徐剛 陸倫根

原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)是一種慢性緩慢進(jìn)展的肝臟疾病，與自身免疫異常有關(guān)，通過選擇性破壞中小膽管，導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁淤積和肝損傷。PBC最常見于中年婦女，男/女比例約1∶1.6～10。

PBC的發(fā)病機(jī)制目前仍不明確。在過去數(shù)十年里，學(xué)者認(rèn)為，環(huán)境因素與PBC的免疫耐受缺失及病理發(fā)病機(jī)制有關(guān)。微生物、真菌及病毒的感染，微生物群，污染及輻射等因素被認(rèn)為是可能的疾病誘發(fā)因素。目前認(rèn)為PBC受多因素、多基因影響，不僅環(huán)境因素會(huì)導(dǎo)致免疫耐受破壞，遺傳易感性及表觀遺傳同樣在PBC的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

一、遺傳易感性

雙胞胎的研究發(fā)現(xiàn)，單卵雙生嬰兒中將來(lái)PBC的發(fā)病率較異卵雙生高，高度提示有明顯的遺傳易感性，但單卵雙生也存在不一致，單卵雙生子中，患病者和非患病者的基因表達(dá)譜出現(xiàn)差異，包括拷貝數(shù)變異和DNA甲基化模式的改變。此外，罹患PBC的女性患者中頻繁出現(xiàn)X染色體單體，尤其是在B細(xì)胞和T細(xì)胞，這部分解釋了為何女性易罹患PBC。X染色體的丟失有傾向性，通常多見于一側(cè)親代來(lái)源的染色體。因此，在PBC患者中需要進(jìn)一步的遺傳資料分析和X染色體相關(guān)的研究以證實(shí)并進(jìn)一步深化對(duì)這些遺傳改變的理解。

(一)染色體結(jié)構(gòu)的改變 端粒是位于染色體末端的重復(fù)DNA結(jié)構(gòu)，和特定蛋白結(jié)合。端粒重復(fù)結(jié)構(gòu)的丟失導(dǎo)致細(xì)胞衰老。研究發(fā)現(xiàn)[1]，在慢性病毒性肝炎和PBC時(shí)被破壞的小膽管和毛細(xì)膽管的膽管內(nèi)皮細(xì)胞(BECs)中，端粒較PBC未被破壞的膽管和毛細(xì)膽管的BECs明顯變短。端粒失調(diào)引起DNA破壞，提示端粒的縮短導(dǎo)致膽管細(xì)胞的衰老，可能參與了PBC膽管破壞過程。

(二)PDC-E2免疫耐受性的破壞 PBC與PDC-E2免疫耐受的缺失密切相關(guān)。在培養(yǎng)的人BECs細(xì)胞的凋亡小泡膜表面發(fā)現(xiàn)原生及抗原激活的PDC-E2，形成細(xì)胞頂體(apotope)，從而激活免疫系統(tǒng)，BECs凋亡和對(duì)凋亡細(xì)胞吞噬作用的變化可以很好的解釋了PBC的組織特異性和對(duì)線粒體抗原耐受性的破壞。很多觀點(diǎn)均支持化學(xué)復(fù)合物和(或)感染因子極有可能通過分子相似和交叉反應(yīng)機(jī)制與耐受破壞有關(guān)。

(三)陰離子交換體2AE2和PBC：分泌障礙的關(guān)系 早在20世紀(jì)90年代早期，Prieto等提出，PBC患者存在膽道碳酸氫鹽分泌異常，并與膽汁淤積有關(guān)。兩種膽汁酸相關(guān)治療可改善膽汁淤積相關(guān)的生化和組織學(xué)改善，生存期延長(zhǎng)[2]。PBC患者肝活檢組織和外周血單核細(xì)胞中AE2的表達(dá)較正常對(duì)照明顯降低。此外，在PBC患者體內(nèi)分離培養(yǎng)的膽管細(xì)胞中，AE2的活性也較正常人膽管細(xì)胞降低。這些資料均提示，PBC患者存在膽道碳酸氫鹽分泌過程的損害，導(dǎo)致膽汁淤積。此外，膽管細(xì)胞內(nèi)pH(pHi)的改變可引起嚴(yán)重的細(xì)胞功能紊亂和膽管細(xì)胞損傷。Ae2a-/b-小鼠可發(fā)生自發(fā)的嚴(yán)重肝膽損傷和與PBC相似的免疫學(xué)表現(xiàn)，包括門靜脈內(nèi)CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，膽管損傷，膽管細(xì)胞氧化應(yīng)激增加，膽管周圍肝纖維化，干擾素γ和IL-12合成增加，血清IgM、IgG和肝ALP水平升高以及血清PDC-E2特異性AMA抗體陽(yáng)性。PBC免疫細(xì)胞中的AE2缺陷也可能在自體免疫現(xiàn)象中起重要作用。ae2缺陷小鼠的CD8+T細(xì)胞中，pHi堿性化，細(xì)胞增殖和激活增加，程序性細(xì)胞死亡蛋白-1表達(dá)被抑制，同時(shí)伴有細(xì)胞凋亡減少，有助于免疫介導(dǎo)的慢性膽管炎的發(fā)生。PBC時(shí)AE2表達(dá)和活性的減少，首先損害膽道碳酸氫鹽分泌，導(dǎo)致膽汁淤積和膽管細(xì)胞損傷，隨后破壞易感膽管細(xì)胞的免疫耐受并誘發(fā)對(duì)膽管細(xì)胞的自體免疫，進(jìn)一步加重膽道損傷和膽管開放。值得注意的是，至今仍未發(fā)現(xiàn)在AE2基因座的SNPs，強(qiáng)烈支持PBC時(shí)AE2的改變主要通過表觀遺傳修飾所致。

二、表觀遺傳和PBC

動(dòng)態(tài)環(huán)境變化可能主要通過表觀遺傳修飾而與患者的表型密切相關(guān)。因此，所有周圍環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化均可強(qiáng)烈改變表觀基因組，改變基因的表達(dá)。對(duì)表觀遺傳過程包括DNA甲基化譜、組蛋白變體、非編碼RNAs、翻譯后修飾等。

(一)DNA甲基化 芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在非同卵雙生子的PBC患者PBMCs中，編碼調(diào)節(jié)鈣體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞內(nèi)Cl-通道CLIC2 和促進(jìn)有絲分裂調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的肽基脯氨酰順/反式異構(gòu)酶的細(xì)小病毒家族成員PIN4 mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)。一項(xiàng)全基因組研究也證實(shí)，在PBC患者的PBMCs中，60個(gè)不同基因區(qū)域同時(shí)存在甲基化譜的變化。值得注意的是，所有這些基因區(qū)域在同時(shí)罹患疾病的雙生子中均存在超甲基化，而未罹患疾病的雙生子則沒有超甲基化，其中51個(gè)基因特異性定位于X染色體，僅9個(gè)基因在常染色體有表達(dá)。尤其是其中一些超甲基化的基因編碼與膽鹽及離子運(yùn)輸相關(guān)蛋白。

(二)組蛋白變體和翻譯后修飾 組蛋白通過翻譯后修飾以調(diào)節(jié)某些特定基因的轉(zhuǎn)錄機(jī)制。在PBC患者的T淋巴細(xì)胞中，逮捕素-1的過度表達(dá)促進(jìn)T細(xì)胞增殖，并改變與自體免疫有關(guān)的多種基因的表達(dá)，增加了在PBC患者中的CD40L、LIGHT、IL-17和IFNGH4基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白的乙?；?，而TRAIL、APO2和HDAC7A的啟動(dòng)子區(qū)域H4組蛋白乙酰化降低。

(三)微小RNAs 微小RNAs(miRNAs)是人類表觀遺傳因素中研究最多的一種。miRNA表達(dá)譜的異常和包括肝臟疾病、膽管疾病、自身免疫綜合征等很多的人類疾病有關(guān)，許多種miRNA均有差異表達(dá)。其中，對(duì)PBC患者肝臟和血PBMCs的微陣列分析發(fā)現(xiàn)，有超過200種miRNAs的差異表達(dá)。其中miR-506是PBC時(shí)膽管細(xì)胞病理生理學(xué)改變的主要參與者之一。

研究發(fā)現(xiàn)，PBC患者有35種miRNAs的失調(diào)，其中miR-506可能是AE2表達(dá)的直接調(diào)節(jié)者，在PBC患者肝臟內(nèi)表達(dá)上調(diào)，并與人特異性AE2-UTR-3’mRNA序列部分互補(bǔ)，定量PCR也證實(shí)，PBC患者肝臟內(nèi)miR-506上調(diào)。原位雜交技術(shù)則發(fā)現(xiàn)，miR-506在肝內(nèi)膽管細(xì)胞中特異性表達(dá)，直接和AE2mRNA的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，蛋白翻譯減少，非Na+依賴性Cl-/HCO3-交換活性降低，促胰液素誘導(dǎo)的頂側(cè)膜氫離子通量減少，高度提示miR-506/AE2軸在調(diào)節(jié)體內(nèi)pH穩(wěn)定和PBC時(shí)的膽道碳酸氫鹽分泌系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用。

在人膽管細(xì)胞中誘發(fā)miR-506過度表達(dá)后，與對(duì)照組細(xì)胞相比，改變了很多與線粒體能量代謝有關(guān)的蛋白，導(dǎo)致線粒體基礎(chǔ)呼吸、最大呼吸、ATP相關(guān)呼吸和非線粒體呼吸的增加，同時(shí)伴有細(xì)胞外酸化速率、糖酵解和氧化磷酸化過程的加快，質(zhì)子漏和線粒體解偶聯(lián)也和miR-506的過度表達(dá)有關(guān)，最終因?yàn)榫€粒體活性的損傷而導(dǎo)致ATP水平降低。此外，miR-506的過度表達(dá)也抑制了膽管細(xì)胞的黏附和遷移，增加細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，使膽管細(xì)胞對(duì)毒性膽汁酸凋亡作用的敏感性增加。值得注意的是，miR-506過度表達(dá)的膽管細(xì)胞也有PDC-E2蛋白的強(qiáng)烈的異常的過度表達(dá)，其表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜，提示miR-506、AMAs和自身免疫現(xiàn)象可能存在一定關(guān)系。

除了AE2, 和PBC病理發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)的另一miR-506的直接靶點(diǎn)是調(diào)節(jié)膽管細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)膜Ca2+釋放通道的肌醇1，4，5-三磷酸受體3(InsP3R3，也稱為ITPR3)。在PBC，膽管細(xì)胞表達(dá)InsP3R3減少，細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)通路和膽道碳酸氫鹽分泌受損，激活膽汁淤積。InsP3R3 mRNA含有2個(gè)高度保守的miR-506結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)節(jié)其表達(dá)。因此在miR-506過度表達(dá)的膽管細(xì)胞中，InsP3R3 mRNA水平和蛋白水平均降低，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+明顯減少，膽道分泌障礙。

(四)長(zhǎng)非編碼RNAs 長(zhǎng)非編碼RNAs(lncRNAs)是高度保守的RNA序列，含>200核苷酸，表觀遺傳性調(diào)控基因表達(dá)和很多細(xì)胞功能。在PBC患者，有38個(gè)SNPs定位在lncRNAs。此外，lncRNA AK053349在CD8+T細(xì)胞中有高表達(dá)，并和T淋巴細(xì)胞的激活及自體免疫有關(guān)。PBC患者體內(nèi)的PBMCs中的LncRNA AK053349的表達(dá)增加并與Mayo風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈正相關(guān)，強(qiáng)調(diào)其在PBC病理發(fā)生過程中的重要作用，并期待進(jìn)一步的研究。

(五)環(huán)狀RNA 環(huán)狀RNA是一種新發(fā)現(xiàn)的普遍存在的內(nèi)源性非編碼RNA(ncRNA)，作為哺乳動(dòng)物的基因調(diào)節(jié)者發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)[3]，PBC患者血清中，有18種環(huán)狀RNA(circRNA)上調(diào)，4種下調(diào)，其中hsa_circ_402458、hsa_circ_087631、hsa_circ_406329上調(diào)最為明顯，而hsa_circ_407176、hsa_circ_082319則明顯下調(diào) ，hsa_circ_ 402548在UDCA治療后的PBC患者血清中明顯下降。提示circRNA可能也參與PBC的病理發(fā)生機(jī)制，并可能是PBC的一個(gè)潛在生物標(biāo)志物。

PBC的病理發(fā)生機(jī)制比之前的設(shè)想更為復(fù)雜。遺傳易感性、環(huán)境暴露及表觀遺傳的改變共同影響疾病發(fā)生、發(fā)展，而表觀遺傳年代開啟了PBC新的研究方向，進(jìn)一步加深了對(duì)這一復(fù)雜疾病的認(rèn)識(shí)。