劉佳易 肖恩華*

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）最初是由澳大利亞醫(yī)生Thomas于1869年在乳腺癌病人血液中發(fā)現(xiàn)，它是從原發(fā)實(shí)體腫瘤轉(zhuǎn)移到外周循環(huán)或淋巴系統(tǒng)并最終在骨髓、淋巴結(jié)或被轉(zhuǎn)移的器官中生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞[1]。它的生長(zhǎng)和傳播貫穿了腫瘤生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期。

肝癌是全球第六大常見腫瘤，致死率位列第二[2]。它具有高致死率和高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)，早期診斷和治療也是臨床應(yīng)對(duì)肝癌處置的難點(diǎn)。早期篩查有利于延長(zhǎng)肝癌病人的生存時(shí)間，早期確診也有利于采用多種治療方式，從而改善預(yù)后[3]。但事實(shí)上，臨床上僅有30%～40%的肝癌病人能夠在早期獲得有效的治療，且僅有少數(shù)幾種生物標(biāo)志物作為肝癌評(píng)價(jià)指標(biāo)，其中甲胎蛋白（alpha fetoprotein,AFP）是應(yīng)用最為廣泛的生物標(biāo)志物。但AFP目前存在一定的局限性，如假陽性結(jié)果比例較高，缺乏足夠的敏感性和特異性。

近年來CTC檢測(cè)在肝癌中的應(yīng)用可謂發(fā)展迅速，包括機(jī)制研究、檢測(cè)技術(shù)的更新、早期診斷、治療或預(yù)后評(píng)價(jià)等多方面。本文結(jié)合近5年有關(guān)肝癌CTC研究的最新成果進(jìn)行綜述。

1 CTC轉(zhuǎn)移機(jī)制及轉(zhuǎn)移特性

1.1 轉(zhuǎn)移機(jī)制 CTC轉(zhuǎn)移機(jī)制大致包括CTC分離、細(xì)胞表面物質(zhì)轉(zhuǎn)化、聚集、黏附等4個(gè)步驟[4]。CTC分離的開始階段為原發(fā)腫瘤侵犯鄰近血管或新生血管形成，隨著血液的剪切力沖擊血管壁，腫瘤CTC從原發(fā)病灶中分離出來。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，肝癌CTC與原發(fā)腫瘤分離后，細(xì)胞表面物質(zhì)將繼續(xù)保持固定的表型，并一直到繼發(fā)轉(zhuǎn)移病灶出現(xiàn)，因而不存在CTC表面物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。近年來研究發(fā)現(xiàn)，肝靜脈中的CTC表面特征與上皮細(xì)胞接近，而在向遠(yuǎn)處遷移過程中CTC表面間充質(zhì)特征更加明顯。有研究者[1]認(rèn)為，CTC的間充質(zhì)表現(xiàn)可能類似于火車頭樣改變，即CTC按照鏈條狀結(jié)構(gòu)排列，位于前位的CTC細(xì)胞不斷的發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，而位于后位的CTC細(xì)胞轉(zhuǎn)化率較低。正常細(xì)胞脫離組織或細(xì)胞外基質(zhì)會(huì)出現(xiàn)失巢凋亡，但CTC可通過聚集的方式來抵抗失巢凋亡的發(fā)生[2]。CTC間充質(zhì)表型在聚集過程中起到促進(jìn)作用，微血管栓塞或血栓形成可導(dǎo)致局部缺氧從而誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 （epithelial to mesenchymal，EMT）。同時(shí)，激活EMT分化的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和表皮生長(zhǎng)因子受體 （epidermal growth factor receptor，EGFR）等趨化因子水平也明顯升高。此外，CTC表面蛋白的高表達(dá)也有助于CTC聚集，如波形蛋白等。這些病理生理變化都為CTC聚集提供了條件，從而為CTC在原發(fā)腫瘤外的生長(zhǎng)提供了保障[3]。

當(dāng)CTC途經(jīng)點(diǎn)附近血流速度降低或通過較細(xì)的毛細(xì)血管時(shí)，較大的CTC或循環(huán)腫瘤微栓子（circulating tumor microemboli，CTM）會(huì)出現(xiàn)滯留，此現(xiàn)象與血管血栓形成密切相關(guān)，尤其在微血管中的栓塞現(xiàn)象更為明顯[4]。同時(shí)，CTC在表面黏附分子、趨化因子、外泌體等多種物質(zhì)作用下，CTC最終黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞上方。

1.2 轉(zhuǎn)移特征 根據(jù)腫瘤干細(xì)胞假說，有研究者[5]對(duì)CTC是否具有干細(xì)胞特征進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)CTC可表達(dá)腫瘤干細(xì)胞表面生物標(biāo)志物 （如CD90、CD44）并激活WNT信號(hào)通路；在蛋白水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)β-連環(huán)蛋白、波形蛋白，它們?cè)诩?xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有不同程度積累。因此，CTC具有腫瘤干細(xì)胞的特性，這可能是腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的“種子”。

有研究[1]發(fā)現(xiàn)與原發(fā)腫瘤處靜脈CTC數(shù)量相比，外周動(dòng)脈CTC數(shù)量顯著減少，從而證實(shí)CTC在體內(nèi)不同血管中的數(shù)量存在差異?？赡苡捎贑TC通過肺毛細(xì)血管被較小管徑的血管濾過后數(shù)量減少，這與肝癌病人肺轉(zhuǎn)移概率大的情況相吻合。

CTM為CTC聚集而成，它的侵襲能力和黏附能力明顯高于單個(gè)CTC。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[6]中，研究人員從肝癌小鼠肝靜脈中提取出了CTM，在小鼠肺靜脈中并沒有發(fā)現(xiàn)CTM的存在，但在外周靜脈中被檢測(cè)出來?？赡芘c肺毛細(xì)血管濾過有關(guān)，并且單個(gè)CTC可能會(huì)自發(fā)聚集，以減輕來自血流微環(huán)境的影響。因此，CTC聚集可能代表一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程而不是隨機(jī)的過程。

2 CTC檢測(cè)技術(shù)

2.1 物理學(xué)方法 CTC的物理學(xué)檢測(cè)主要利用CTC的物理學(xué)特性，包括密度、大小、遷移能力、變形性和電荷等。其中單純過濾法對(duì)CTC進(jìn)行提取的檢測(cè)方式基于CTC與其他血細(xì)胞大小不同的原理，其中腫瘤細(xì)胞直徑（17～52 μm）大于紅細(xì)胞（6～8 μm）和白細(xì)胞（7～15 μm）[7]。 然而，濾過會(huì)受到多種因素的影響，如流速、濾孔壓力、細(xì)胞表面黏度等[8]。此外，CTC的物理特性與正常血液細(xì)胞可能存在相同之處，單一使用該方法可能有時(shí)難以保證CTC檢測(cè)的特異性。因此，多種過濾裝置（過濾網(wǎng)、梯度離心）相結(jié)合，可能會(huì)進(jìn)一步提高CTC檢出的準(zhǔn)確率[9]。在多種物理濾過法相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)中，Rarecells公司開發(fā)的ISET?捕獲儀是其中的代表之一，它的優(yōu)勢(shì)是可以提高CTC檢測(cè)敏感度，并從血液中提取含量稀少的CTC和CTM，同時(shí)最大限度保持形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整[10]。

2.2 生物學(xué)方法 CTC的生物學(xué)檢測(cè)主要依靠肝癌表面特異性靶點(diǎn)，如上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）[11]及特定的生物學(xué)表型如上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）來達(dá)到檢測(cè)目的。目前Cellsearch是唯一一種通過美國(guó)FDA認(rèn)證的檢測(cè)方法，它利用的就是EpCAM抗體捕捉CTC的方法，因?yàn)槠錂z測(cè)敏感度較高，在多種腫瘤的研究中均有應(yīng)用。但該方法存在一定的局限性，如在肝癌CTC中，僅有30%~40%的CTC表達(dá)EpCAM且Cellsearch方法僅能檢測(cè)CTC的數(shù)量，缺乏有效的表型鑒定及收集CTC上皮特征信息的功能。其他原理大致相同的技術(shù)如微流控芯片 （CTC-iChip）[12]、體內(nèi)上皮細(xì)胞采樣針（CellCollector）[13]等。EMT檢測(cè)則主要通過內(nèi)皮樣或間質(zhì)樣標(biāo)志物，如CD31、膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ型，從而達(dá)到檢測(cè)的目的。它們?cè)诒ＷC檢測(cè)CTC的敏感性和特異性的同時(shí)，對(duì)CTC表面物質(zhì)進(jìn)行分析并提取具有活性的CTC，提取出的CTC采用免疫組織化學(xué)、免疫染色和PT-PCR等方法進(jìn)一步對(duì)CTC下游過程進(jìn)行驗(yàn)證[14]。

2.3 其他檢測(cè)方法 最近的研究[15]表明CTC檢測(cè)手段獲得的結(jié)果并不完全一致，主要表現(xiàn)在結(jié)果的可重復(fù)性差、表面分子標(biāo)志物及表型檢測(cè)手段單一等方面。與此同時(shí)，基于不同原理的新技術(shù)的不斷產(chǎn)生，促進(jìn)了CTC檢測(cè)的發(fā)展，包括仿生納米技術(shù)、生物學(xué)和物理學(xué)相結(jié)合的國(guó)產(chǎn)CanPatrol?檢測(cè)技術(shù)、不需要生物抗體結(jié)合的流式CTC檢測(cè)技術(shù)等[16-18]。因此，在選擇CTC作為臨床觀察指標(biāo)的過程中，反復(fù)抽樣或與其他檢測(cè)方式的聯(lián)合可能有助于提高CTC檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性。

3 CTC在肝癌早期診斷中的應(yīng)用

肝癌通過循環(huán)系統(tǒng)向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是一種被廣泛認(rèn)可的傳播方式，早期肝癌就可能存在轉(zhuǎn)移，因此CTC的檢測(cè)在肝癌的早期診斷中具有一定的優(yōu)勢(shì)。

在CTC研究的早期階段，對(duì)肝癌早期診斷主要是通過對(duì)CTC數(shù)量進(jìn)行評(píng)估。CTC數(shù)量與標(biāo)準(zhǔn)的巴塞羅那（Barcelona-Clínic Liver Cancer,BCLC）分期、血清AFP水平間存在明顯正相關(guān)性。不僅CTC數(shù)量與分期相關(guān)，CTC不同表型（如上皮表型、間充質(zhì)表型、雜交表型等）也與分期存在較好的相關(guān)性[16]。

隨著技術(shù)的發(fā)展和與其他學(xué)科的交叉運(yùn)用，CTC在肝癌的早期診斷中的準(zhǔn)確性有了進(jìn)一步提升。例如將CTC與基因組學(xué)的結(jié)合，Lustberg等[17]采用微流控芯片(microfluidic chip,iChip)直接濾出血液中的紅細(xì)胞、血小板、血漿等成分，同時(shí)保留了具有活性的CTC，通過與PCR技術(shù)相結(jié)合，在早期肝癌和AFP陰性的病人外周血中找到CTC。此外，CTC檢測(cè)與其他生物標(biāo)志物的檢測(cè)方法相結(jié)合形成多標(biāo)志物模型更是將診斷的敏感度和特異度提高到了90%以上[18]。利用不同數(shù)學(xué)模型的方法，例如邏輯回歸和分類與回歸樹，在不同病因下與CTC檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行結(jié)合后建模分析，也為診斷早期肝癌提供了較高的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性[19]。

值得注意的是，Wang等[20]的一項(xiàng)回顧分析研究中，對(duì)比不同組檢測(cè)手段在肝癌診斷中的準(zhǔn)確性，不建議將CTC檢測(cè)作為肝癌的一種獨(dú)立的診斷工具。

4 CTC在肝癌復(fù)發(fā)和預(yù)后中的應(yīng)用

多項(xiàng)研究表明，CTC與肝癌復(fù)發(fā)及預(yù)后密切相關(guān)。Liu等[21]收集了123例肝癌根治性切除術(shù)病人的血樣，提示EpCAM陽性CTC可作為實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)治療療效的指標(biāo)，也可作為肝癌復(fù)發(fā)的治療靶點(diǎn)。術(shù)前EpCAM陽性CTC計(jì)數(shù)≥2是肝癌病人術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，尤其在AFP水平≤400 ng/mL的病人亞組中，其復(fù)發(fā)比例與AFP水平＞400 ng/mL的病人間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Kalinich等[22]將299例接受不同治療方案的肝癌病人與120例未患肝癌者的CTC計(jì)數(shù)對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，EpCAM陽性的CTC不僅可用于早期治療決策，而且可以對(duì)病人早期復(fù)發(fā)率的評(píng)估提供判斷依據(jù)。Liu等[21]首次報(bào)道利用干細(xì)胞表型 （CD90+，CD44+）CTC對(duì)肝癌切除術(shù)復(fù)發(fā)進(jìn)行評(píng)價(jià)。角蛋白K19被證明是肝癌CTC干細(xì)胞表型標(biāo)志物，在CTC細(xì)胞檢測(cè)中作為輔助標(biāo)志物對(duì)預(yù)后有著重要意義。

CTC中RNA水平也具有一定的臨床意義，研究表明將所提取的CTC中RNA進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)不僅能對(duì)肝癌診斷有效，而且也是預(yù)測(cè)肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的評(píng)價(jià)工具。Okajima等[23]通過對(duì)肝癌切除術(shù)后隨訪病人血液標(biāo)本CTC基因?qū)W檢測(cè)，證實(shí)腫瘤特異性抗原MAGE基因?qū)Ω伟╊A(yù)測(cè)預(yù)后和監(jiān)測(cè)治療療效有一定臨床價(jià)值，GPC-3基因的高表達(dá)可以作為評(píng)價(jià)肝癌的早期復(fù)發(fā)的可靠生物標(biāo)志物。AFP、EpCAM、CD90、CD133和CK19的聯(lián)合檢測(cè)與單獨(dú)測(cè)量AFP和EpCAM陽性CTC相比，前者具有更高的特異性；檢測(cè)亞洲人群慢性乙肝和肝硬化病人的肝癌發(fā)生率時(shí)，它的效應(yīng)值更高[24]。

CTC的間充質(zhì)表型提高了CTC向血管侵犯的能力，進(jìn)而增加了轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。一項(xiàng)研究[25]通過對(duì)CTC中波形蛋白進(jìn)行分析評(píng)價(jià)了46例肝癌轉(zhuǎn)移病人CTC可能具有的間葉組織特性，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中80.4%的病人波形蛋白存在過表達(dá)，且波形蛋白表達(dá)的程度與并發(fā)癥的發(fā)生率存在明顯的正相關(guān)。

5 CTC在肝癌中的應(yīng)用前景

CTC在傳播過程中存在表型異質(zhì)性，而人體各部位CTC存在數(shù)量的異質(zhì)性，這些現(xiàn)象背后機(jī)制的問題仍不清楚，因此CTC異質(zhì)性的檢測(cè)成為了目前CTC研究中需要重點(diǎn)解決的問題。相關(guān)機(jī)制研究主要集中在基因、分子水平，Sun等[26]通過利用DNA倍體分析、陣列比較基因組雜交等技術(shù)，證實(shí)42%~53%的復(fù)發(fā)腫瘤的基因型與原發(fā)腫瘤的基因型存在明顯差異，且不同基因型所對(duì)應(yīng)的復(fù)發(fā)中位數(shù)時(shí)間也存在明顯不同。另一方面，腫瘤在生長(zhǎng)和自然選擇過程中，腫瘤內(nèi)部的成分發(fā)生了諸多變化，瘤內(nèi)分子成分同樣存在異質(zhì)性。β-連環(huán)蛋白、谷氨酰胺合成酶、CK7、CD44、EpCAM 以及 TP53和 CCNB1突變體等被認(rèn)為與肝癌瘤內(nèi)異質(zhì)性有關(guān)[27]。因此，未來的研究結(jié)合基因組學(xué)和蛋白組學(xué)，如CTC單細(xì)胞測(cè)序、蛋白芯片等方式，將有可能以縱向和動(dòng)態(tài)的方式在基因和分子水平揭示CTC轉(zhuǎn)移過程的全貌。

CTC在人體內(nèi)的分布不均勻，尤其在原發(fā)腫瘤回流靜脈中含量較高，如肝癌中肝靜脈是CTC數(shù)量增高明顯的區(qū)域。因此，肝臟CTC的攔截可能是未來治療的新手段，例如通過介入手段在肝靜脈內(nèi)植入肝癌細(xì)胞濾器從而阻斷從原位肝癌中分離的CTC，將可能降低肝癌病人術(shù)后肺轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。

在治療和預(yù)后評(píng)估方面，有關(guān)肝癌CTC的臨床實(shí)驗(yàn)主要集中在肝癌切除術(shù)后評(píng)價(jià)，對(duì)于其他術(shù)式如選擇性肝動(dòng)脈化學(xué)栓塞（TACE）、肝移植、肝射頻消融和化療藥物、分子靶向藥物在臨床的應(yīng)用等方面的研究目前少有文獻(xiàn)報(bào)道。未來更多的臨床實(shí)驗(yàn)并結(jié)合分子影像學(xué)或基因組學(xué)等技術(shù)手段將進(jìn)一步闡明CTC在肝癌治療和預(yù)后中的作用[28]。

6 總結(jié)

CTC是一種新型而具有應(yīng)用前景的生物標(biāo)志物。在肝癌的各個(gè)階段如診斷、治療方案的選擇、預(yù)后等方面均有重要的應(yīng)用價(jià)值。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，CTC的檢測(cè)比以往具有更高的準(zhǔn)確性。更多多中心前瞻性研究的數(shù)據(jù)將為CTC檢測(cè)準(zhǔn)確性和臨床評(píng)估提供強(qiáng)有力的證據(jù)。盡管如此，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)流程是其目前未能廣泛運(yùn)用于臨床工作中的原因之一。各研究中對(duì)檢測(cè)技術(shù)的選擇、病人的入組條件、樣本類型等方面也存在差異。因此，在未來的研究中，對(duì)檢測(cè)方法的統(tǒng)一、嚴(yán)格的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)、合理的標(biāo)本取材和儲(chǔ)存等方面需要更加重視。