曠健 黃榕 劉沉濤

中南大學(xué)湘雅醫(yī)院兒科,長(zhǎng)沙410008

目前已知,大量的微生物定居在人體的皮膚和黏膜表面,從宿主或其他微生物汲取賴以生存所需要的營(yíng)養(yǎng),高度適用于人體的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。微生物組學(xué)指寄居在人體內(nèi)的微生物種類及其基因和基因組的總和。不同個(gè)體、不同軀體部位和不同時(shí)間的微生物組學(xué)組成均不相同[1]。黏膜免疫細(xì)胞和分子與人體暴露的細(xì)菌之間形成錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò),精確調(diào)節(jié)組織中免疫耐受和炎癥之間的平衡。生命早期形成的微生物群在宿主的成長(zhǎng)和免疫系統(tǒng)發(fā)育中起重要作用[2],延遲或被改變的這些微生物群將增加過(guò)敏和哮喘發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。本文著重綜述微生物組學(xué)在肺部免疫調(diào)節(jié)中的可能機(jī)制,腸道和呼吸道微生物群改變?cè)谙l(fā)病中的作用。

1 微生物組學(xué)作用的免疫機(jī)制

目前已知細(xì)菌通過(guò)多種機(jī)制參與誘導(dǎo)免疫耐受和抑制炎癥。微生物群的細(xì)胞壁成分和代謝產(chǎn)物都參與調(diào)節(jié)宿主對(duì)微生物和環(huán)境刺激的免疫反應(yīng)。部分共生菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌、梭狀芽胞桿菌增加小鼠調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞比例[4-5]。其中,梭狀芽胞桿菌通過(guò)刺激ILC3產(chǎn)生IL-22,有助于加強(qiáng)內(nèi)皮屏障功能,降低腹瀉時(shí)小腸黏膜的通透性[6]。大腸桿菌和乳酸桿菌通過(guò)刺激樹(shù)突狀細(xì)胞中維生素A、色氨酸和血紅素加氧酶1代謝,來(lái)促進(jìn)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞[7-8]。來(lái)源于脆弱類擬桿菌的莢膜多糖抗原A 通過(guò)直接作用于類漿細(xì)胞,從而促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞分泌IL-10[9]。來(lái)源于長(zhǎng)雙歧桿菌的表面多糖可抑制腸道和肺部Th17反應(yīng)[10]。攝入外源性長(zhǎng)雙歧桿菌后,健康志愿者周圍血中Foxp3+T 細(xì)胞增加,牛皮癬、潰瘍性結(jié)腸炎患者血清前炎癥因子CRP水平降低[11]。此外,腸道微生物代謝物短鏈脂肪酸,如醋酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽,可通過(guò)G 蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合,抑制組氨酸去乙酰化酶,促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞和T 細(xì)胞反應(yīng)[12]。人腸道細(xì)菌產(chǎn)生的大量生物胺影響機(jī)體的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)[13]。在小鼠模型中,微生物產(chǎn)生的精胺、組胺和?；撬峥杉せ钏拗鱊LRP6 炎癥小體信號(hào)通路,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-18,并促進(jìn)下游的抗微生物多肽分泌[14]。

2 微生物組學(xué)在哮喘模型中的研究

多個(gè)不同的動(dòng)物研究支持微生物組學(xué)在氣道疾病發(fā)病中的作用。在不暴露于任何病理或非病理微生物的無(wú)菌(germ free,GF)動(dòng)物中發(fā)現(xiàn),微生物群有助于降低過(guò)敏性氣道炎癥。Herbst 等觀察到,卵蛋白 (ovalbumin,OVA)激發(fā)后,GF小鼠中的2型氣道炎癥和氣道高反應(yīng)明顯強(qiáng)于共生微生物定植的無(wú)特定病原體 (specific pathogen free,SPF)小鼠。將GF小鼠與清潔小鼠共同飼養(yǎng)3周后,GF小鼠的2型氣道炎癥和氣道高反應(yīng)降至清潔小鼠水平,提示腸道和氣道共生菌具有保護(hù)作用[15]。此外,生命早期共生菌定居的GF 小鼠腸黏膜固有層和肺內(nèi)的自然殺傷細(xì)胞減少,從而減少了過(guò)敏性氣道反應(yīng)的嚴(yán)重程度;然而生命早期之后定植菌對(duì)疾病表型沒(méi)有影響,也不影響調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞或自然殺傷T 細(xì)胞的發(fā)育[16]。此外,重建腸道微生態(tài)社區(qū)有益于防治由于新生小鼠的抗生素治療導(dǎo)致的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞減少和Th細(xì)胞2型反應(yīng)增強(qiáng)[17-18]。

Gollwitzer等模擬嬰兒氣道微生物定植條件下,研究了不同年齡 (3、15、60 d)的小鼠對(duì)屋塵螨 (house dust mites,HDM)誘發(fā)的過(guò)敏性氣道炎癥的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：暴露于HDM 后,新生小鼠較年長(zhǎng)小鼠易誘發(fā)氣道嗜酸粒細(xì)胞增多,2型細(xì)胞因子釋放增加,并表現(xiàn)出較高的氣道高反應(yīng)性。年長(zhǎng)小鼠的這種保護(hù)作用與小鼠肺組織定植的細(xì)菌數(shù)量和GAMMA-變形桿菌和厚壁菌向擬桿菌優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)移有關(guān)。這項(xiàng)研究表明,小鼠體內(nèi)在生命早期缺乏特定的細(xì)菌種類將影響之后免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的形成,并使機(jī)體免疫平衡漂移至過(guò)敏而不是免疫耐受[19]。小鼠口服補(bǔ)充特定微生物如雙歧桿菌、Clostridium cladeⅣ和ⅩⅣ,或莢膜多糖PSA 脆弱擬桿菌后,通過(guò)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞相關(guān)IL-10分泌的抗炎反應(yīng),減輕過(guò)敏性氣道炎癥[20]。除了腸源性調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞遷移到肺部后產(chǎn)生抗炎作用外,微生物群產(chǎn)生的代謝物直接影響肺免疫應(yīng)答[21]。高纖維飲食增加了大腸桿菌和放線菌的種類,并減少厚壁菌和變形桿菌,由此抑制小鼠過(guò)敏性氣道炎癥[22]。微生物對(duì)Dtryptophan、維生素A,或生物胺代謝的作用還可調(diào)節(jié)肺內(nèi)Th細(xì)胞介導(dǎo)的2型變態(tài)反應(yīng)[23-24]。多項(xiàng)研究表明,小鼠呼吸道直接暴露在微生物產(chǎn)物如內(nèi)毒素或含Cp G 的寡核苷酸將抑制經(jīng)典特征哮喘發(fā)病[25-26]。例如,鼻內(nèi)大腸桿菌暴露將保護(hù)OVA 致過(guò)敏性氣道炎癥小鼠模型[27]。Suijs等[28]證明長(zhǎng)時(shí)間暴露低劑量?jī)?nèi)毒素或農(nóng)場(chǎng)灰塵可保護(hù)HDM 誘導(dǎo)A20小鼠哮喘。

3 腸道微生物在哮喘中的作用

腸道微生物群是人體最大細(xì)菌集落,由含有超過(guò)800萬(wàn)個(gè)基因的500～1 000個(gè)不同的細(xì)菌菌種組成,并影響宿主免疫系統(tǒng)[29]。在3歲時(shí),兒童腸道微生物群的組成達(dá)到成年人水平。歐洲的成年人腸道菌群優(yōu)勢(shì)菌群主要包括擬桿菌、厚壁菌、放線桿菌、變形桿菌等,胃、十二指腸、近端小腸優(yōu)勢(shì)菌群還包括鏈球菌、厭氧菌,雙歧桿菌[30]。腸道微生物群可通過(guò)多種機(jī)制影響遠(yuǎn)距離部位 (如肺)的免疫應(yīng)答：與健康志愿者比較,哮喘患者腸道分泌組胺的細(xì)菌數(shù)增加[31],組胺通過(guò)作用于組胺2 受體保護(hù)肺組織[32]。生命早期腸道微生物群受許多環(huán)境因素影響,如生活在微生物豐富的環(huán)境 (例如農(nóng)場(chǎng)、頻繁接觸家畜和寵物、或多樣化的飲食)中與兒童哮喘呈負(fù)相關(guān)[33-36]。嬰兒分娩方式顯著影響細(xì)菌定植,剖腹產(chǎn)嬰兒腸道通常定植更多的葡萄球菌屬,桿菌科目 (Bacillales),丙酸桿菌科,棒狀桿菌科,而較少定植不動(dòng)放線桿菌屬;經(jīng)陰道分娩嬰兒的腸道定植梭狀芽胞桿菌增加[37]。除外分娩方式和飲食,母體妊娠期使用的抗生素或生命早期抗生素治療持久地影響微生物群,如減少放線菌,增加擬桿菌和變形桿菌[1]。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)生命早期腸道菌群失調(diào)增加哮喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。出生后1個(gè)月內(nèi)定植的艱難梭菌與年齡在6～7歲前兒童喘息和6～7 歲哮喘患病有關(guān)[38]。與非哮喘兒童相比,發(fā)生哮喘學(xué)齡期兒童在出生1周或1個(gè)月時(shí)腸道菌群多樣性降低,但是與出生后1 歲時(shí)腸道菌群多樣性無(wú)明顯相關(guān)[39]。此外,腸道菌群中相對(duì)低豐度雙歧桿菌、阿克曼菌屬和糞桿菌屬,而相對(duì)高豐度特殊真菌 (假絲酵母)的新生兒,發(fā)生過(guò)敏或哮喘的風(fēng)險(xiǎn)增高。因此,生命早期腸微生物失調(diào)與增加哮喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[40]。然而,目前尚不清楚腸道內(nèi)的微生物失調(diào)是否可以直接驅(qū)動(dòng)哮喘發(fā)病,或者腸道微生物失調(diào)通過(guò)改變免疫應(yīng)答模式促進(jìn)哮喘發(fā)病。

4 呼吸道微生物在哮喘中的作用

由于既往認(rèn)為健康人氣道組織是無(wú)菌的,所以在2007年啟動(dòng)人類微生物計(jì)劃之初,研究者們未收集氣道組織標(biāo)本[41]。然而,不久之后一些研究者和研究團(tuán)隊(duì)的報(bào)道：健康人呼吸道微生物群的組成,及呼吸道微生物群在呼吸道疾病發(fā)病中的重要作用[42-44]。目前公認(rèn),健康呼吸道黏膜中含有眾多細(xì)菌菌群[45],其中,上呼吸道中細(xì)菌密度最高,鼻腔和鼻咽部每鼻拭子可達(dá)到103～106個(gè)活菌。健康人氣管和肺內(nèi)采集的支氣管肺泡灌洗中估計(jì)細(xì)菌數(shù)量約有102個(gè)細(xì)菌/ml[45-46]。呼吸道中常見(jiàn)的6種優(yōu)勢(shì)類菌群為厚壁菌、變形桿菌屬、擬桿菌屬、梭桿菌、嗜酸桿菌和放線桿菌[47]。Helty等[42]研究表明,哮喘和COPD 成人患者的上氣道,以及兒童哮喘下氣道中變形桿菌,尤其是嗜血桿菌占優(yōu)勢(shì)。Huang等[43,48]報(bào)道：癥狀控制4周后,采用吸入氟替卡松治療的哮喘患者氣道微生物多樣性與支氣管高反應(yīng)性呈正相關(guān)。此外,與輕中度哮喘患者相比,重癥哮喘患者氣道中克雷伯氏菌豐度增高,變形桿菌與Th17 相關(guān)基因在氣道上皮中的表達(dá)呈正相關(guān),肥胖型哮喘患者急性加重時(shí),痰中桿菌類/厚壁菌屬更為豐富。然而,放線菌與哮喘控制無(wú)明顯相關(guān)[49-50]。嚴(yán)重哮喘患者還與長(zhǎng)期攜帶肺炎支原體和衣原體密切相關(guān),為此目前歐美國(guó)家開(kāi)展了多個(gè)臨床試驗(yàn)來(lái)探討大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在這組患者中的應(yīng)用[51],但是研究得到的結(jié)果尚存在爭(zhēng)議,需要進(jìn)一步臨床試驗(yàn)。

氣道微生物在生命早期迅速增長(zhǎng),并且在之后的生命進(jìn)程中受環(huán)境、健康狀況和年齡的影響。已經(jīng)證明,出生方式 (經(jīng)陰道分娩或剖腹產(chǎn))、在生后的第1 小時(shí)生活環(huán)境,和出生后3～4個(gè)月的生活環(huán)境暴露是呼吸和腸道菌群塑造穩(wěn)定發(fā)展的至關(guān)重要階段[52-54]。人體與動(dòng)物研究表明：吸入攜帶微生物和微生物因子的塵埃粒子,通過(guò)調(diào)節(jié)先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng),參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展[28,55],但具體機(jī)制不清楚。目前兒童呼吸道微生物組學(xué)的研究工作主要集中于： (1)微生物如何在健康嬰兒上呼吸道定植?(2)環(huán)境因素,如母乳喂養(yǎng)、生活在農(nóng)場(chǎng)、兄弟姐妹、日托、寵物家庭、吸煙和抗生素使用對(duì)呼吸道微生物群的影響? (3)早期呼吸道微生物定植伴隨著急性呼吸道感染的發(fā)生,如呼吸道合胞病毒、鼻病毒和流感病毒,是否參與哮喘發(fā)病的作用機(jī)制[56-58]? Teo等[53]進(jìn)行前瞻性隊(duì)列研究?jī)和猿錾?歲不同時(shí)間點(diǎn)鼻咽部微生物群菌群。這個(gè)隊(duì)列中的健康嬰兒在出生后2個(gè)月齡時(shí)最初被定植葡萄球菌或棒狀桿菌屬,隨后穩(wěn)定定居異球菌或莫拉菌屬;而鏈球菌,莫拉菌或嗜血桿菌定植與出生后60周內(nèi)病毒相關(guān)的急性呼吸道感染相關(guān)。另一項(xiàng)研究報(bào)道,在出生后4周齡時(shí)呼吸道定植肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和/或卡他莫拉菌的嬰兒,將增加5歲時(shí)哮喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[44,59]。此外,上呼吸道定植葡萄球菌屬和莫拉菌屬的健康嬰兒在出生后2年內(nèi)呼吸道感染率較低[52,59-60]。有趣的是,盡管生活在傳統(tǒng)農(nóng)場(chǎng)的阿米什兒童和工業(yè)化程度較高農(nóng)場(chǎng)的哈特族兒童具有相似遺傳性,生活在傳統(tǒng)農(nóng)場(chǎng)的阿米什兒童中哮喘和過(guò)敏性疾病的患病率很低,而來(lái)自工業(yè)化程度較高農(nóng)場(chǎng)的哈特族兒童哮喘和過(guò)敏性疾病的患病率較高。研究者發(fā)現(xiàn),阿米什住宅環(huán)境灰塵中的微生物和內(nèi)毒素負(fù)荷較高[55],由此推測(cè)氣道微生物多樣性與HDM 過(guò)敏呈反比[61-62]。但是,目前還不知道是否粉塵相關(guān)微生物群的保護(hù)作用是由于多種細(xì)菌吸入和進(jìn)一步呼吸道定植的作用,或者是吸入細(xì)菌代謝物的作用。

5 前景展望

目前,盡管已知微生物群顯著影響宿主免疫系統(tǒng)成熟和免疫活性,但是這些免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的分子基礎(chǔ)才剛剛開(kāi)始闡明。尚不清楚：氣道微生物失調(diào)是否直接導(dǎo)致哮喘發(fā)病,抑或者僅僅參與肺內(nèi)免疫反應(yīng);新型細(xì)菌菌株及其組分的鑒定,和細(xì)菌調(diào)節(jié)黏膜免疫機(jī)制等。兒童前瞻性出生隊(duì)列與橫斷面研究提高了我們對(duì)健康兒童或患病兒童的氣道或者消化道中保護(hù)性細(xì)菌定植時(shí)間窗的認(rèn)識(shí)。然而,需要進(jìn)一步的作用機(jī)制和流行病調(diào)查研究來(lái)揭示不同細(xì)菌菌株、宿主、過(guò)敏原和病毒之間的復(fù)雜聯(lián)系。健康成人、哮喘患者和其他慢性病患者之間的氣道微生物群差異已經(jīng)進(jìn)行了深入的研究。部分研究展現(xiàn)了哮喘患者的臨床特征和呼吸道微生物差異表型。然而,為了了解哮喘患者疾病表型和內(nèi)型,哮喘易感性和疾病進(jìn)展之間的聯(lián)系,仍需要大樣本、多中心的縱向和前瞻性分析。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突