賈真 劉艷彥

摘要：目的? 觀察附子、甘草不同配伍比例對附子毒性的影響，探索甘草與附子配伍減毒的最佳比例。方法 ?使用均勻設(shè)計表確定附子、甘草的配伍比例;以小鼠死亡率為指標進行附子、甘草不同配伍比例急性毒性評價;多元線性回歸分析得到多元函數(shù)模型，針對函數(shù)模型求偏導(dǎo)數(shù)，得到附子、甘草最佳配比;比較附子及最佳配比附子、甘草的急性毒性，驗證其減毒效果。結(jié)果? 隨著甘草劑量增加，小鼠死亡率整體呈下降趨勢。針對多元回歸分析得到的多元函數(shù)模型求偏導(dǎo)數(shù)得附子、甘草最佳配比為0.42∶1。附子半數(shù)致死劑量為30.9 g/kg，附子、甘草最佳配比最大耐受量為100 g/kg，小鼠死亡率為20%，附子毒性明顯減小。結(jié)論? 附子、甘草配伍比例對附子毒性有一定影響，從整體趨勢來看，隨著甘草劑量的增加，附子的毒性逐漸越小。

關(guān)鍵詞：附子;甘草;配伍;均勻設(shè)計法;小鼠

中圖分類號：R284.1;R285.5 ???文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）02-0069-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.015

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Abstract： Objective To observe the effects of different compatibility ratios of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma on toxicity of Aconiti Lateralis Radix Praeparata; To explore the best compatibility ratio of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma. Methods The compatibility ratios of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma were confirmed with uniform design method. Based on the mortality rate of mice， the acute toxicity of different compatibility ratios of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma was evaluated; Multiple linear regression analysis was used to obtain multivariate function model. Partial derivative for function model was used to obtain the best compatibility of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma; acute toxicity of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and best compatibility of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma were compared， and its attenuation was verified. Results With the increase of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma dosage， the mortality rate of mice was decreasing as a whole. The best ratio of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma obtained through partial derivative of multiple function model was 0.42：1. The lethal dosage of half Aconiti Lateralis Radix Praeparata was 30.9 g/kg. The maximal tolerable dose of best compatibility of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma was 100 g/kg. The mortality rate of mice was 20%. The toxicity of Aconiti Lateralis Radix Praeparata decreased significantly. Conclusion The compatibility of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma has certain effects on the toxicity of Aconiti Lateralis Radix Praeparata. From the overall trend， as the dosage of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma increases， the toxicity of Aconiti Lateralis Radix Praeparata is smaller.

Keywords： Aconiti Lateralis Radix Praeparata; Glycyrrhizae Radix et Rhizoma; compatibility; uniform design; mice

附子為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品，有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛功效^[1]，是中醫(yī)治療急癥重癥的代表藥。但附子有大毒^[2]，通過炮制、久煎等方法可降低其毒性。現(xiàn)代藥理研究表明，附子化學成分中烏頭類生物堿是附子產(chǎn)生毒性作用的主要成分，同時也是發(fā)揮藥效的主要成分，炮制和久煎都會不同程度損失附子有效成分^[3-6]，從而影響療效。通過查閱古今文獻，我們發(fā)現(xiàn)附子常與甘草配伍使用，且甘草可使附子減毒存效。近年來，附子、甘草配伍的作用機制也成為研究熱點，包括對附子配伍甘草前后的化學成分、毒性、藥效、相態(tài)、代謝等研究^[7-15]，但關(guān)于附子、甘草配伍的作用機制仍未有定論。研究顯示，附子、甘草不同配伍比例對藥效有一定影響，從而推斷附子、甘草配伍的作用機制與用藥劑量和二藥配伍比例有關(guān)。關(guān)于附子、甘草配伍比例對附子毒性影響的研究表明，隨著甘草比例的增加，附子的毒性越來越低^[9，14]，但這些研究的配伍比例都是根據(jù)歷代醫(yī)家經(jīng)驗設(shè)計。均勻設(shè)計是基于試驗點在整個試驗范圍內(nèi)均勻散布、從均勻性角度出發(fā)的一種試驗設(shè)計方法，該方法試驗次數(shù)少且均有代表性，因素的水平可多設(shè)，且實驗結(jié)果可用計算機處理，在尋找最佳實驗條件、最佳配比等方面是選擇優(yōu)化條件的有力工具^[16]。在中藥方面的應(yīng)用包括藥理研究和優(yōu)化中藥的提取工藝、制劑的成型工藝、組方配伍等^[17]。如王英豪等^[18]采用均勻設(shè)計法得出鉤吻和玉葉金花的最低毒性配伍比例。因此，本研究結(jié)合臨床用藥經(jīng)驗，以及附子、甘草的急性毒性評價結(jié)果，確定附子和甘草的劑量范圍，使用均勻設(shè)計表確定附子、甘草不同配伍比例，以小鼠灌服藥液后的死亡率為指標，觀察附子、甘草不同配伍比例對附子毒性的影響，并采用多元線性回歸分析探索附子與甘草的最佳配比。

1? 儀器、試藥和動物

FA2204B電子天平（上海精科天美科學儀器有限公司），RV10 basic 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKAIKA公司），DLSB-5L/10低溫循環(huán)冷卻泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）。白附片（廣州市藥材公司中藥飲片廠，批號YPA7H0001），甘草（廣州至信中藥飲片有限公司，批號17080），甲醇（色譜純，廣州飛恩新材料科技有限公司），三乙胺（分析純），水為蒸餾水。

ICR小鼠210只，SPF級，18～22 g，雌雄各半，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物許可證號SCXK（粵）2013-0034。飼養(yǎng)于清潔級動物房，室溫20 ℃，自由攝食飲水，隔日換墊料。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 干浸膏制備

取藥物飲片適量，置于圓底燒瓶中，加入10倍量水，浸泡30 min，加熱回流提取2次合并。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（水浴鍋溫度為70 ℃）濃縮至一定程度，轉(zhuǎn)至蒸發(fā)皿，水?。?0 ℃）加熱蒸干，得干浸膏，稱重，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2? 附子、甘草急性毒性評價

2.2.1? 附子半數(shù)致死劑量測定

2.2.1.1? 預(yù)試驗

ICR小鼠16只，雌雄各半，隨機分為4組，每組4只，按0.4 mL/10 g體質(zhì)量計算灌胃體積。附子干浸膏加水溶解至所需濃度，各組按設(shè)定的劑量分別灌胃給藥，給藥后立刻觀察小鼠出現(xiàn)的毒性反應(yīng)并記錄死亡數(shù)，找出引起0%死亡率和100%死亡率劑量的所在范圍。預(yù)試驗結(jié)果表明，附子組無死亡劑量為10 g/kg，全致死劑量為80 g/kg。

2.2.1.2? 正式試驗

ICR小鼠36只，雌雄各半，適應(yīng)性觀察3 d。實驗前禁食不禁水16 h，隨機分為6組，每組6只，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果確定各組給藥劑量，組間距為0.6。按0.4 mL/10 g體質(zhì)量計算灌胃體積。附子干浸膏加水溶解至所需濃度，各組按設(shè)定的劑量分別灌胃給藥，給藥后立刻開始觀察小鼠神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)的毒性反應(yīng)，記錄中毒潛伏期、開始出現(xiàn)死亡的時間、各組小鼠死亡數(shù)等，及時解剖死亡小鼠，記錄觀察到的變化。繪制小鼠死亡曲線，采用Bliss法計算半數(shù)致死劑量（LD₅₀）。

2.2.1.3? 小鼠中毒癥狀及附子半數(shù)致死劑量測定結(jié)果

小鼠給藥后出現(xiàn)身體顫抖、惡心干嘔、行動遲緩的癥狀，繼而精神萎靡、怠動、俯臥不動。死亡前全身顫抖、怠動無力、呼吸急促，部分小鼠出現(xiàn)驚厥。動物死亡多發(fā)生在給藥后0～4 h內(nèi)，對死亡動物進行解剖，發(fā)現(xiàn)肝臟邊緣發(fā)黃或發(fā)黑，部分小鼠脾臟或者心臟略有發(fā)黑。給藥24 h后無小鼠死亡，小鼠逐漸恢復(fù)正常狀態(tài)。不同劑量引起小鼠死亡數(shù)見表1，附子LD₅₀為30.9 g/kg，95%置信區(qū)間為21.4～45.1 g/kg。

2.2.2? 甘草最大耐受量測定

2.2.2.1? 預(yù)試驗

ICR小鼠10只，雌雄各半，按0.4 mL/10 g體質(zhì)量計算灌胃體積。以最大濃度0.75 g/mL甘草灌胃1次，觀察7 d，無死亡出現(xiàn)。

2.2.2.2? 正式試驗

ICR小鼠40只，雌雄各半，隨機分為對照組和給藥組，每組20只，計算灌胃體積，給藥組1 d內(nèi)給予最大給藥量（0.75 g/mL×0.4 mL/10 g），對照組給予等體積水，灌胃3次。觀察7 d，測定最大耐受量（MTD）。小鼠給藥后未出現(xiàn)異常活動，解剖結(jié)果也未見異常情況。實驗結(jié)果顯示，甘草MTD為90 g/kg。

2.3? 附子、甘草配伍比例確定

2.3.1? 附子、甘草給藥劑量確定

按急性毒性評價結(jié)果，附子給藥量最小值為LD₅₀，最大值為2×LD₅₀;甘草給藥量最小值為臨床用藥的低劑量，最大值為MTD。最終確定附子給藥劑量為30～60 g/kg，甘草給藥劑量為1～90 g/kg。

2.3.2? 因素與水平的確定

根據(jù)均勻設(shè)計U7*（7⁴）表，將附子、甘草給藥劑量分別作為考察因素1、因素2，每個因素分別取7個水平，附子與甘草劑量見表2，劑量配比見表3。

2.4? 不同配伍比例附子、甘草毒性評價

2.4.1? 不同配伍比例附子、甘草水煎液毒性測定

ICR小鼠70只，雌雄各半，適應(yīng)性觀察3 d。實驗前禁食不禁水16 h，隨機分為7組，每組10只。各組小鼠灌胃給藥2次，按試驗方案將配制藥液全部灌完。給藥后立刻開始觀察小鼠神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)的毒性反應(yīng)，中毒癥狀發(fā)生的時間、持續(xù)時間、恢復(fù)情況，對死亡小鼠及時進行大體解剖觀察，記錄所觀察到的變化，統(tǒng)計各組小鼠死亡數(shù)并比較各組死亡率。7 d后將全部小鼠處死并解剖觀察，記錄所觀察到的變化。

2.4.2? 附子、甘草不同配伍比例毒性試驗結(jié)果

小鼠死亡多發(fā)生在給藥后0～12 h內(nèi)，解剖發(fā)現(xiàn)肝臟邊緣發(fā)黃或發(fā)黑，部分小鼠脾臟或心臟略有發(fā)黑。給藥24 h后，無小鼠死亡，小鼠逐漸恢復(fù)正常狀態(tài)。附子、甘草不同配伍比例毒性試驗結(jié)果見表4，附子、甘草不同配伍比例各組小鼠死亡曲線。結(jié)果顯示，附子配伍甘草后對小鼠的毒性降低。

2.5? 附子、甘草不同配伍比例小鼠死亡率分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對均勻試驗結(jié)果進行多元線性回歸分析，建立多元函數(shù)及F檢驗。得多元函數(shù)模型Y=70.576-1.635F-1.455G+0.032F²+0.012G²（Y表示死亡率，F(xiàn)表示附子，G表示甘草），應(yīng)用相關(guān)系數(shù)R評價函數(shù)模型，R=0.985，R²=0.97，調(diào)整R²為0.91。該回歸方程經(jīng)F檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.059），見表5。針對函數(shù)模型求偏導(dǎo)數(shù)，求得最佳配比為附子∶甘草為0.42∶1。

2.6? 附子、甘草最佳配伍比例減毒效果評價

2.6.1? 預(yù)試驗

ICR小鼠16只，雌雄各半，按0.4 mL/10 g體質(zhì)量計算灌胃體積。各組按設(shè)定的劑量分別灌胃給藥，找出引起0%死亡率和100%死亡率劑量所在范圍。預(yù)試驗結(jié)果表明，附子、甘草最佳配比為0.42∶1，受給藥體積和給藥濃度限制，無法測出LD₅₀，但小鼠給藥后出現(xiàn)毒性反應(yīng)，故改測MTD。

2.6.2? 正式試驗

ICR小鼠22只，雌雄各半，適應(yīng)性觀察3 d。實驗前禁食不禁水16 h，隨機分為2組，對照組7只，給藥組15只，按0.4 mL/10 g體質(zhì)量計算灌胃體積。對照組灌胃給水2次，給藥組按附子、甘草最佳配比組灌胃給藥2次，給藥間隔時間均為6 h。給藥后立刻開始觀察小鼠神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)的毒性反應(yīng)，記錄中毒潛伏期、開始出現(xiàn)死亡的時間、死亡只數(shù)等，及時解剖死亡小鼠，記錄觀察到的變化。14 d后，全部小鼠進行解剖，記錄觀察到的變化。

2.6.3? 附子、甘草最佳配比最大耐受量測定結(jié)果

小鼠給藥后出現(xiàn)身體顫抖、惡心干嘔、行動遲緩的癥狀，繼而精神萎靡、怠動、俯臥不動。小鼠死亡前全身顫抖、怠動無力、呼吸急促。動物死亡發(fā)生在第2次給藥4 h后，解剖發(fā)現(xiàn)肝臟邊緣發(fā)黃或發(fā)黑，部分小鼠脾臟或心臟略有發(fā)黑。小鼠第2次給藥24 h后漸漸恢復(fù)正常。14 d后將所有小鼠處死，解剖，發(fā)現(xiàn)部分小鼠胸腔內(nèi)有瘀血，肝臟、腎臟顏色均較淺。給藥組小鼠死亡3只，死亡率為20%。通過計算，得到小鼠日MTD為100 g/kg，MTD倍數(shù)相當于體質(zhì)量60 kg成人臨床每日劑量的133.33倍。

3? 討論

附子作為回陽救逆第一要藥，在中醫(yī)臨床急危重癥的救治中具有非常重要的地位，尤其隨著近年“扶陽學派”興起，附子在臨床廣泛而大量使用，其劑量的選擇常超出藥典規(guī)定劑量，如何在保持附子藥效的同時減少其對機體的毒副作用成為亟待解決的問題。配伍甘草為附子減毒方法之一，關(guān)于配伍比例研究在文獻中常見的有附子、甘草為1∶1的比例，有部分文獻探討了配伍比例對附子毒性的影響，但僅局限于1∶2、1∶1、2∶1不同比例，而藥物比例對復(fù)方或藥對的藥效或毒性的影響作用十分重要。本研究中不同配伍比例的附子、甘草毒性評價結(jié)果表明，附子與甘草配伍后，小鼠死亡率降低，且隨著甘草配伍比例增加，小鼠死亡率呈現(xiàn)“降升交替”的現(xiàn)象，但整體趨勢是下降的。本實驗采用均勻設(shè)計法對附子、甘草配伍比例對附子毒性進行了優(yōu)化研究，結(jié)果0.42∶1附子與甘草配比為最佳比例;附子與甘草按照0.42∶1配伍使用后，附子毒性大大降低，MTD是附子LD₅₀3倍多，且小鼠死亡率低，說明該配比減毒效果好。

本研究發(fā)現(xiàn)，附子配伍甘草后小鼠的死亡時間推后，附子單用時，小鼠死亡多集中在給藥后4 h內(nèi)，而配伍甘草后小鼠死亡時間多集中在給藥后4～12 h內(nèi)，說明甘草可緩附子之性急和性毒，符合章津銘^[19]從“藥理-化學-藥代”相結(jié)合層面，初步揭示附子配伍甘草“毒減而效不減”作用機制——基于兩者煎煮過程，甘草成分與附子毒（效）成分形成復(fù)合物而逐漸沉積于湯液底部，在湯液溫服條件下游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的毒（效）成分均進入機體，結(jié)合態(tài)成分在胃腸道中緩慢釋放，從而實現(xiàn)毒（效）組分的不同步吸收，“緩吸收之急而解其毒，延吸收之時而增其效”。中毒死亡小鼠解剖結(jié)果顯示，附子對肝臟、心臟、脾臟具有毒性，尤其肝臟。肝臟是體內(nèi)重要的代謝器官，含有大部分代謝酶，其中CYP3A4為烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的主要代謝酶。有研究表明，附子水煎液對大鼠CYP3A4有誘導(dǎo)作用，從而使CYP3A4被酶解，影響肝臟代謝^[20]，這也可以解釋中毒死亡的小鼠為何肝臟邊緣發(fā)黃發(fā)黑。

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