呂夢嬌 陳小華 臧國慶

干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞。外泌體是細(xì)胞核內(nèi)體和細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外的膜性囊泡，能攜帶蛋白質(zhì)和各種RNA到靶細(xì)胞，調(diào)控靶細(xì)胞的生物學(xué)功能。干細(xì)胞來源外泌體因在疾病的檢測、預(yù)防和治療方面的作用已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。本文就各類干細(xì)胞來源外泌體在肝臟再生方面的研究進(jìn)展作綜述。

一、外泌體的生成機(jī)制與特點(diǎn)

外泌體(exosome)最初是從體外培養(yǎng)的羊網(wǎng)織紅細(xì)胞的上清液中發(fā)現(xiàn)的[1]，由細(xì)胞核內(nèi)體萌發(fā)形成多泡體(MVB)并與細(xì)胞質(zhì)膜融合釋放到細(xì)胞外[2]，直徑30-150nm，密度1.10～1.18 g/mL的囊泡樣小體。幾乎所有類型的細(xì)胞都能分泌外泌體，并且在體液如唾液、血液、尿液、滑膜液、母乳和羊水中大量存在[3]。研究表明，外泌體含有多種蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA及各種脂類，可作為信息傳遞的載體，參與細(xì)胞通訊、遷移、血管生成、組織修復(fù)、腫瘤細(xì)胞生長、免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)等過程，成為細(xì)胞交流的一種新的方式[4-6]。對于外泌體的提取，超速離心法是經(jīng)典的方法，但耗費(fèi)時間長，研究發(fā)現(xiàn)，用抗EpCAM包被磁珠分離的免疫親和性捕獲法(IAC-Exos)是分離外泌體最有效的方法，但費(fèi)用昂貴，當(dāng)IAC-Exos使用受限時，用OptiprepTM 基于密度的分離法(DG-Exos)更有優(yōu)勢[7]。現(xiàn)在也可以使用改良Exoquick TC法，更為簡便。目前，外泌體是研究的熱點(diǎn)，作為生物標(biāo)記物、載體及其直接治療作用成為許多疾病的早期診斷、臨床治療以及預(yù)后判斷的潛在手段。

二、干細(xì)胞來源外泌體

干細(xì)胞(stem cell)是一類具有自我持續(xù)更新和多方向分化潛能的未分化細(xì)胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能。根據(jù)其所處的發(fā)育階段分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。根據(jù)其發(fā)育潛能分為：全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞和單能干細(xì)胞(專能干細(xì)胞)。干細(xì)胞因能修復(fù)組織損傷細(xì)胞、替代損傷細(xì)胞以及刺激機(jī)體自身細(xì)胞再生等功能廣泛應(yīng)用于組織修復(fù)及缺血性疾病的治療領(lǐng)域，但在體細(xì)胞誘導(dǎo)率、細(xì)胞移植培養(yǎng)條件、形成畸胎瘤的可能性等方面仍然存在許多問題。干細(xì)胞外泌體是干細(xì)胞旁分泌的脂質(zhì)囊泡，攜帶并保持干細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和mRNA的活性，可直接進(jìn)入靶細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)作用，具有更高的生物安全性和更穩(wěn)定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[8]。因此，干細(xì)胞外泌體是成為新興的研究熱點(diǎn)，將為許多疾病開啟新的治療方法。

三、干細(xì)胞來源外泌體對肝臟再生的作用

肝臟再生可以定義為代償性增生，當(dāng)肝臟損傷或切除后殘余肝組織增殖以滿足機(jī)體代謝需要。肝臟具有強(qiáng)大的再生能力，損傷的類型和程度不同，參與再生的細(xì)胞和免疫相關(guān)因子也不同，輕度損傷時由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖修復(fù)，慢性或巨大損傷致肝細(xì)胞再生功能障礙時，肝臟祖細(xì)胞被激活產(chǎn)生增生反應(yīng)修復(fù)組織[9]。肝臟再生是由先天免疫系統(tǒng)和細(xì)胞因子如TNF,IL-6等釋放激活STAT3使得肝細(xì)胞從G0期進(jìn)入G1期開始增殖,是一個由多種細(xì)胞增殖，多條信號通路和免疫相關(guān)因子參與的復(fù)雜調(diào)控過程[10]。對于肝再生，臨床上研究結(jié)果有活體肝移植和成人干細(xì)胞治療[11]。肝移植是治療肝衰竭的有效方法，但肝源緊缺，費(fèi)用昂貴，大大限制了臨床應(yīng)用。成體干細(xì)胞療法是基于細(xì)胞的治療危及生命的肝臟疾病的方法，例如間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可以減緩肝細(xì)胞的凋亡，改善肝細(xì)胞的微環(huán)境，促進(jìn)肝臟細(xì)胞的再生，因而可以用來治療急性肝衰竭。但是對于成體干細(xì)胞的分離還存在許多困難，不是所有的組織器官都能分離出干細(xì)胞，并且數(shù)量很少。干細(xì)胞外泌體含有干細(xì)胞的蛋白質(zhì)和mRNA,具有和干細(xì)胞相似的功能，且外泌體更穩(wěn)定、更易于儲存，沒有異倍體的風(fēng)險，免疫排斥的可能性更低，將會為肝臟疾病提供新的治療手段[12]。

(一) 多能干細(xì)胞來源外泌體

1. 間充質(zhì)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一類成體干細(xì)胞，具有多向分化潛能，能分化成脂肪、骨、軟骨、肌肉、肝、心肌等多種組織細(xì)胞，可作為理想的種子細(xì)胞用于組織器官的損傷修復(fù)。MSCs分化成肝細(xì)胞主要來源于骨髓、脂肪組織、臍帶血及經(jīng)血等。研究表明，把人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hucMSCs)與CCL4誘導(dǎo)的鼠急性肝衰竭損傷肝細(xì)胞間接共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)hucMSCs能通過旁分泌作用有效促進(jìn)體外肝細(xì)胞再生，而不是肝分化。并且hucMSCs能下調(diào)炎癥因子如IL-1β，TNF-α，IL-6,IL-10等的表達(dá)[13]。從而說明間充質(zhì)干細(xì)胞通過產(chǎn)生外泌體促進(jìn)組織損傷修復(fù)，成為hucMSC-Exos治療疾病的理論基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，hucMSCs-Exos可以有效地緩解CCL4誘導(dǎo)的肝衰竭，并且通過傳遞GPX1到靶細(xì)胞，GPX1能解毒CCL4和H2O2，減少氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)肝氧化損傷的恢復(fù)[14]。在對乙酰氨基酚(APAP)或過氧化氫(H2O2)藥物性肝損傷模型中，MSCs-Exos可以通過上調(diào)初始基因使增殖蛋白(PCNA,cyclinD1)表達(dá)增加和促進(jìn)抗凋亡基因Bcl-xl表達(dá)抑制APAP，H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡來激活肝細(xì)胞增殖和再生反應(yīng)，對損傷肝細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用并促進(jìn)肝再生[15]。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MenSCs)分泌的外泌體在D-GaIN/LPS誘導(dǎo)的爆發(fā)型肝衰竭中能減少肝臟單核細(xì)胞以及受損傷肝細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白Caspase-3的數(shù)量，從而緩解肝衰竭[16]。大量研究表明，在CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化模型中，hucMSC-Exos可通過滅活TGF-β1及減少Smad2磷酸化來抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，減少膠原沉積，保護(hù)肝細(xì)胞，改善肝纖維化[17]。

2.誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSCs)被認(rèn)為具有最高的再生分化潛能，是通過將外源基因?qū)塍w細(xì)胞使之去分化為多能干細(xì)胞。目前的臨床研究顯示iPSCs成為MSCs的一個有吸引力的來源，iPSCs被誘導(dǎo)分化MSCs的重編程過程使得細(xì)胞表現(xiàn)出更好的生存、增殖和分化潛能,因此hiPSC-MSCs將作為一種新型的干細(xì)胞群在再生領(lǐng)域中發(fā)揮作用[18]。研究發(fā)現(xiàn)，肌內(nèi)注射hiPSC-MSCs-Exo于下肢缺血小鼠能增強(qiáng)缺血肢體微血管密度和血流灌注，能激活血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，促進(jìn)血管生成，從而為缺血性疾病的治療提供新的方法[19]。在肝缺血再灌注70%熱肝I/R損傷模型中，將hiPSC-MSCs-Exo注入下腔靜脈，評估療效，發(fā)現(xiàn)hiPSC-MSCs-Exo可抑制肝壞死、減輕炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡和抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕缺血再灌注所致的肝組織損傷[20]。之后在大鼠70%肝切除術(shù)模型中，也表明了hiPSC-MSCs-Exo能減輕肝組織損傷，促進(jìn)殘余肝再生并改善肝功能[21]。因此hiPSC-MSCs-Exo將有望成為治療肝缺血再灌注損傷的新手段。

(二)肝干細(xì)胞來源外泌體

肝干細(xì)胞是存在肝臟內(nèi)的具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，肝干細(xì)胞能表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD29,CD73,CD44,CD90,而不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物體CD34,CD45等，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，HLSCs能促進(jìn)嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠肝實(shí)質(zhì)的再生[22]。HLSCs的特征和功能為人肝干細(xì)胞來源的外泌體(HLSC-Exos)在肝再生中的作用奠定了基礎(chǔ)。在70%肝切除大鼠模型中，HLSC-Exos移植能誘導(dǎo)肝細(xì)胞增殖，抑制凋亡，且發(fā)現(xiàn)肝切除大鼠肝中人類AGO2mRNA和denovo蛋白表達(dá)，而用RNase處理則效果消失，表明HLSC-Exos將特定mRNA分子水平傳遞給大鼠肝細(xì)胞來促進(jìn)肝切除大鼠肝再生[23]。從而表明肝干細(xì)胞來源外泌體也能促進(jìn)肝再生,但具體的機(jī)制以及起作用的相關(guān)因子還需要進(jìn)一步研究。

四、干細(xì)胞來源外泌體在肝臟再生中的應(yīng)用

干細(xì)胞來源外泌體將是肝臟再生領(lǐng)域一種新的治療策略，大量研究表明，干細(xì)胞來源外泌體能夠通過抑制炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡，減少膠原沉積，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖來保護(hù)肝組織和促進(jìn)肝臟再生，初步驗(yàn)證了其治療的有效性和安全性，但還存在一些挑戰(zhàn)，如從干細(xì)胞中提取的外泌體量非常少，如何大量提取？對于將mRNA和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞中起主要作用的是哪種成分？以及參加肝臟再生的其他機(jī)制等等。但相信隨著技術(shù)研究的發(fā)展，干細(xì)胞外泌體將會為肝再生帶來福音。