文 樂，李 波，朱繼孝，鐘國躍，王洪玲*，陳 影，張梓杰，李 星，蔣 坤

(1.江西中醫(yī)藥大學中藥資源與民族藥研究中心，江西南昌 330004；2.貴州百靈企業(yè)集團制藥股份有限公司，貴州安順561000)

尼泊爾酸模(RumexnepalensisSpreng.)為蓼科酸模屬多年生草本植物，主要產(chǎn)于西南部、甘肅南部、青海西南部等地區(qū)，具有止血、止痛的功效[1]。尼泊爾酸模在貴州民間作為土大黃基原品種之一，收錄于2003版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》里，具有清熱解毒、殺蟲的功效，用于治療肝炎及各種炎癥、目赤、便秘等[2]，其化學成分主要包括蒽醌類、黃酮類等化合物[3-6]，但其抗炎藥效物質(zhì)尚不清楚。基于此，筆者以尼泊爾酸模為研究對象，結(jié)合二甲苯致小鼠腫脹模型和角叉菜膠致大鼠足腫脹模型篩選其有效部位，并對有效部位進行化學成分研究，找到其活性成分，為土大黃的質(zhì)量標準研究提供一定的化學和藥理學方面的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物。210只SD大鼠，雄性SPF級，體重(200±20)g，200只昆明種小鼠，雄性SPF級，體重(20±2)g，均由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證號SCXK(湘)2016-0002。

1.1.2試劑及藥物配制。尼泊爾酸模由貴州百靈企業(yè)集團制藥股份有限公司提供，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學鐘國躍研究員鑒定為尼泊爾酸模(RumexnepalensisSpreng.)。王洪玲等[7]對尼泊爾酸模進行提取和分離，從中得到4個部位[水部位(RNS1，898 g)、30%乙醇部位(RNS2，77 g)、50%乙醇部位(RNS3，32 g)、90%乙醇部位(RNS4，23 g)]和5個單體化合物[大黃素(emodin，1)、大黃酚(chrysophanol，2)、大黃素甲醚(physcion，3)、大黃酸(rhein，4)、白藜蘆醇(resveratrol，5)]。此外，從90%乙醇部位也分離得到化合物1 和3。總蛋白試劑盒(批號20170309)、超氧化物歧化酶試劑盒(批號20170612)、丙二醛試劑盒(批號20170613)購買于南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α試劑盒(批號20170602)、大鼠IL-1β ELISA試劑盒(批號20170602)購買于欣博盛生物科技有限公司；阿司匹林腸溶片(批號161208)購買于大同市利群藥業(yè)有限公司；二甲苯(分析純)、冰醋酸(分析純)購買于國藥集團；角叉菜膠(批號1408463)購買于西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

1.1.3儀器。Beckman ALLegra64R高速冷凍離心機(美國曼庫爾特公司)；AU400全自動生化分析儀(日本Olympus光學株式會社)；UV-1800紫外可見分光光度計(日本島津公司)；Forma -86 ℃ 超低溫冰箱(美國Thermo集團)；Multiskan GO全波長酶標儀(美國Thermo公司)；DY89-Ⅱ 電動勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2方法

1.2.1尼泊爾酸模不同部位提取物及5種主要成分對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響。200只小鼠隨機分為20組，每組10只，分別為模型組、阿司匹林陽性對照組，RNS1低、高劑量組，RNS2低、高劑量組，RNS3低、高劑量組，RNS4低、高劑量組，emodin低、高劑量組，chrysophanol低、高劑量組，rhein低、高劑量組和resveratrol低、高劑量組，不同部位提取物劑量設(shè)計按《貴州省中藥材、民族藥質(zhì)量標準》[2]規(guī)定人用劑量每天9 g，根據(jù)體表面積換算為小鼠1.17 g/kg，高劑量為低劑量的2倍，即2.34 g/kg，5種單體化合物參照常用劑量設(shè)置化合物低、高劑量分別為50、100 mg/kg。參照文獻[8]設(shè)定阿司匹林小鼠劑量為0.2 g/kg。模型組灌胃蒸餾水，陽性對照組灌胃阿司匹林藥液，各藥物組灌胃相應的藥液，連續(xù)給藥5 d，于末次給藥后30 min后，用二甲苯30 μL均勻涂抹每只鼠右耳兩面致炎，左耳作為對照。致炎后30 min脫頸椎處死小鼠，以8 mm 直徑打孔器取下耳緣左、右耳片，稱量質(zhì)量，以右、左耳片重量差表示腫脹度，并計算腫脹抑制率。腫脹度(mg)=右耳耳片質(zhì)量(mg)-左耳耳片質(zhì)量(mg)；腫脹抑制率=[(模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/模型組平均腫脹度]× 100%。

1.2.2尼泊爾酸模不同部位提取物及5種主要成分對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響。210只大鼠，分別為正常組、模型組、阿司匹林陽性對照組、不同部位提取物及5種化合物低、高劑量組，提取物給藥劑量根據(jù)人用劑量和體表面積換算為大鼠0.81 g/kg，高劑量為低劑量的2倍，即1.62 g/kg，化合物低、高劑量分別為50、100 mg/kg。連續(xù)給藥5 d，末次給藥后測定右足趾致炎前的體積，末次給藥后30 min，在各組大鼠的右后足跖皮下注射1%角叉菜膠0.1 mL致炎，在致炎后3 h用足容積測量器測定右足趾致炎后的體積，以致炎前后體積差為足趾腫脹度。按公式計算足跖腫脹度：足跖腫脹度=(致炎后足容積-致炎前足容積)/致炎前足容積×100%。

同時5種單體化合物組的大鼠摘眼球取血后全血3 000 r/min離心 5 min，取上層血清置于 4 ℃冰箱中冷藏備用，按照試劑盒說明書對血清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)進行測定。脫頸處死大鼠，并剪下大鼠炎癥右后足，稱重，以預冷的生理鹽水為勻漿介質(zhì)，制備成10%的組織勻漿，4 ℃ 3 000 r/min離心15 min，將離心好的勻漿留上清，待用。TNF-α、IL-1β等指標的測定均按照試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果與分析

2.1尼泊爾酸模不同部位提取物及5種主要成分對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響試驗結(jié)果表明(圖1)，與模型組相比，阿司匹林組和RNS2、RNS3高劑量組小鼠耳腫脹度有顯著降低(P<0.05)；5種單體化合物除了rhein的低劑量組對小鼠耳腫脹沒有抑制作用，其他各給藥組小鼠耳腫脹度均顯著降低，且以高劑量組對小鼠耳腫脹抑制作用較好，其中emodin、chrysophanol的高劑量組效果與阿司匹林組相當。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01Note：Compared with the model group，*P<0.05，**P<0.01圖1 尼泊爾酸模不同部位提取物及5種主要成分對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響Fig.1 Effect of extracts from different parts of Rumex nepalensis and five main components on xylene-induced ear swelling in mice

2.2尼泊爾酸模不同部位提取物及5種主要成分對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響由圖2可知，與模型組相比，阿司匹林組和RNS2、RNS3高劑量組可抑制大鼠足腫脹度(P<0.05)；emodin的高劑量組以及chrysophanol、physcion的低、高劑量大鼠足腫脹度明顯降低(P<0.05)。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01Note：Compared with the model group，*P<0.05，**P<0.01圖2 尼泊爾酸模不同部位提取物及5種主要成分對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響Fig.2 Effect of extracts from different parts of Rumex nepalensis and five main components on rat paw swelling caused by carrageenan

2.3尼泊爾酸模中5種主要成分對角叉菜膠致大鼠足腫脹組織炎漿的TNF-α和IL-1β含量影響由圖3可知，與正常組大鼠相比，模型組大鼠的TNF-α和IL-1β顯著升高(P<0.01)，說明造模成功。與模型組相比，emodin、chrysophanol、physcion和rhein低、高劑量大鼠組織炎漿中的TNF-α顯著降低；但是僅有emodin、chrysophanol、physcion的高劑量IL-1β有所降低(P<0.05)。

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01Note：Compared with the normal group，#P<0.05，##P<0.01；compared with the model group，*P<0.05，**P<0.01圖3 尼泊爾酸模中5種主要成分對角叉菜膠致大鼠足腫脹及組織炎漿中的TNF-α(a)和IL-1β(b)含量的影響Fig.3 Effect of five main components in Rumex nepalensis on the content of TNF-α(3A)and IL-1β(3B)in rat paw swelling and tissue inflammatory pulp caused by carrageenan

2.4尼泊爾酸模中5種主要成分對角叉菜膠致大鼠足腫脹大鼠血清SOD和MDA含量的影響由表1可知，與模型組相比，除resveratrol低劑量組外，5種主要成分各給藥組血清中MDA含量顯著降低，其中emodin的高劑量，physcion和rhein的低、高劑量組優(yōu)于阿司匹林組。此外，僅physcion的低、高劑量以及rhein、resveratrol的高劑量組大鼠血清中SOD活性升高(P<0.05)。

表1尼泊爾酸模中5種主要成分對角叉菜膠致足腫脹大鼠血清中SOD和MDA含量的影響

Table1EffectsoffivemaincomponentsinRumexnepalensisonthecontentsofserumSODandMDAinratswithcarrageenan-inducedfootswelling

組別Group劑量Dosagemg/kgSODU/mLMDAnmol/mL正常組Normal group—314.94±44.583.91±0.57模型組Model group—228.17±11.99#7.59±0.88##阿司匹林組Aspirin group200266.27±42.815.04±0.48??emodin50299.56±28.525.14±0.52??100268.11±16.843.50±0.35??chrysophanol50263.57±15.925.06±0.35??100258.98±10.866.16±0.24?physcion50347.69±36.52??3.61±0.20??100328.70±27.85?4.61±0.33??rhein50267.64±44.043.45±0.28??100467.43±41.95??4.41±0.14??resveratrol50217.77±18.957.57±0.45100451.74±29.45??5.27±0.26??

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

Note：Compared with the normal group，#P<0.05，##P<0.01；compared with the model group，*P<0.05，**P<0.01

3 討論與結(jié)論

該試驗首次通過建立二甲苯致小鼠腫脹模型和角叉菜膠致大鼠足腫脹模型篩選尼泊爾酸模的有效部位，結(jié)果表明30%乙醇部位(RNS2)、50%乙醇部位(RNS3)是其活性部位。

土大黃中含有較多的游離蒽醌類成分，如大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等[9]。王洪玲等[7]通過對有效部位的分離純化，獲得了5個量大化合物，即大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃酸和白藜蘆醇。其中大黃素在體外對巨噬細胞產(chǎn)生的多種炎癥細胞因子有調(diào)節(jié)作用[10]，對急性胰腺炎有抗炎作用[11]。大黃酚能改善腦缺血/再灌注小鼠記憶功能[12]，對小鼠腦缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護作用[13]；對大黃素甲醚的藥理作用主要集中在缺血、缺氧腦損傷或缺血-再灌注腦損傷的神經(jīng)保護作用等方面；大黃酸對糖尿病有治療作用，并對細菌脂多糖誘導的RAW264.7細胞炎癥反應具有一定的抑制作用[14]；白藜蘆醇具有降血尿酸、抗炎等作用[15]。這些成分雖大多曾有報道過其體內(nèi)(外)抗炎活性，但未見報道哪個(或哪些)成分為尼泊爾酸模抗炎的主要活性成分。該研究對30%和50%乙醇部位含量較大的化學成分進行活性篩選，結(jié)果表明同等劑量條件下，大黃素、大黃酚和大黃素甲醚抗炎活性較強，且其在藥材中含量較高，可能為其主要活性成分；對角叉菜膠致大鼠足腫脹組織炎漿生化指標的檢測結(jié)果表明其抗炎的作用機制可能是與抑制脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物MDA，以及調(diào)控TNF-α和IL-1β等炎癥因子的釋放有關(guān)。

此外，值得注意的是，尼泊爾酸模50%和90%乙醇部位均分離得到大黃素和大黃素甲醚，但是90%乙醇部位并未顯示明顯的抗炎作用，推測可能是90%乙醇部位色素較多導致大黃素和大黃素甲醚含量相對較低的原因。尼泊爾酸模具有抗炎作用，下一步將繼續(xù)采用細胞和分子水平對其分離得到的化合物進行抗炎活性篩選，為以后尼泊爾酸模的開發(fā)和利用提供一定的化學和藥理學基礎(chǔ)。