中，切斷的軸突數(shù)量是無(wú)法量化的。關(guān)于神經(jīng)元再生和髓鞘再生，研究人員通過移植神經(jīng)干祖細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)存在促進(jìn)神經(jīng)元再生的作用的同時(shí)可能產(chǎn)生異位組織并且發(fā)現(xiàn)髓鞘再生與功能改善有一定相關(guān)性，但是上述研究中并沒有量化移植前髓鞘再生軸突數(shù)量，所以并不能確定內(nèi)在的髓鞘再生是否受到影響。更好地理解這些機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)應(yīng)用時(shí)候的障礙且有效地建立SCI模型對(duì)干細(xì)胞移植成為臨床上可行的療法是重要的，并且可能會(huì)成為更加具有針對(duì)性的療法。